EXPRESSÃO DE GENES
BIOMARCADORES EM OSTRAS
Crassostrea gigas EM RELAÇÃO
AO SEXO.
Bruna.H. de Oliveira
Acadêmica de Naturologia Aplicada
Bolsista PIBIC/CNPq
Prof. Igor Dias Medeiros, Dr.
Orientador
Introdução
A contaminação dos ecossistemas pode
afetar os organismos expostos causando
alterações, que normalmente iniciam ao nível
molecular e se estendem ao organismo como um
todo, podendo refletir na estrutura das populações
e comunidades (Pina et al, 2007).
As alterações decorrentes da exposição à
contaminação pode ser utilizada para monitorar a
exposição e efeitos destes compostos sobre os
organismos, sendo denominada biomarcador de
contaminação (Medeiros et al, 2008).
Introdução
A análise com biomarcadores permite avaliar além
da presença dos contaminantes os efeitos dos
mesmos,
indicando
biodisponibilidade
do
composto em questão (Hugget et al, 1992).
Vários parâmetros podem ser utilizados na análise
dos biomarcadores de contaminação, entretanto a
expressão gênica é uma das primeiras alterações
detectáveis, contribuindo para uma avaliação
precoce da situação (Finne et al, 2007).
Introdução
A exposição prévia de ostras a esgoto doméstico
não tratado permitiu a identificação de alguns
genes cuja expressão foi induzida na presença
deste contaminante (Medeiros et al, 2008).
Entre estes estão o gene da proteína ligante de
ácidos graxos (FABP), citocromo P450 isoforma
356A1 (CYP356A1) e glutationa S-transferase
classe ômega (GSTO) e proteína de resistência à
múltiplos xenobióticos (MXR).
Introdução:
FABP é responsável pela ligação e transporte de
ácidos graxos entre os compartimentos celulares,
podendo transportar também outros compostos
lipofílicos como alguns contaminantes (Velkov et
al, 2005).
O citocromo P450 corresponde a uma família de
proteínas de biotransformação de fase I,
responsável
por
transformar
substâncias
lipossolúveis em hidrossóluveis, facilitando assim
sua excreção (Livingstone, 1998).
Introdução:
As GSTs são enzimas de biotransformação de
fase II que conjugam os xenobióticos com o
tripeptídeo
glutationa,
aumentando
sua
hidrosolubilidade e facilitando sua excreção
(Sheehan , 1998). A classe ômega parece estar
associada à defesas antioxidantes (Board et al,
2000).
MXR é uma proteína de membrana que transporta
para fora da célula contaminantes de diferentes
classes, inclusive moléculas transformadas pelas
proteínas de faseI e II (Bard, 2000).
Objetivo
Este trabalho teve por objetivo investigar se existe
diferença entre os sexos na expressão dos genes
FABP, CYP356A1, GSTO e MXR, normalizados
pelo gene da actina (ACT), em ostras Crassostrea
gigas.
Metodologia:
Coleta: foram coletadas
20 ostras
Crassostrea gigas (7 – 10cm) além de
amostras de água para avaliação da
qualidade
no
Cultivo
comercial
“Mexilhostras”, localizado na Ponte do
Imaruím, Palhoça, SC;
Transferência
das
ostras
para
o
laboratório e das amostras de água para
o Laboratório de Engenharia Ambiental da
UNISUL;
Morte das ostras por rompimento do
músculo adutor; Dissecção das brânquias
para homogeneização com o reagente
Trizol para extração do RNA total; cada
duas ostras do mesmo sexo compuseram
uma amostra.
Metodologia:
Identificação do sexo por microscopia das
gônodas;
Quantificação e avaliação da integridade
do RNA por espectrofotômetro a 260nm e
pela razão 260/280;
Síntese do cDNA a partir de 2ug de RNA
total com a enzima Omniscripti (Qiagen) e
quantificação como descrito acima;
PCR com primers específicos para os
genes FABP, CYP356A1, GSTO, MXR e
ACT;
Metodologia:
Condições da reação de PCR:
1,2 µg de cDNA;
2 mM MgCl2;
10 mM de cada dNTP;
Taq Biotools 1U;
10 µM iniciadores sense e antisense;
tampão de PCR 1X;
Volume da reação 20uL.
Metodologia:
Eletroforese em gel de agarose
1,2% TAE 1X e corado com
brometo de etídio para
observação em luz UV;
Densitometria das bandas
através do software E-Capt;
Análise estatística com teste t
de Student (p<0,05).
Resultados:
A água do local de coleta apresentou
salinidade 21,8; pH 8,03; oxigênio
dissolvido 8,3 (mg/L) e turbidez de 15,56
NTV.
Resultados:
Tabela 1: peso da s brânquias (mg); concentração de RNA total (ug/uL)
e razão entre a absorbância a 260 e 280nm das amostras de ostras
macho e fêmea (n=5).
Machos
Peso
Brânquia
(mg)
RNA
(ug/uL)
260/
280
Fêmeas
Peso
Brânquia
(mg)
RNA
(ug/uL)
260/
280
A
234
235
222
225
250
2,55
5,59
4,82
5,32
5,05
2,03
1,88
1,94
1,88
1,93
F
260
300
214
211
291
6,52
7,06
5,01
5,00
5,51
1,79
1,64
1,94
1,97
1,90
B
C
D
E
G
H
I
J
Resultados:
Tabela 2: concentração de cDNA (ug/uL) e razão entre a absorbância
a 260 e 280nm das amostras de ostras macho e fêmea (n=5).
Machos
cDNA
(ug/uL)
260/280
Fêmeas
cDNA
(ug/uL)
260/280
A
1,02
1,31
1,31
1,29
1,36
1,73
1,79
1,77
1,78
1,77
F
1,36
1,42
1,28
1,31
1,26
1,79
1,78
1,77
1,79
1,79
B
C
D
E
G
H
I
J
Resultados
ACT
FABP
CYP356A1
MXR
GSTO
Figura 1: expressão dos genes FABP; CYP356A1; GSTO e MDR,
normalizados pela actina em brânquias de ostras Crassostrea gigas
machos e fêmeas (n=5).
Conclusões
Não
foram
observadas
diferenças
estatisticamente significativas na expressão dos
genes investigados em relação ao sexo das
ostras, embora as fêmeas apresentem uma
expressão de GSTO um pouco maior;
A partir desse resultado pode-se afirmar que
análises da expressão destes genes em
programas de biomonitoramento da contaminação
podem ser realizadas sem prévia identificação do
sexo dos organismos.
Referências Bibliográficas
BARD, S.M. Multixenobiotic resistance as a cellular defense mechanism in
aquatic organisms. Aquatic Toxicology. 48, 357-389. 2000.
BOARD, F.G.; COGGAN, M.; CHELVANAYAGAM, G.; EASTEAL, S.;
JERMIIN, L.S.; SCHULTE, G.K.; DANLEY, D.E.; HOTH, L.R.; GRIFFOR,
M.C.; KAMATH, A.V.; ROSNER, M.H.; CHRUNYK, B.A.; PERREGAUX,
D.E.; GABEL, C.A.; GEOGHEGAN, C.A. & PANDIT, J. Identification,
characterization and crystal structure of the omega class glutathione
transferases. The Journal of Biological Biochemistry, v.275, n.32,
24798-24806. 2000.
FINNE, E.F.; COOPER, G.A.; KOOP, B.F.; HYLLAND, K. & TOLLEFSEN,
K.E.Toxicogenomic responses in rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss)hepatocytes exposed to model chemicals and a synthetic mixture.
Aquatic Toxicology. 81, 293-303. 2007.
HUGGET, R.; KIMERIE, R.A.; MEHRIE, Jr., P.M. & BERGMAN,
H.L.Biomarkers: biochemical, physiological and histological markers
of anthropogenic stress. Boca Raton, Lewis Publish. 347p. 1992.
Referências Bibliográficas
LIVINGSTONE, D.R. The fate of organic xenobiotics in aquatic
ecosystems:quantitative and qualitative differences in biotransformation by
75 invertebrates and fish. Comparative Biochemistry and Physiology
Part A. 120, 43-49. 1998.
PINÃ, B.; CASADO, M. & QUIRÓS, L. Analysis of gene expression as a
newtool in ecotoxicology and environmental monitoring. Trends in
AnalyticalChemistry. Vol. 26, No. 11. 2007.
VELKOV, T.; CHUANG, S.; PRANKERD, R.; SAKELLARIS, H.; PORTER,
C.J.H. & SCANLON, M.J. An improved method for the puriWcation of rat
liver-type fatty acid binding protein from Escherichia coli. Protein
Expression and Purification. 44, 23–31. 2005.
Agradecimentos
Laboratório de Engenharia Ambiental
– UNISUL;
Cultivo de Moluscos Mexilhostras;
CNPq.
OBRIGADO!