Como a Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR), PCR em tempo real e o
Sequenciamento de genes são ferramentas
importantes na investigação científica e no
diagnóstico laboratorial ?
Viveca Giongo
Laboratório de Virologia Molecular,
Departamento de Biologia Celular e Molecular/UFF
Comparação dos
valores de
sensibilidade entre
os ensaios
imunológicos
Parâmetros para validação de um
teste sorológico




Sensibilidade - refere-se à porcentagem de
resultados positivos pelo teste na população
doente. Verdadeiros Positivos
Sensibilidade: VP/VP+FN
Especificidade - porcentagem de resultados
negativos pelo teste em indivíduos não doentes.
Proporção dos verdadeiros negativos
Especificidade: VN/ VN+FP
A Sorologia sempre funciona ?




Alguns cuidados: IgM representa infecção
recente. Certo?
Ela pode permanecer na fase de
convalescença
Não indica portanto infecção recente
Infecções fulminantes por vírus, infecções
com risco de evolução maligna necessitam
de um diagnostico precoce
Biologia Molecular
Reação em Cadeia da Polimerase
Histórico...
Nobel Prize, 1968
Principio da replicação do DNA
Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for
Deoxyribose Nucleic Acid
J. D. WATSON & F. H. C. CRICK
Medical Research Council Unit for the Study of the Molecular
Structure of Biological Systems, Cavendish Laboratory, Cambridge.
April 2
Nature 171, 737-738 (25 April 1953) |
doi:10.1038/171737a
JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Aug. 1969, p.
289-297 Vol. 98, No. I
Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a
Nonsporulating Extreme Thermophile
THOMAS D. BROCK AND HUDSON FREEZE
Department of Microbiology, Indiana University,
Bloomington, Indiana 47401
Thermus
acquaticus
The isolation of a new thermophilic bacterium,
Thermus aquaticus gen. n. And sp. n., is
described. Successful enrichment requires
incubation at 70 to 75 C, and the use of nutrient
media relatively dilute with respect to the
organic components.
Strains of T. aquaticus have been isolated from
a variety of thermal springs in Yellowstone
National Park and from a thermal spring in
California. The organism has also been isolated
from man-made thermal habitats, such as hot
tap water, in geographical locations quite
distant from thermal springs. Isolates of T.
Aquaticus are gram-negative nonsporulating
nonmotile rods which frequently form long
filaments at supraoptimal temperatures or in the
stationary phase. The optimum temperature
for growth is 70 C, the maximum 79 C, and
the minimum about 40 C. The generation time
at the optimum is about 50 min.
Quem inventou a PCR
Kary Mullis, geneticista
Nobel Prize em Química (1993)
pelo desenvolvimento de um
método que permite sintetizar, em
poucas horas e in vitro, uma grande
quantidade de um determinado
fragmento de DNA
Seus estudos em 1985 permitiram
amplificar o DNA
Saiki, R., Scharf, S., Faloona, F., Mullis, K., Horn, G., and Erlich, H. (1985). Enzymatic
amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis
of sickle cell anemia. Science 230: 1350-54
Mullis, K. and Faloona, F. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods Enzymol 155: 335-35
Quais foram as limitações?
Síntese de oligonucleotideos (primers)
Purificação de DNA polimerase
"for contributions to the developments of methods within DNA-based
chemistry: for his invention of the polymerase chain reaction (PCR)
method"
PCR





Polymerase Chain Reaction (reação em cadeia
da polimerase)
Reação enzimática de polimerização de DNA in
vitro
É uma reação cíclica na qual os produtos de
um ciclo são substratos para o ciclo seguinte
Amplificação de sequências específicas de
DNA, permitindo sua visualização e/ou análise
posterior
É um processo termodinâmico e enzimático
Reação para amplificação de
segmento específico de DNA

Exon especifico de um gene
humano
Cópia molecular
Capaz de copiar e multiplicar parte de uma “sentença”
TACGCCGATCTCGTCCGACGCTAGTAACCGATCGGAAGGCCTAAG
CATTTCGCGATGACCTAGGATCGATGCATTAAGCGTAGCTAGCATG
AGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGC
ATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGACTACGTAGCTAG
ACTAGATGCATAGCTAGCAGTACTTGCATGACTGACTACGTAGCTA
GCCGTTAGCTAACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCATAGCATG
ACTAGCTAGGATCACTGAGAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCT
ACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCACTAGGATCGATGCA
TTAAGCGTAGCTAGCATGAGGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCA
TGGATTAACAACCATAGCATGACTAGCTAGGATCACTGAGTACTGA
GGATAGGCTACGTACGTAGGTTACGCATGGATTAACAACCAACTAG
CTAGGATCACTGAGTACAGTACTAGGCATATTAGTGCGTAGCTAGC
Quais são as aplicações da PCR?

Diagnósticos moleculares

Identificação e isolamento de genes

Marcadores moleculares

Expressão gênica

PCR em tempo real
Diagnóstico molecular – gripe aviária
Diagnóstico molecular – meningite e
penuemonia bacteriana
HIV
Aplicações

Teste de
Identificação de
indivíduos

polimorfismo
Aplicações expressão gênica e
polimorfismo
MELANOMAS DE MUCOSA ORAL E CUTÂNEOS
Polimorfismo
p53
Elementos da PCR
DNA amostra, DNA polimerase,
Termociclador – substitui a helicase e
DNTP – nucleotideos trifosfatados
Componentes
da Reação:
* DNA
(DNAg, DNAc
* Taq
polimerase
* Primers
* Tampão
* MgCl2
* dNTPs
Qual a importância de oligos Ou
primers bem desenhados?
Pré requisito para obter sucesso no PCR
* alta eficiência
* maior sensibilidade
* produtos de PCR especificos
* ausência de co-amplificação com DNA
genômico
Avaliação prévia da sequência alvo
Observar:
* significado biológico (mRNA/cDNA x gDNA)
* sequência única
* qualidade da sequência alvo
* evitar regiões não desejadas na sequência alvo
Etapas da PCR
1. Desnaturação
2. Anelamento
3. Extensão
Principio da PCR
Termocicladores
Amplificação Exponencial
Ao sair do
termociclador
a aparência é
a mesma –
revelação da
região
amplificada
http://teach.genetics.utah.edu
/
Quantificação do DNA amplificado
Nanodrop (espectofotômetro)  260 nm
Trabalhando com PCR
convencional
1. Etapas Pré- PCR:
Coleta da Amostra
Estabilização
Extração do Ácido
Nucleico
2. PCR ou Ciclagem:
Preparo da Reação
Termociclagem
3. Pós-PCR:
Análise em Gel
Hot Start
In situ
Inverse
Long
Tipos de PCR
Multiplex
Nested
Competitive
Touchdown
Degenerate
Fast
Hot Start PCR
A enzima DNA polimerase pode demonstrar uma pequena
atividade à temperatura ambiente, durante a montagem
do experimento
E isso pode catalisar a extensão da extremidade 3`
Levando depois a degradação da extremidade 5`pois a
DNA pol possui atividade exonuclease
Destruindo o primer e o substrato
Hot Start permite a inibição da atividade da polimerase
durante o preparo da reação
A polimerase esta ligada a anticorpos e não funciona a
temperatura ambiente
O aumento da temperatura libera os ac monoclonais e a
reação se inicia
In situ PCR (ISH)
Reação de PCR que ocorre dentro da célula
numa lâmina
Pode ser realizado em células ou tecidos fixados
Útil para acompanhar infecções
Inverse PCR
(IPCR)c
DNA cortado em pequenos
fragmentos por enzimas
de restrição
Ligação do produto – DNA
circular
DNA novamente tratado
com enzimas de
restrição – gera produtos
com sequencia interna
conhecida, que pode ser
usada na PCR
PCR é realizada com
primers complementares
às sequências internas
conhecidas
Long PCR
PCR cuja extensão é mais
longa que as PCR
convencionais (> 5Kb)
Enzima amplifica alvos
maiores (alta fidelidade!)
Objetivos:
- Clonagem de cDNA de
longos transcritos
- Mapeamento de
sequências
- PCR de genoma
mitocondrial
Multiplex PCR
PCR com dois ou mais
conjuntos de primers,
para amplificação de
diferentes fragmentos de
uma mesma amostra
Objetivos:
- identificação de vários
vírus
- identificação de deleções
em genes em doenças
degenerativas (Distrofia
muscular de Duchenne)
Nested PCR
É uma variação da PCR
convencional, na qual
são utilizados dois
paraes de primers (ao i
nvés de um) para
amplificar um mesmo
fragmento
Duas PCR: primeira com a
fita parental, em seguida
em uma segunda PCR
com a fita menor
Aumenta a especificidade!
Competitive PCR
É adicionada a reação uma
quantidade conhecida de
um fragmento de DNA
(competidor)
Esse competidor deve
conter sequências para
os mesmos primers
utilizados para amplificar
o alvo
Quantidade de Dna alvo
pode ser derterminada
pela razão Alvo (T) /
competidor (C)
Touchdown PCR
Modificação da PCR convencional que pode resultar na
diminuição de amplificações não especificas
Temperatura de anelamento
- começa mais alta que e temperatura ótima dos primers
- diminuição de 1C a cada um ou dois ciclos, até atingir a
temperatura específica
- após atingir essa temperatura ela é mantida nos ciclos
restantes
Objetivo:
Aumentar a especificidade, evita amplificação errônea
95C 30s
95C 30s, 60C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
95C 30s, 56 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
95C 30s, 53 C 30 s, 72 C 1min (3 ciclos)
95C 30s, 50 C 30 s, 72 C 1min (25 ciclos)
72C 5 min
Degenerate PCR
O que são primers degenerados?
Primers que possuem um numero de opções em várias
posições na sequência
Exemplo:
5´- TCGAATTCVCCYAAYTGRCCNT-3´
A+C+G =V
C+T= Y
A+C+G+T= N
Objetivo: avaliar polimorfismo
Fast PCR
Kits específicos (ex. GeneAmp Fast PCR Master
Mix)
PCR pode ser realizado de forma mais rápida, para
algumas aplicações, tais como:
- genotipagem de animais transgênicos
- PCR de colônia
Limitações da PCR convencional
* Intensa padronização
* Baixa sensibilidade e resolução
* Curta extensão dinâmica (< 2 logs)
* Colorações não quantitativas
* Contaminação (brometo)
* Discriminação baseada soemnte no tamanho do
amplicon
* Não automatizado
* Necessidade de pós processamento do produto
da PCR
Real-time PCR with the SYBR®
Green I dye.
O corante torna-se
fluorescente (diamantes
verdes) quando se liga
a dupla fita de DNA
Real-time PCR with TaqMan®
primers
O corante torna-se
fluorescente (diamantes
verdes) quando se liga a
dupla fita de DNA
TM
HR-1
Melt Curve
A única curva isolada
ilustra um declínio
mais rápido da
fluorescência,indicand
o uma mutação que
pode ter interrompido
o pareamento de
bases de nucleotídeos
do DNA
Sequenciamento de genes – um
único primer
Sequenciamento de genes - elucidação de
genoma http://www.ncbi.nlm.nih.gov
http://www.youtube.com/watch?v=gNNI19l1LW8&feature=player_detailpag
e
Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da
Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que
permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado
fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tend
trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre
muitas outras para além da Investigação em Biologia.
Kary Mullins ganhou o prêmio Nobel de química em 1993 por desenvolver o famoso PCR, Reaçã
em Cadeia da Polimerase, que é um processo usado muito em labs de biologia molecular para
multiplicar uma pequena quantidade de DNA em muito DNA, facilitando nosso trabalh
http://www.youtube.com/watch?v=gNNI19l1LW8&feature=player_detailpag
e