UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
DIRETORIA DE PESQUISA
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA,
UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PARD, PIAD, PIBIT, PADRC E FAPESPA
RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO
Período : __02____/_08_____ a __10______/__08_____
( ) PARCIAL
(X) FINAL
IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO
Título do Projeto de Pesquisa: OSTREICULTURA NO ESTADO DO PARÁ: ESTADO DA ARTE E
INDICADORES DE SUSTENTABILIDADE
Nome do Orientador: Prof.ª Dr.ª Cristiana Ramalho Maciel
Titulação do Orientador: Doutor
Faculdade : Engenharia de Pesca
Instituto/Núcleo: Instituto de Estudos Costeiros - IECOS
Laboratório: Aquicultura
Título do Plano de Trabalho : OBTENÇÃO DE SEMENTES DA ESPÉCIE Crassostrea gasar EM
LABORATÓRIO
Nome do Bolsista: Alana Santos do Rosário
Tipo de Bolsa :
( ) PIBIC/ CNPq
( ) PIBIC/CNPq – AF
( )PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador
( ) PIBIC/UFPA
( ) PIBIC/UFPA – AF
(X ) PIBIC/ INTERIOR
( )PIBIC/PARD
1
RESUMO DO RELATÓRIO ANTERIOR
Macrobrachium surinamicum é comumente associada à pesca do Macrobrachium
amazonicum na região Amazônica, no entanto, não há conhecimento sobre a salinidade ideal
na fase larval. Foram testadas as salinidades: 0, 2, 5, 10, 15, 20 e 30 ‰. Foram avaliadas
larvas recém eclodidas e larvas no estágio VII (provenientes de larviculturas). As larvas foram
mantidas em inanição, em potes individuais, apresentando réplicas (10) e representatividade
de 3 fêmeas. Nos estágios iniciais as salinidades 5, 10 e 15 ‰ proporcionaram maior
longevidade, acompanhado de 100% de muda para o estágio II, enquanto que as salinidades 0
e 2 ‰ proporcionaram alta longevidade com rara presença de larvas no estágio II. Os estágios
finais obtiveram maiores longevidades nas salinidades 10, 15 e 20. Conclui-se que estágios
iniciais de M. surinamicum toleram água doce e oligoalina como estratégia de migração, mas o
desenvolvimento ideal se dá em salinidades intermediárias (acima de 5 e abaixo de 30 ‰).
RESUMO
A espécie Crassostra gasar pertence ao filo molusca e classe bivalvia habitando
principalmente regiões de manguezal. Para esta espécie estudos sobre a produção de
sementes artificiais para a região Amazônica, são praticamente inexistentes. Foram realizados
dois procedimentos: a desova natural induzida e inseminação artificial. A larvicultura ocorreu
em béqueres de dois litros, baldes de até vinte litros e potes de 250 ml, onde foram testadas as
salinidades 16, 21, 26 e 31. A desova natural induzida foi obtida com sucesso após ser
introduzido no procedimento o choque térmico, choque osmótico e a inclusão de gametas
masculinos na água, no entanto as larvas não evoluíram após trocófora. Para a inseminação
artificial, foram obtidas larvas pediveliger na salinidade 21. A salinidade 16 conseguiu alcançar
a larva véliger. Portanto foi presenciando com sucesso a fertilização dos gametas nos dois
processos utilizados (fertilização artificial e desova natural induzida) e as salinidades 16 e 21
mostraram-se, mas adequadas para o desenvolvimento das larvas.
INTRODUÇÃO
O género Crassostrea (Sacco, 1897) inclui mais de 20 espécies (Angell, 1986) e
apresenta uma dispersão geográfica global, ocupando desde lugares tropicais até subtropicais.
No Brasil são conhecidas duas espécies nativas, Crassostrea gasar (Adanson, 1757) e
Crassostrea rhizophorae (Golding, 1828). Além das ostras nativas, também é encontrada a
2
Crassostrea gigas (Thunberg, 1795), espécie exótica utilizada para o cultivo na região sul do
Brasil (Varela et al., 2007).
A espécie C. gasar (Adanson, 1757) pertence ao filo molusca e classe bivalve. Segundo
Afinowi (1984), a distribuição geográfica dessa espécie ocorre na costa ocidental da África,
desde o Senegal até Angola. Entretanto, na ultima década, a sua área de ocorrência foi
ampliada para o Brasil e Guiana, pois foi verificado com uso de marcadores moleculares
(sequência do gene 16S rRNA) que a espécie Crassostrea brasiliana (Lamarck, 1819) era na
realidade C. gasar (Lapègue et al., 2002; Pie et al., 2006; Varela et al., 2007). Nesse caso,
prevalece a nomenclatura C. gasar por ser mais antiga.
C. gasar habita principalmente regiões de manguezal, onde se fixa nas raízes do
mangue ou em rochas (Varela et al., 2007). Apresenta reprodução sexual dioica, com
fertilização externa. No entanto, a morfologia externa não apresenta dimorfismo sexual, sendo
necessária análise histológica, a fim de diferenciar machos de fêmeas (Christo e Absher,
2008). Além disso, os animais são hermafroditas sequenciais, se desenvolvendo primeiramente
como machos, depois mudam para fêmeas, mas dependendo de fatores ambientais podem
voltar a serem machos novamente (Angell, 1986; Miossec et al., 2009). Essa espécie também
pode apresentar diferentes estágios de maturação gonadal em um único individuo (Paixão et
al, 2013).
Paixão et al. (2013), realizando um estudo na Região Amazônica verificaram que a
reprodução de C. gasar ocorre no período chuvoso, devido a visualização de gônadas maduras
com frequência. O estudo indicou que o ciclo reprodutivo de C. gasar é regulado principalmente
pela sazonalidade tropical, ligada ao ciclo hidrológico, que é uma característica da Região.
C. gasar tem grande importância econômica para as regiões Norte e Nordeste, sendo a
espécie de ostra nativa mais explorada comercialmente no Pará. Além disso, ela tem grande
potencial para a aquicultura. Em outras regiões do Brasil é cultivada a espécie exótica
Crassostra gigas, mas devido as altas temperaturas registradas na Amazônia ela não
consegue se adaptar, sendo esta produzida principalmente em Santa Catarina e São Paulo
(Varela, 2007).
Na região Norte, o Pará foi pioneiro no desenvolvimento de pesquisas para a produção
de ostras em escala comercial (Sebrae, 2007). A ostreicultura cresceu a partir de iniciativas
públicas para o desenvolvimento social através do fortalecimento de associações locais para a
produção de alimentos e geração de renda, além de reduzir a exploração de recursos naturais
(Carranza et al., 2009). A ostreicultura se fortaleceu no Pará com a criação da rede Nossa
Pérola que conta com a participação de cinco municípios com a inclusão de seis comunidades:
3
Augusto Correa (Nova Olinda); Salinópolis (Santo Antônio de Urindeua); Maracanã (Nazaré do
Seco); Curuçá (Lauro Sodré) e São Caetano de Odivelas (Pereru e Pereru de Fatima). A
produção de ostras em 2010 nos seis grupos atendidos pelo SEBRAE/PA conforme o relatório
gerencial foi de aproximadamente 19 mil dúzias com faturamento de R$ 39.731,00. No entanto,
apenas dois cultivos de ostras (Nova Olinda e Lauro Sodré) representaram 90% da produção e
faturamento no Nordeste paraense (SEBRAE-PA, 2010). Sendo que neste cenário Nova Olinda
se destaca como maior produtora e Lauro Sodré pela captação e comercialização de sementes
(formas juvenis).
De acordo com o SEBRAE-PA (2007) a partir dos resultados obtidos no cultivo de ostras
em Nova Olinda, a atividade tornou-se uma importante ferramenta econômica para o Estado do
Pará. Ela contribui para a sustentabilidade social e econômica e garante lucratividade para os
ostreicultores. Em contrapartida de todo sucesso de produção em Nova Olinda, ainda há, uma
grande dificuldade relatada pelos ostreicultores, que é a limitada coleta de sementes, sendo
necessário a sua aquisição em Curuçá (Lauro Sodré), que consegue realizar a captação de
sementes do meio natural. No entanto, esse município apresenta dificuldade para a engorda,
atribuído à baixa salinidade, em que na época de alta pluviosidade pode chegar a zero,
causando a perda de todo o cultivo (observação pessoal).
Para a Região Norte até o momento não há informações sobre a produção de sementes
em laboratório, sendo encontrados apenas trabalhos que tratam da genética da espécie
(Varela et al., 2007; Melo et al, 2010) e estágios de maturação gonadal (Paixão et al. 2013).
Desse modo, tentativas de fechar o ciclo em laboratório se tornam de suma importância, pois
faltam conhecimentos sobre a tecnologia de desova e sobre as salinidades ideais para a
espécie.
JUSTIFICATIVA
As espécies do género Crassostrea apresentam-se bem dispersas no território
geográfico, ocupando lugares tropicais e subtropicais. São espécies consideradas euritérmicas
e eurialinas (Quayle, 1980; Angell, 1986). Na Região Amazônica C. gasar prevalece no
Nordeste do estado do Pará, onde atualmente está ocorrendo o cultivo em pequena escala
(Paixão, 2013). A atividade é desenvolvida em cinco municípios com a participação de seis
comunidades: Augusto Correa (Nova Olinda); Salinópolis (Santo Antônio de Urindeua);
Maracanã (Nazaré do Seco); Curuçá (Lauro Sodré) e São Caetano de Odivelas (Pereru e
Pereru de Fatima). Dentre as comunidades, Nova Olinda é a que apresenta maior
produtividade na fase de engorda, enquanto que Lauro Sodré é um importante fornecedor de
4
sementes coletadas do meio natural (Figura 1). Outro fator que torna a atividade vulnerável, é a
falta de conhecimento sobre os parâmetros ideias para a espécie. Sendo a salinidade um
parâmetro muito importante, pois em alguns locais de cultivo ela se torna a grande causadora
da morte dos animais (observação pessoal). Este fator se torna bastante significativo durante o
período de grande pluviosidade, fazendo com que a salinidade varie bastante, alcançando
níveis muito baixos. Para a Região Amazônica, estudos sobre a produção de sementes
artificiais de Crassostrea gasar são praticamente inexistentes, dessa forma necessitam de
estudos que venham suprir a falta de informações sobre as técnicas de indução, larvicultura e
dos parâmetros ideais para esta espécie. Essas informações poderão contribuir para as futuras
estratégias de manejo e verificar se há viabilidade técnica para a obtenção de sementes de C.
gasar em laboratório.
Figura 1 – Coletores de sementes em
Lauro Sodré.
OBJETIVOS
Geral
Obter com sucesso a desova e larvicultura da espécie C. gasar em laboratório.
Específicos

Induzir a desova por choque térmico e estímulos biológicos e/ou químicos;

Realizar inseminação artificial pela raspagem das gônadas;

Determinar a salinidade ideal e a crítica para o desenvolvimento das larvas
5
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram adquiridas ostras adultas com cerca de um ano (máster), provenientes da
comunidade de Nova Olinda e Lauro Sodré, localizados na região nordeste do estado do Pará.
Em Nova Olinda ocorre o cultivo em pequena escala e em Lauro Sodré ocorre a captação de
sementes do banco natural. Ao chegar no Laboratório de Aquicultura da Universidade Federal
do Pará (UFPA), foram realizados os seguintes procedimentos: raspagem de incrustações nas
conchas, lavagem e escovação. Posteriormente, foram lavados em água doce e depois água
salgada (Silveira, 2009). Todos os utensílios utilizados foram lavados com limão antes de
iniciar os procedimentos de desova e larvicultura. Para o desenvolvimento da larvicultura de
Crassostrea gasar foi providenciada a montagem de filtros em série (Cuno e UV) com o
objetivo de purificar a água do mar. Esse procedimento se deve a necessidade de uma água o
mais próximo possível de qualidade oceânica, pobre em matéria orgânica e pura. Também foi
anexado a uma caixa de 150 litros um filtro de carvão ativado para que a água pudesse passar
sucessivas vezes, com o auxílio de uma bomba elétrica, antes de ser utilizada para o cultivo
das ostras.
Em todos os experimentos foi tentado inicialmente obter a desova induzida, quando isso
não foi possível, procedeu-se a raspagem das gônadas e a fecundação artificial. A desova
induzida seguiu-se de alternar os animais de uma sala refrigerada há 18 °C, com permanência
por duas horas (fora da água). Posteriormente, os animais foram transferidos para uma caixa
de 300 L com água salobra em temperatura entre 27 a 28°C. Como esse procedimento não
obteve sucesso, foram acrescidos outros métodos: choque osmótico, logo após o choque
térmico (salinidade 15, seguido de salinidade 30); peróxido de oxigênio e a inclusão de
gametas masculinos na água (obtidos por raspagem das gônadas) [Areias, 2012]. Todos os
métodos descritos anteriormente, foram aplicados em animais recém chegados do campo, com
uso de corrente de água salgada em sistema aberto.
A inseminação artificial: inicialmente realizou-se a abertura das valvas das ostras e com
uma lamina foi feito a raspagem das gônadas. Em seguida, foi levado ao microscópio para
identificação dos machos e fêmeas. A fertilização ocorreu em béqueres de dois litros. A
escolha dos gametas utilizados foi baseada na descrição de Castilho-Westphal et al. (2013).
Além disso, foi verificada a razão sexual dos espécimes coletados. A larvicultura ocorreu em
béqueres de dois litros, baldes de até vinte litros e potes de 250 ml. O volume do cultivo foi
variado de acordo com o volume de gametas obtidos. Foram testadas as salinidades 16, 21, 26
e 31. A troca de água ocorria em dias alternados, em que se utilizavam peneiras de 32 µm, 53
6
µm, 125 µm e 212 µm para reterem as larvas. Utilizava-se para alimentação, algumas espécies
de microalgas. Foram testadas as algas Isochrysis sp, Nannochloropsis oculata e Chaetoceros
sp.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No final do período chuvoso foi observada proporção sexual similar, posteriormente foi
registrado sistematicamente maior número de machos em relação as fêmeas (cerca de 4,5:1).
No período chuvoso a proporção sexual observada apresentou maior quantidade de machos
em relação as fêmeas (9:1).
Ao total foram realizadas 19 tentativas de reprodução de C. gasar, utilizando dois
processos, a fertilização artificial com raspagem das gônadas e desova induzida. Após diversas
tentativas, foi possível alcançar a larva pedivéliger. Na maioria das tentativas conseguíamos
trocófora e larva D (Tabela1). Segundo Paixão et al. (2013), pode ser observado mas de uma
fase de maturação gonadal em um único individuo, o que sugere que nem todos os óvulos
obtidos estavam preparados para a fertilização. Estes óvulos imaturos proporcionaram uma
carga de matéria orgânica para o cultivo, que pode ter contribuído com a morte dos ovos
fecundados. É conhecida para espécie que as mesmas são muito sensíveis e precisavam de
um ambiente o mais limpo possível.
Tabela 1- Tentativas realizadas para a reprodução da C. gasar, nos meses de Junho, Julho, Agosto,
Setembro, Outubro/2014, fevereiro, Março, Abril, Maio/2015.
7
Junho
Julho
Agosto
Setembro
Outubro
fevereiro
Março
Abril
Maio
1° tentativa
Foi realizado a
raspagem das gônadas,
foi obtido larva D
Foi realizado a
raspagem das gônadas,
foi obtido larva D
Foi realizado o choque
térmico, não foi possível
induzir a desova.
Foi realizado o choque
térmico com o choque
osmótico, não foi
possível induzir a
desova.
Foi feito a raspagem das
gônadas, não houve
evolução a partir de
trocófora.
Foi realizado o choque
térmico com o choque
osmótico, não houve
sucesso na indução a
desova.
Foi realizado o choque
térmico com o choque
osmótico, não foi
possível induzir a
desova.
2° tentativa
3° tentativa
Foi realizado a raspagem das
gônadas, foi obtido larva D
Foi realizado a raspagem das
gônadas, foi obtido larva D
Foi realizado o choque térmico com
o choque osmótico, obtendo
Testamos com choque térmico e
sucesso na indução a desova e foi
água oxigenada, não obteve sucesso
alcançado trocófora. Também foi
na indução a desova.
realizado a raspagem das gônadas,
mas não houve evolução a partir de
trocófora.
Foi realizado a raspagem das
gônadas, não houve sucesso na
indução a desova.
Foi realizado a
raspagem das gônadas,
obteve larva D
Foi realizado a
raspagem das gônadas,
obteve pedivéliger.
Foi realizado a raspagem
das gônadas, obteve
trocófora.
No mês de fevereiro de 2015 as ostras foram oriundas do banco natural de Lauro Sodré.
Essa escolha foi devido a vocação dessa localidade para a captação de sementes. No entanto,
estes animais apresentaram a cor do manto roxa, sua concha externamente apresentava cor
verde claro e suas gônadas não apresentavam boas condições, quando comparadas as ostras
de nova Olinda (Figura 2). Não houve sucesso na tentativa com uso dessas matrizes. Estes
8
fatores podem estar atribuído com a alta pluviosidade da região, alcançando valores igual a
zero, dificultando assim o desenvolvimento dos animais.
A
B
C
D
Figura 2: Estrutura externa e interna de C. gasar de Lauro Sodré (A e B) e Nova Olinda (C e D). Fonte: Laqua.
As salinidades testadas (16, 21, 26, e 31), apresentaram diferenças no desenvolvimento
larval. A salinidade 16 alcançou o estágio véliger, a salinidade 21 apresentou o melhor
desenvolvimento, conseguindo alcançar o estágio pedivéliger. As salinidades 26 e 31 não
conseguiram evoluir após o estágio larva D. É possível que essa seja um estratégia para que
as larvas eclodam e migrem até um ambiente estuarino com salinidades moderadas.
A desova natural induzida foi obtida com sucesso após ser introduzido no procedimento
o choque térmico, choque osmótico e a inclusão de gametas masculinos na água em
sequencia (figura 3). A escolha da inclusão do choque osmótico como mais um fator indutor da
desova foi baseada na tese levantada por Paixão et al. (2013) que sugere que na Região de
Nova Olinda (origem das ostras dessa tentativa) as variações osmóticas são mais significativas
para maturação gonadal e desova do que as variações da temperatura.
Para a desova natural induzida foi observada a clivagem dos gametas (Figura 4) o que
sugere o sucesso da fertilização, no entanto, no dia seguinte haviam apenas algumas larvas
trocóforas e grande quantidade de gametas rompidos, elevando a quantidade de matéria
orgânica no sistema. Apesar de não ter havido a conclusão do cultivo, o sucesso da obtenção
da desova natural foi um importante avanço. A repetição da técnica da desova induzida não foi
possível, pois nos meses subsequentes a proporção sexual foi sistematicamente desfavorável
as fêmeas.
Posteriormente, foram realizadas fecundações com raspagem das gônadas. Foram
obtidas larvas trocóforas após 6 a 12 horas, larvas D após 24 h, véliger umbonada após o 19°
dia, veliger após o 25° dia e pé de véliger após o 53° dia. Até o momento não houve sucesso
9
na fixação de sementes, mas vários parâmetros avançaram, o que possibilitará tentativas
futuras aplicando o conhecimento adquirido para a espécie.
Figura 3 – Ostras apresentando desova induzida, sendo visualizada pela água turva.
Figura 4 – Óvulos fecundados alguns minutos após a fertilização artificial obtida
por raspagem das gônadas.
Características essências de cada estágio larval foram destacados em fotografias para
facilitar a identificação do desenvolvimento larval. Foi elaborada uma simples chave informando
as características principais que devem ser observadas para determinar o estágio larval que se
encontram.
10
Principais características para identificação dos estágios larvais de C. gasar.
Trocófora
Forma arredondada, possuindo cílios e um
flagelo
(Fig 5: A)
Larva D
Forma da letra D, possui o velum ciliado
utilizado para natação e captação de alimento
(Fig 5: B1 e
B2)
Véliger
umbonada
Inicio do umbo, velum e cílios
(Fig 5: C)
Véliger
umbo, cílios e velum mas desenvolvidos
(Fig 5: D)
Pedivéliger
velum, cílios e pé
(Fig 5: E)
A
D
B1
B2
C
E
Figura 5 - Caracteristicas que indicam desenvolvimento larval dos estágios: Trocófora (A),
Larva D (B1 e B2), Véliger umbonada (C), Véliger (D) e Pedivéliger (E) de C. gasar.
PUBLICAÇÕES
A produção apresentada a seguir corresponde ao desenvolvimento do projeto anterior
(renovação de bolsa). Os dados do projeto atual ainda são preliminares, mas pretendemos
enviar um resumo para o Congresso World Aquaculture América Latina que ocorrerá em
11
Fortaleza, no mês de novembro. Além disso, os experimentos desenvolvidos fazem parte de
um projeto maior e serão agrupados para a produção de um artigo científico.
ROSARIO, A. S. ; PEREIRA, D. M. ; FIGUEIREDO, N. R. ; ROCHA, C. P. ; MACIEL, C. M. T. ; MACIEL, C. R. .
Efeito da Salinidade na larvicultura de Macrobrachium surinamicum. In: VI Congresso da Sociedade Brasileira de
Aquicultura e Biologia Aquática (Aquaciência), 2014, Foz do Iguaçu-PR. Anais do VI Congresso da Sociedade
Brasileira de Aquicultura e Biologia Aquática (Aquaciência) - CD, 2014.
PEREIRA, D. M. ; ROSARIO, A. S. ; ROCHA, C. P. ; MACIEL, C. M. T. ; ABRUNHOSA, F. A. ; MACIEL, C. R. .
Conteúdo estomacal do Macrobrachium amazonicum. In: VI Congresso da Sociedade Brasileira de Aquicultura e
Biologia Aquática (Aquaciência), 2014, Foz do Iguaçu-PR. Anais do VI Congresso da Sociedade Brasileira de
Aquicultura e Biologia Aquática (Aquaciência) - CD, 2014.
SOEIRO, R. K. S. ; ROSARIO, A. S. ; PEREIRA, D. M. ; FIGUEIREDO, N. R. ; ROCHA, C. P. ; MACIEL, C. M. T. ;
MACIEL, C. R. . Salinidade na larvicultura do Macrobrachium amazonicum de duas regiões do estado do Pará:
Estuarina e Várzea. In: VI Congresso da Sociedade Brasileira de Aquicultura e Biologia Aquática (Aquaciência),
2014, Foz do Iguaçu-PR. Anais do VI Congresso da Sociedade Brasileira de Aquicultura e Biologia Aquática
(Aquaciência) - CD, 2014.
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos até o presente momento indicam que é possível realizar a desova
natural induzida em laboratório e presenciando com sucesso a fertilização dos gametas nos
dois processos utilizados (raspagem e desova natural induzida). As larvas conseguiram se
desenvolver até o estágio de larva pé de véliger. As salinidade 16 e 21 mostraram-se mas
adequadas para o desenvolvimentos das larvas.
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13
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RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO Período : __02____