Ca2+-ATPase e Produção de Calor
Daniel M B Lima
Introdução
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Retículo Sarcoplasmático (RS): Principal reservatório intracelular de
Ca2+ em músculo esquelético;
SERCA: bombeia Ca2+ para o interior do RS, as custas de ATP.
Introdução
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Duas regiões distintas, morfologicamente e funcionalmente:
◦ Túbulos longitudinais
 Fração leve (LSR);
 Enriquecida em Ca2+-ATPase;
◦ Cisternas terminais
 Fração Pesada (HSR);
 Contato Direto com os Túbulos T.
Introdução
Introdução
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SERCAs: Conversão de energia química liberada na quebra do ATP
em energia osmótica (transporte de Ca2+) e produção de calor
(termogênese);
SERCA 1
◦ Produz mais calor durante a hidrólise do ATP do que qualquer outra
SERCA;
◦ Encontrada, predominantemente, em musculatura esquelética branca e
tecido adiposo marrom.
Introdução
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SERCA 1: Ciclo catalítico, 2 vias:
◦ Acoplada: Transporte de Ca2+ + Liberação de Calor
◦ Desacoplada: Liberação de Calor
◦ A via desacoplada é muito importante na produção de calor, tanto em grandes
mamíferos quanto humanos adultos;
◦ Em hipotireoidismo e exposição ao frio, duas condições que afetam a termogênese, a
expressão de SERCA 1 está aumentada.
Introdução
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Evidências têm mostrado que o K+ afeta passos intermediários do
ciclo catalítico da SERCA 1;
O presente artigo explora os efeitos do K+ na atividade
termogênica da SERCA 1.
Metodologia
◦ Foram utilizadas vesículas leves e pesadas de retículo sarcoplasmático
isoladas de músculo branco de membro posterior de coelhos.
◦ Antes do uso as vesículas foram diluídas em tampão adequado, para dar
4µM de Ca2+ livre
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Captação de Ca2+
◦ Traços de 45Ca foram incluídos no meio
◦ O meio foi filtrado e a radiação remanescente nos filtros foi avaliada
por cintilação liquida.
◦ Para os experimentos de efluxo, as vesículas foram pré-carregadas com
cálcio, e com o equilíbrio alcançado, KCl foi adicionado ao meio.
Metodologia
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Atividade ATPásica
◦ Medição da liberação de 32Pi de [γ-32P]ATP.
◦ A reação foi interrompida com TCA e o [γ-32P]ATP não hidrolisado foi
retirado com carvão ativado
◦ Duas diferentes ATPases
 Dependente de Mg2+, medida na presença de EGTA
 Dependente de Ca2+, descontando a atividade da anterior
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Calor da Reação
◦ Calorímetro
◦ A Entalpia calorimétrica (ΔHcal ) foi calculada dividindo-se a quantidade
de calor liberado pela quantidade de ATP hidrolisado
 Valores negativos: reação exotérmica
 Valores positivos: reação endotérmica
Metodologia
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Procedimento Experimental
◦ Todos os experimentos foram realizados a 35ºC
◦ Durante um experimento típico, o meio utilizado nos ensaios é dividido
em 3 amostras que são utilizadas simultaneamente para avaliação da
captação de Ca2+, hidrólise de ATP e liberação de calor
◦ Inibidor de ATP sintase foi utilizado a fim de se evitar possível
interferência devido a contaminação.
Resultados
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Efeito do KCl na captação de Ca2+ pela SERCA 1
Resultados
Resultados
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O efeito observado está relacionado ao cátion (K+) ou ao ânion
(Cl-)?
Resultados
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Efeito do KCl no efluxo de Ca2+
Resultados
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KCl provoca diminuição da concentração de equilíbrio de Ca2+
◦ Inibição da atividade de Ca2+-ATPase? Não
Resultados
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Correlação entre as taxas de hidrólise de ATP e produção de calor
◦ Estudos anteriores demonstraram que:
◦ (i) Em leaky LSRs, que não conseguem acumular Ca2+ durante a
hidrólise de ATP, a quantidade de calor liberado por mol de ATP clivado
é 50% menor que em vesículas intactas que acumulam Ca2+.
◦ (ii) Ao contrário, a ΔHcal da hidrólise de ATP não é modificada pelo
acúmulo de Ca2+ em HSRs
◦ Esses ensaios, realizados em meio contendo KCl, foram confirmados.
Resultados
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Utilizando meio sem KCl
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O calor liberado por molécula de ATP clivada é maior.
Resultados
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Efeitos da Valinomicina na captação de Ca2+ e na produção de calor
Resultados
Discussão
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Receptores de rianodina interagem com receptores de
diidropiridina e essa interação física parece ser necessária para o
acoplamento excitação-contração que ocorre em células
musculares de mamíferos;
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Enquanto o potencial de ação se propaga pelo Túbulo T também
ocorre uma mudança nas concentrações de Na+ e K+ nas junções
comunicantes entre esses túbulos e o RS;
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Variações nas concentrações destes íons nessa região podem ser
importantes para aumentar o efluxo de Ca2+ na cisterna terminal;
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Alguns estudos já demonstraram que Na+ e K+ interagem com o
receptor de rianodina, aumentando sua permeabilidade ao Ca2+.
Discussão
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Devido a localização desse receptor predominantemente em HSR,
o efeito do K+ na liberação de Ca2+ poderia ser atribuido à ligação
do K+ no receptor de rianodina;
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Entretanto, isso não explica a diferença na atividade termogênica
encontrada entre vesículas LSR e HSR;
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Alguns estudos já sugeriram que o K+ se liga a Ca2+ ATPase e altera
passos do seu ciclo. De fato, o presente trabalho mostrou
alterações na atividade ATPásica, tanto em HSR quanto LSR
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Outras proteínas associadas, no HSR. O aumento de K poderia
interferir nestas proteínas, que por sua vez atuariam
concomitantemente na Receptor de Rianodina e na SERCA