Agentes infecciosos e as respectivas técnicas de análise molecular
qualitativa e quantitativa
A aplicação dos métodos de biologia molecular p/ a identificação e caracterização de agentes infecciosos tem
apresentado rápida evolução nos últimos anos ,devido, em grande parte, ao desenvolvimento de novas
tecnologias de análise do DNA e do RNA e à maior disponibilidade do testes diagnósticos em laboratórios
clínicos e epidemiológicos
Com os métodos atualmente em uso, é possível identificar e quantificar bactérias,vírus, fungos,protozoários
em um prazo de poucas horasgarantindo sensibilidade e especificidade elevada.
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E. Maranhão
Grupo do PAI/PNI na Ensp/Fiocruz
Material elaborado p/ o curso de especialização em investigação epidemiológica de campo- Dpto de
epidemiologia e métodos quantitativos em saúde- Ensp/Fiocruz-2009
Fundação JPM
Técnicas de análise molecular qualitativa[1]
e
agentes infecciosos
•
Microorganismos
•
•
•
Papilomavírus humano
Captura híbrida
hibridização em situ
Raspado da lesão suspeita,
raspado de colo de útero,
biópsia
•
HIV-1
PCR,NASBA,TMA
sangue
•
Vírus da hepatite B(HBV)
PCR,PCR em tempo real
sangue
•
Vírus da hepatite C(HCV)
RT-PCR,TMA,PCR em tempo real
sangue
•
•
Chlamydia trachomatis
PCR,LCR,captura híbrida,TMA
Raspado de colo de útero,
urina, raspado ureteral
•
•
Neisseria gonorrhoeae
PCR,LCR,captura híbrida
Raspado de colo de útero,
urina,raspado ureteral
•
ESPM
métodos*
materiais biológicos
Técnicas de análise molecular qualitativa[2]
•
Microorganismos
métodos*
•
Toxoplasma gondii
PCR, PCR em tempo real
sangue,liquido amniótico
•
•
Micobactérias
PCR, PCR em tempo real
TMA
escarro, lavados, urina
biópsia
•
Citomegalovírus
•
Herpes simples tipos 1 e 2
•
Vírus Epstein –Barr
•
Parvovírus B 19
•
•
Eritrovírus B 19
•
ESPM
PCR,NASBA,PCR em tempo real
PCR,PCR em tempo real
materiais biológicos
sangue,urina,liquor
sangue , liquor
PCR,PCR em tempo real
sangue
PCR,hibridização
sangue
PCR
sangue, liquido
amniótico
Técnicas de análise molecular qualitativa[3]
•
Microrganismo
métodos*
materiais biológicos
•
HTLV-1 e HTLV-2
RT-PCR
sangue,liquor, biópsia
•
Vírus da dengue
•
Vírus da rubéola
•
PCR,PCR em tempo real
sangue
RT-PCR
sangue
Herpesvírus-8
PCR
sangue
•
Herpes vírus-6
PCR
sangue, liquor
•
Vírus JC
PCR
liquor
•
Enterovírus
PCR
liquor,sangue
•
Vírus da caxumba
ESPM
RT-PCR
liquor
Métodos *
•
Obs::Estas não são as única técnicas disponíveis, mas as + comumente empregadas p/
investigação de cada um dos microorganismos ::
•
 PCR [polymerase chain reaction] ;
•
 RT-PCR [reverse-transcribed polymerase chain reaction] ;
•
 NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] ;
•
LCR [ligase chain reaction] ;
•
TMA [transcription mediated amplificacion] .
•
OBS:A metodologia do PCR e suas variantes(RT-PCR,PCR em tempo real) são as + amplamente utilizadas
como método de detecção qualitativa
•
ESPM
Técnicas de análise molecular quantitativa[1]
Agentes infecciosos
•
Vírus
•
HIV-1
RT-PCR,b-DNA,NASBA
sangue
•
Vírus da hepatite B (HBV)
PCR,b-DNA,PCR em tempo real
sangue
•
Vírus da hepatite C (HCV)
RT-PCR,b-DNA,PCR em tempo real
sangue
•
Citomegalovírus
PCR,NASBA,PCR em tempo real
sangue, urina, liquor
•
Vírus Epstein-Barr
PCR,PCR em tempo real
sangue,liquor
•
•
•
•
•
•
Obs::
PCR [polymerase chain reaction] ;
RT-PCR [reverse-trancribed polylerase chain reaction] ;
B-DNA [branched-DNA]
NASBA [nucleic acid sequence-based amplification] .
métodos*
materiais biológicos
ESPM
Glossário[1]
•
 Polymerase Chain Reaction O método PCR consiste na amplificação de um segmento
específico do DNA com a utilização de 2 oligonicleotídeos ( iniciadores ou primers) e da enzima
DNA polimerase.
•
RT-PCRé um método de amplificação realizado a partir de moléculas de RNA.Após a
extração do RNA,sintetiza-se cDNA (DNA complementar) empregando-se a enzima transcriptase
reversa de origem viral. A partir do cDNA, emprega-se o método de PCR para amplificação.
•
PCR em Tempo RealO método do PCR em tempo real emprega os mesmos princípios do
PCR convencional, mas com acompanhamento contínuo da reação, permitindo a quantificação
precisa do material amplificado a cada ciclo de amplificação por meio da detecção de luz emitida
por corantes fluorescentes. ** Obs:Atualmente o método do PCR em tempo real é considerado
um dos métodos de escolha p/ testes moleculares quantitativos e qualitativos em decorrência de
suas vantagens sobre o PCR convencional::
+ or rapidez de execução;
+ores sensibilidade e reprodutibilidade;
- or risco de contaminação de amostras no ambiente laboratorial,devido a ausência de
manipulação das amostras após o processo de amplificação.
•
•
•
Glossário[2]
•
TMA e NASBAsão métodos de amplificação isotérmica.
•
Branched-DNAApós a extração do RNA, um conjunto de sondas é empregado p/ captura das
moléculas de RNA em uma microplaca. Outros 2 conjuntos de sondas ligam-se então ao RNA
capturado , e um substrato é adicionado p/ o complexo enzimático associado à sonda. A leitura
dos resultados é feita por quimioluminescencia.
•
Captura hibrida  é um método que tem sido utilizado largamente na detecção e subtipagem
do papilomavírus humano.É um método de identificação direta do DNA.Como inúmeras
moléculas do anticorpo conjugado se ligam a cada híbrido capturado, ocorre um “amplificação” do
sinal, o que determina boa sensibilidade do método.
•
Sequenciamento do DNA é um método que permite definir a seqüência de bases de um
segmento específico do DNA.Atualmente, é realizado por meio de equipamentos
-sequenciadores de DNA-, que permitem a análise automatizada de grande número de
segmentos em poucas horas.
ESPM
Referência
•
Burke W. Genetic Testing.New England Journal of Medicine 2002;347:1867-1875.
•
Mauro S. Figueiredo.Fundamentos de Biologia Molecular e sua importância clínica.
•
Connor J M, Fergunson-Smith M A . Essential Medical Genetics,#rd edition.Blackwell Scientific
Publicatios,1991.