Expressão Gênica
Marcílio C. P. de Souto
DIMAp/UFRN
Expressão Gênica



Todas as células em um organismo têm o mesmo
DNA genômico
Identidades celulares distintas ocorrem por causa
de diferenças na expressão gênica (=transcrição &
tradução)
A transcrição ou não de um gene é, em geral,
determinada pela presença/ausência de outros
produtos dos genes (especialmente proteínas)
Expressão Gênica

... então os genes interagem em redes complexas:


Gene A ativa gene B, que desliga gene C que aumenta
(upregulates) A, ...
Assim, perturbações em um único gene podem
levar a mudanças na expressão de vários genes
Para que estudar Expressão Gênica ?


As células e tecidos tem suas funções normais
quando os genes são expressos de forma
regulada
A expressão alterada de um gene altera a
homeostase do organismo, podendo gerar uma
doença
Genômica Funcional

O próximo passo após o sequenciamento:


Passo complexo


Proteínas e genes interagem em redes altamente
conectadas
Tradicionalmente a biologia molecular vem
trabalhando baseada no paradigma


Entendimento da conexão entre seqüências de DNA e
características fenotípicas do organismo
Um gene, uma função
No entanto,...
Microarrays



... microarray podem medir a expressão de vários genes
ao mesmo tempo
Microarrays são em geral lâminas de vidro com uma matriz
de pontos (spots) impressa sobre elas
Um spot contém milhões de moléculas de DNA idênticas
ou oligonucleotídeos (sondas)


As sondas se ligarão a seqüências específicas de DNA, tais como
cDNA de um gene
O microarray pode conter milhares de spots

Por exemplo, um spot para cada gene do genoma humano
Experimentos com Microarrays

Quase todo mRNA



mRNA da célula ~ genes expressos
cDNA
Utiliza-se cDNA, que é mais estável
Rotule cDNA das células de referência de verde
(Cy3) e das células alvo (teste) de vermelho (Cy5)


proteína
Triture células e extraia o mRNA
Faça a transcrição reversa RNA


traduzido
P. Ex.: Cy3=Célula Normal Cy5=Célula Cancerosa
Hibridize ambas as amostras, células referência e
alvo, em um único microarray
Fabricação do Array (1/4)
Seleção das sondas (cDNA) a serem impressas no array
Três dos milhares de cDNA
conhecidos relevantes para a
questão biológica investigada
Obtidos de bibliotecas de cDNA
Ou feitos a partir de amostras de mRNA
Fabricação do Array (2/4)
Amplificação
por PCR
Fabricação do Array (3/4)
cDNAs são imobilizados em
pontos específicos no substrato
Fabricação do Array (4/4)
Spot contendo várias
cópias de cDNA (sondas) de
um gene específico
Preparação da Amostra
Amostra de
células a ser
analisada
(RNA experimental)
Amostra de
células de referência
ou controle
(RNA controle)
AAAAA
Obs: Também pode ser realizados
experimentos sem a amostra de
controle e também para se comparar
duas amostras de interesse
Extrai RNAm
AAAAA
Síntese e Rotulação de cDNA (1/3)
Primer TTTTT
Transcriptase reversa
dNTP
AAAAA
TTTTT
AAAAA
TTTTT
Fita de cDNA é sintetizada
Cada amostra é marcada com um corante diferente
Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)
AAAAA
TTTTT
AAAAA
TTTTT
mRNA é degradado
Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)
DNA polimerase
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
Segunda fita do cDNA
é sintetizada
Síntese e Rotulação de cDNA (2/3)
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
cDNA é desnaturado
Síntese e Rotulação de cDNA (3/3)
Hibridização
Amostra sob
investigação
Microarray
(1/3)
Amostra é colocada no
array para hibridização
Hibridização
(2/3)
Hibridização
(3/3)
Lava o excesso de cDNA
das amostras rotuladas
Scanning (1/3)
Scanner
Scanning (2/3)
Software do scanner
sobrepõe imagens
Scanning (3/3)
Software do scanner
sobrepõe imagens
Experimentos com Microarrays Resultados

O spot para o gene 1 =





Vermelho se há mais mRNA 1 nas células de teste
Verde se há mais mRNA 1 nas células de referência
Amarelo se são iguais
Preto se o gene não foi expresso
Dados em geral expressos na forma de uma matriz de
níveis de expressão relativa
intensidade vermelha
intensidade verde
indexada pelos genes e as amostras das células de teste
Esquema de um microarray
Dados de Microarray
Característica
g1 g2
Padrão 1
Padrão 2
gN-1gN
Classe
Câncer
Normal
Padrão 3
Padrão i
Padrão m
Câncer
Como é feita a análise ?

Quando é feita a comparação dessas fontes, pode-se
chegar a conclusões sobre a expressão gênica num
determinado estado fisiológico
Algumas Aplicações








Descoberta de genes
Determinar quais genes estão sendo expressos em um determinado
tipo de célula em um dado momento e sob certas condições
Comparar a expressão dos genes em dois tipos de células diferentes
ou duas amostras de tecido diferentes (tecido saudável x tecido
doente)
Examinar mudanças na expressão dos genes em diferentes estágios
no ciclo da célula ou durante desenvolvimento do embrião
Análise da regulação gênica
Identificação de doenças genéticas complexas
Descoberta de medicamentos e estudos de toxicologia
Detecção de mutação/polimorfismo
Outras Tecnologias

As técnicas de AM a serem descritas também
podem ser aplicadas a dados de expressão
gerados com outras tecnologias

MPSS (Massively Parallel Signature Sequence
technology)


SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)


Brenner et al., 2000
Velculescu et al., 1995
Real-time RT-PCR (Reverse-Transcription Polymerase
Chain Reaction)

Freeman et al., 1999