ELISA
Um dos métodos imunológicos desenvolvidos para
quantificar antígenos e anticorpos, apresenta grande
sensibilidade e especificidade, tornou-se uma das
técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações
clínicas mais utilizadas.
ELISA
uma enzima que está ligada ao Ac que formou um
imunocomplexo com seu respectivo Ag, reage com um
substrato incolor para produzir um produto colorido.
Se o Ag estiver presente, o complexo anticorpo-enzima irá
ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação.
A presença de produto colorido indica que o Ac encontrou
e se ligou ao Ag.
É um método eficiente pois permite detectar quantidades
de proteína da ordem de nanogramas (10-9 g).
ELISA
O ELISA constitui a base do teste para infecção por
HIV e diversos outros diagnósticos por sorologia.
Nesse teste, proteínas virais (Ag) são adsorvidas aos
“poços” (wells) da placa de ELISA.
Em seguida, é adicionado soro do paciente, que se
contiver Ac, estes se ligarão aos Ag.
Finalmente, Ac marcados com uma enzima ligam-se
aos Ac humanos (complexo Ag-Ac), propiciando a
reação enzimática com mudança de cor.
ELISA
Indireto
ELISA
http://www.positivehealth.com/permit/Articles/Colon%20Health/abrah
am62.htm
http://www.callisto.si.usherb.ca:8080/iml302/images/elisa3.j
pg
ELISA
Sanduíche
O Ac contra um Ag particular é adsorvido no well.
Depois, o Ag (soro, urina ou outra amostra) é
adicionado e se liga ao anticorpo.
Finalmente, um segundo e diferente Ac ligado à
enzima é adicionado.
Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional à
quantidade de Ag presente. Logo, permite
mensurar até pequenas quantidades de antígeno.
ELISA
Sanduíche
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman and Company,
2000), p. 162.]
ELISA
EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:
PLACA DE ELISA (material permite adsorção do
Ag ou Ac e tem fundo chato, podem ter tiras
removíveis).
ELISA
Micropipetas (comuns ou multicanal)
http://www.jaelsa.com/imagenes/pipeta1.j
pg
http://pandora.labgeminis.com:8909/imag
es/8x200_ul.jpg
ELISA
Lavador de placas:
ELISA
Leitor de Elisa (espectrofotometro p/ placas)
Leitor de tiras ELISA
http://www.rclcomercial.com.br/drake/i004.jp
g
ELISA
PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:
Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o
primeiro Ac com concentração conhecida e suficiente para
adsorver nos “poços” (“wells”) da placa.
Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a
retirar o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.
Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular,
como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de
bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na
placa (sítios inespecíficos).
Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃO
da placa está cumprida.
ELISA
Incubação com as amostras (soluções teste com Ag em
concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa)
Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo
previamente aderido à placa também permanecerá aderido.
Por outro lado, os antígenos não ligados serão removidos.
Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem.
Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a
uma enzima, como a peroxidase. Segue-se outra lavagem.
ELISA
Adição de substrato para revelação. É um substrato incolor
que, quando ativado pela enzima ligada ao sistema Ac-Ag,
produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser
lida diretamente em aparelho apropriado.
Em geral, bloqueia-se a reação para evitar que o produto final
fique muito escuro e atrapalhe a leitura do teste. Além de
bloquear a reação, é possível adicionar um ácido que
provoque mudança para uma cor cuja absorbância é melhor
detectada pelo leitor de ELISA.
1O
ANTICORPO
ANTÍGENO DA
AMOSTRA
2O ANTICORPO
ANTICORPO
LIGADO
MUDANÇA DE
COR
ELISA
Leitura placa
http://www.netria.co.uk/images/elisa2.
jpg
ELISA - Curva padrão
CURVA PADRÃO, preenchendo 8 “poços” de uma fileira
com concentrações crescentes e conhecidas de
antígeno. A curva serve como padrão de comparação
para deduzir as quantidades de antígenos nas soluçõestestes. O gráfico é fornecido por um programa próprio
para a leitura de ELISA.
EXEMPLO DE CURVA PADRÃO
ELISA - Controles
Um outro controle feito é o TESTE BRANCO, que consiste na adição
somente do tampão com o objetivo de avaliar se houve contaminação
durante o experimento.
O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATA, servindo de
controle para os erros de manuseio. A média dos resultados deve ser
avaliada e se houver diferença significativa, o experimento deve ser
repetido.
PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for sangue, deve-se
centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir e analisar.
Células em cultura devem ser trituradas, o tampão deve ter pH
adequado, substância detergente (para lisar a membrana) e inibidores
de proteases. Depois, centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para
análise.
Hemaglutinação Indireta - HAI
ex: Diagnóstico de Chagas
A doença de Chagas é causada por um protozoário o
Trypanosoma cruzi, e transmitida ao homem por um inseto,
o triatomíneo. Imunologicamente, 3 estágios podem ser
considerados: agudo, latente ou indeterminado e crônico.
Na fase intermediária ou latente não há sintomas, as
informações prestadas pelo laboratório clínico tornam-se
decisivas no diagnóstico etiológico.
Reação de hemaglutinação indireta (HAI)
Princípio do método:
Eritrócitos de aves sensibilizados com componentes
antigênicos do T. cruzi, altamente purificados, mostram
aglutinação quando reagem com Ac contra esses antígenos
presentes no soro do paciente.
HEMAGLUTINAÇÃO
Procedimento
Pipetar 50 microlitros do soro controle positivo, negativo e de cada
amostra nas respectivas cavidades da placa.
Adicionar 25 microlitros da suspensão homogênea de hemácias em
cada cavidade.
Agitar a placa por vibração mecânica (agitador de placas) ou batendo,
com os dedos, nas bordas da placa por 3 a 4 minutos.
Deixar em repouso por 1 a 2 horas em temperatura ambiente,em local
livre de vibrações (IMPORTANTE).
Fazer leitura.
HEMAGLUTINAÇÃO EM Placa
LEITURA
NEGATIVO: quando as hemácias se depositam no
fundo da cavidade formando um botão.
POSITIVO: quando as hemácias se depositam no
fundo da cavidade como um tapete, as vezes
com bordas irregulares.
Os soros que mostram reação positiva no teste
qualitativo devem ser titulados.