Real-Time PCR
Cockerill FR III. Arch Pathol Lab Med. 2003;127:1112
Qual o problema com os
géis de Agarose?
*
*
*
*
*
*
*
Precisão ruim
Baixa sensibilidade
Baixa resolução
Não-automatizado
Discriminação apenas pelo tamanho
Resultados não numéricos
Não é confiável quantitativamente
Real-Time PCR
Real-time PCR monitora a fluorescência emitida durante a
reação como um indicador da produção de amplificado em
cada ciclo de PCR
Vantagens do Real-time PCR
* Não influenciado por amplificação não específica
* A amplificação pode ser monitorada em tempo real
* Não ocorre processamento pós-pcr
(baixo risco de contaminação)
* Ciclagem ultra-rápida (30 minutos a 2 horas)
* Requer 1000x menos RNA que os ensaios convencionais
*confirmação da amplificação específica em tempo real
* Mais específico, sensível e reprodutivo
* Não tão mais caro do que o PCR convencional
(excetuando-se o custo do equipamento)
Real-time PCR desvantagens
* Não é ideal para multiplex
* A padronização requer alto treinamento técnico e suporte
* Alto custo do equipamento
***
* Variação intra- e inter-ensaio
* Labilidade do RNA
* Contaminação por DNA (na análise de mRNA)
Princípios do Real-time
•Baseado na detecção e quantificação de uma molécula
fluorescente reporter
* O primeiro aumento significativo na quantidade de
amplificado de PCR (CT - threshold cycle) correlaciona-se
com a quantidade inicial de amostra alvo template
A série com cinco diluições da amostra aparenta chegar ao plateau no mesmo lugar,
mesmo a fae exponencial claramente mostrar uma diferença entre os pontos através da
série de diluições. Isso demonstra o fato de que se as medidas fossem tiradas na fase de
plateau, os dados não representariam as quantidades iniciais de material alvo
Princípios do Real-Time
Três métodos principais para ensaios quantitativos:
1. Sondas hidrolizáveis
(TaqMan, Beacons, Scorpions)
2. Sondas hibridizáveis
(Light Cycler)
3. Agentes ligantes ao DNA
(SYBR Green)
(www)
Princípios das Técnicas de Real Time Quantitativo
(a) SYBR Green I: SA fluorescência emitida pelo SYBR Green é enormemente
aumentada após a ligação ao DNA dupla fita. Durante a fase de extensão, mais e
mais Cyber Green vai se ligar ao produto de PCR, resultando em um aumento de
fluorescência. Conequentemente, durante cada ciclo do PCR mais sinal fluorescente
será detectado.
(b) Sondas hidrolizáveis: As sondas hidrolizáveis são conjugadas com um fluorocromo
quencher, o qual absorve a fluorescência do fluorocromo reporter, enquanto a
sonda está intacta. Porém, duratne a amplificação da sequencia alvo, a sonda
hidrolizável é retirada e susequentemente hidrolizada pela Taq polimerase. Isso
resulta na separação do quencher do reporter, e consequentemente a fluorescência
do reporter passa a ser detectada. Durante cada ciclo de PCR essa fluorescência vai
aumentar devido ao acúmulo exponencial de fluorocromos reporters.
(c) Sondas de hibridização: Nessa técnica, uma sonda é marcada com um fluorocromo
doador na extremidade 3’ e uma segunda sonda – adjacente – é marcada com um
fluorocromo receptor. Quando os dois fluorocromos estão próximos (1-5
nucleotídoes de distância), a luz emitida pelo doador vai excitar o receptor (FRET).
Isso resulta em emissão de fluorescência, a qual vai ser detectada durante a fase de
anelamento. Após cada ciclo de PCR, mais sondas de hibridização podem ligar,
resultando em aumento do sinal fluorescente.
Van der Velden, Leukemia 2003
Wittwer, 1997 (www)
Sondas TaqMan
FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer
Atividade exonuclease 5’ da Taq polimerase
* Temperatura de anelamento 100 C maior do que primers
* Não pode haver Gs consecutivos)
* G+C entre 30-80%
* Mais Cs do que Gs
* nenhum G na extremidade 5'
FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer
Atividade Exonuclease 5' da DNA Polimerase
Mocellin et al. Trends Mol Med 2003 (www)
TaqMan 5’ Exonuclease
Além dos dois convencionais primers, os quais são específicos para a sequência alvo, um terceiro primer é
desenhado para se ligar especificamente a um sítio no meio da sequência alvo. Esse primer é marcados com dois
fluorocromos, um reporter, na extremidade 5’ e um quencher, na extremidade 3’. Devido a extremidade 3’ estar
bloqueada, esse primer não pode iniciar a síntese de novas fitas de DNA. Durante reação de PCR, a Taq sintetiza
uma nova fita de DNA inciando no primer forward, mas quando a enzima aproxima-se da sonda, sua atividde de
processamento degrada o primer P3, e o quencher e o reporter não estão mais na mesma molécula, o queleva a um
aumento da emissão de fluorescência, com sua intensidade sendo facilmente detectada.
Human Molecular Genetics 2. NCBI Books
TaqMan Primers
* Tm parecidos (58-600 C)
* 15-30 bases de tamanho
* Conteúdo de G+C 30-80%
•Sem sequencias de nucleotídeos repetidos
•* não mais de dois G+C no final 3’
•Sem G no final 5‘
•* tamanho médio do amplificado 50-150 bp (max 400)
Linear After The Exponential (LATE) PCR
Detecção de produtos
amplificados específicos
em amostras contendo
concentrações iniciais
diferentes de DNA.
(A) Utilizou-se 100,000
(vermelho), 10,000
(verde), 1,000 (laranja),
100 (azul), and 10 (roxo)
cópis de DNA genômico
humano. As curvas
mostram aumento da
fluorescência em oito
amostras replicadas em
cada concentração inicial.
(B) Gráfico da
concentração inicial de
DNA vs. Ciclo demonstram
a natureza quantitativa
dos valores de endpoint.
(R2 = 0.974)
SYBR Green
(sonda de ligação a DNA dupla fita)
* Emite grande fluorescência após ligar-se a DNA
dupla fita
* desvantagem: ligação não-específica
* Requer otimização extensiva
* Amplicons grandes emitem maior fluorescência
Fluoresces when bound
to dsDNA
SYBR Green
(1) No começao da amplificação, a reação contêm DNA desnaturado, primers, e a
sonda. As moléculas não ligadas emitem fluorescência fraca, produzindo um
background queé subtraído durante a análise. A ligação ao DNA dupla fita resulta em
aumento marcante da fluorescência, principalmente durante a elongação da fita.
Durante a desnaturação da molécula do DNA, a fluorescência baixa.
Quando escolher SYBR Green
•Ensaios que não requeiram especificidade dos ensaios
baseados em sonda.
•Screening inicial de diversos experimentos, antes de
passar para ensaios com sonda
* Quando o sistema de PCR está otimizado, sem dímeros de
primers ou amplicons não-específicos, ex. DNA genômico
Quando NÃO escolher SYBR Green
* Ensaios de discriminação de alelos
* Reações multiplex
* Amplificação de transcritos mais raros
* Detecção de patógeno em baixa escala
Princípios do Real-Time
Três métodos de detecção quantitativa:
1. Sondas de Hidrólise
(TaqMan, Beacons, Scorpions)
2. Sondas Hibridizáveis
(Light Cycler)
3. Agentes ligantes ao DNA
(SYBR Green)
Molecular Beacons
Mocellin et al. Trends Mol Med 2003 (www)
Scorpions
Bustin SA. J Mol Endocrinol 2002 (www)
Threshold Cycle
* threshold cycle (CT value) é o ciclo aonde um
aumento significativo na quantidade de amplificado é
primeiramente detectado
•É o parâmetro usado para quantificação
•* CT valor de 40 ou mais significa nenhuma
amplificação
O Que é CT?
O gráfico de amplificação contêm as informações necessárias para a quantificação de DNA ou RNA.
A lina é o nível de detecção ou o ponto a partir do qual a fluorescência atinge um nível maior do
que o do background. A linha é colocada na fase exponencial da amplificação para uma leitura mais
correta. O ciclo no qual a amplificação atinge essa linha é chamado de Cycle Threshold, CT. Esses
dois valores são importantes para a análise de dados.
Van der Velden. Leukemia 2003 (www)
(www)
DRn
* Rn+ é o valor de detecção de reação contendo todos
os componentes (amostra de interesse); Rn- é o valor
de Rn detectada no controle sem amostra (valor basal)
* DRn é a diferença entre Rn+ and Rn-. É um indicador
da magnitude do sinal gerado pelo PCR.
* DRn é plotado contra o número d ciclos para produzir
a curva de amplificação e dar o valor de CT.
O que é DRn?
+Rn
Sample
DRn
Rn
Threshold
No Template
Control
CT
0
10
-Rn
20
cycle number
30
40
O que é DRn?
Nigel Walker, NIEHS (www)
Controle Interno
(Padronização)
* Usar um gene abundante e constantemente expresso
* Os mais amplamente utilizados são os menos
confiáveis
* Melhor correr um teste de validação antes com o
controle interno
* Combinações devem ser utilizadas
Seleção do controle interno
Sabek et al. Transplantation 2002 (www)
Multiplexing
* TaqMan: diferentes sondas para cada fragemtno (FAM,
TET, VIC and JOE)
* SYBR green: diferentes pontos de anelamento para cada
fragmento
Multiplex Real-Time PCR
(fluorescein-labeled molecular beacon)
Detecção Real-time de quatro diferentes
DNAs retrovirais em formato multiplex.
Quatro ensaios são conduzidos em tubos
selados, cada qual com 100,000
moléculas de cada retrovírus. Cada
reação contém quatro sets de primers
específicos para HIV-1, HIV-2, HTLV-I,
and HTLV-II e quatro molecular beacons,
cada um específico para cada amplicons e
marcado com um fluoróforo diferente. Vet
JA et al. PNAS 1999
Multiplex Real-Time PCR
(fluorescein-labeled molecular beacon)
I. Desenvolvimento do ensaio
A. Seleção da sequência
B. Seleção dos primers e sondas
C. Seleção do quencher e controle interno
D. AValidação do ensaio
II. Setup
A. Um ou dois passos no PCR
B. Settings do termociclador
III. Análise de dados
A. Settings do baseline e threeshold
B. Curvas padrões
C. Variabilidade inter- vs intra-ensaio
D. Normalização da amostra
One-Step ou Two-Step PCR
•one-step real-time realiza transcrição reversa e PCR
num mesmo sistema em um mesmo tubo
•* two-step RT-PCR, esses dois passos são realizados
separadamente
Sample Layout
20 unknowns in triplicate, standard curve, NACs and NTC
Interpretação
* Análise da curva de anelamento
* Quantificação absoluta
* Quantificação relativa
Van der Velden. Leukemia 2003
Read SJ et al. J Clin Microbiol 2001
Real-Time PCR Aplicações - I
* Quantificação de expressão gênica
* Controle de qualidade e validação de ensaio
* Biossegurançã e estabilidade do material genômico
* Eifcácia da terapía com drogas e monitoração
* Quantificação viral
* Detecção de patógenos
Real-Time PCR Aplicações- II
* Medidas de danos ao dna (instabilidade de microsatellite)
* Ensaios de exposição a radiação
* Imagem in vivo de processos celulares
* Estudos de DNA Mitocondrial
* Detecção de metilação
* Detecção de inativação de cromossomos (X)
Real-Time PCR Aplicações - III
* Determinação da identidade de loci de HLA de alto
polimorfismo
•Monitoramento de rejeição de transplantes
•* Genotipagem (discriminação de alelos)
- Trissomias e genes de cópia única
- Genótipos com microdeleção
- Haplotipagem
- Análise quantitativa de microsatélites
- Diagnóstico pré-natal através de células fetais
- Diagnóstico de processos carcinogênicos
Allelic Discrimination Using TaqMan Probes
Barrois M et al. Clin Genet 2004