Elisa: quantificação de proteínas e moléculas
Elisa: quantificação de proteínas e moléculas
Sistema Duplo-Híbrido de Levedura
Sistema Híbrido-Simples: identificar proteínas que ligam ao DNA
Sistema Híbrido-Simples
Sistema Híbrido-Simples
Sistema Híbrido-Simples
1. Reagents interacting with DNA*
(a) Alkylating agents: Dimethyl sulphate, Mitomycin C, Nitrogen and sulphur mustards
(b) Intercalating agents:
Acridine dyes, Actinomycins, Adriamycin, Anthracenes
Benzpyrene, Ethidium bromide, Propidium diiodide
(c) Intertwining agents
Distamycin,
Netropsin
2. Analogues of bases,
Acyclovir ,Adenine /3-1-D-arabinoside, Amethopterin
Aminopterin, 2-aminopurine, Aphidicolin, 8-azaguanine, Azaserine
6-azauracil, 2'azido-2'-deoxynucleosides, 5-bromodeoxycytidine
Cytosine /3-1-D-arabinoside, Diazooxynorleucine, Dideoxynucleosides
5-fluorodeoxycytidine, 5-fluorodeoxyuridine, 5-fluorouracil, Hydroxyurea
6-mercaptopurine
3. Inhibitors of topoisomerases: Coumericin, Nalidixic acid, Novobiocin, Oxolinic acid
4. Inhibitors of cell division: Colcemid, Colchicine, Vinblastine , Vincristine
Protein synthesis inhibitors
cycloheximide: [active] 20mM, Boe 103675
chloramphenicol: [active] 100mM, Sigma
anisomycin: [active] 60mM, Sigma A9789
2nd messengers/inhibitors
dibut cA/GMP: [active] 1mM, Sigma B1381
Ca ionophore: [active] 5mM, Sigma 7272
PMA: [active] 10mM,
Froskolin: [active] 10mM,
GFP: green fluorescent protein
Microscopia confocal: estudo das células vivas
Actina F nas células da pele do bulbo da cebola: transformação transiente utilizand
A actina fundida a proteína gfp
Ela está presente nas invaginações e envolta do núcleo
Invaginações e dinâmica do núcleo
Reconstrução tridimensional da topologia do retículo endoplasmático
Nas plantas transgênicas expressando gfp
Luciferinas
Luciferinas
Luciferinas
Luciferinas
Luciferinas
Planta transgênica
Promotor da
GA20 ox fundido
ao gene da luciferina
Pulverização com
luciferina
Câmera CCD
para fluorescencia:::
superimposição de
imagens
Luciferinas: uso simultâneo de diferentes
Luciferinas: Uso
Luciferinas: Uso
Luciferinas: Uso
Aequoporina:
Estudo das alterações na
Concentração de cálcio
In vivo e em tempo real,
Por um método não-destrutivo
Frio: “manchas” de aumento de calcio
em resposta a baixas temperaturas
Tempo após redução do Ca2+ do meio e o citosólico
e fechamento do estômato
Fluoróforos utilizados para medir a [Ca2+] intracelular
Fluoróforo
indo-1
Efeito Luz vermelha:::protoplasto
de folha
de trigo:::Fluro-3:::tempo após
Efeito do GA e do ABA nos níveis de Ca2+ em protoplastos
adição do fluoróforo
da camada de aleurona da cevada
Tipos: 1) Fuoróforos monovalentes (single-wavelenghth dyes): continuam a ter
a fluorescência no mesmo comprimento de onda
Fluorescência dependente da [fluoróforo]: determinação semi-quantititiva do Ca2+:
Ex: fura-3 e “calcio-verde”:semi-quantitativos, precisam de luz de menor intensidade (menos dano)
2) Fuoróforos polivalentes (ratio dyes): mudam o comprimento de onda
da fluorescência quanto excitados
Fluorescência independente da [fluoróforo]: precisão na determinação do Ca2+:
Ex: fura-2 e indo 1 (polivalentes):precisão na determinação do Ca2+:
precisam maior intensidade luminosa (maior dano;experimentos mais curtos)
Fura2:::gradiente de Ca2+ citosólico:::abundância canais de calcio na extremidade
Estudo da expressão diferencial dos genes:
Confecção de Bibliotecas
de Subtração
Checando a eficiência
da subtração
Confirmando a presença de uma proteína em um compartimento citosólico
Hibridização in situ: FISH (Fluorescent In Situ Hybridization)
Mapeamento de genes
Estudo da estrutura do cromossoma
Estudos citogenéticos: translocação, recombinação, etc.
Manipulação
Efeito
da liberação
de substâncias
do ABA “enjaulado”
ativas “enjauladas”
após microinjeção
(caged) em células-guarda
Nucleotídeos
Queladores
Mensageiros secundários
Peptídeos
Manipulação de cálcio
Enjaulado: calcio controla
a orientação de crescimento
do tubo polínico
(crescimento
só2+
noque
ápice)
Canais de Ca
Respondem ao IP3 no
estômato, pólem, etc.
Formas de enjaular um peptídeo ou proteína
Outros sistemas modelos opcionais à Arabidopsis
Phiscomitrella
Phiscomitrella
Phiscomitrella
Phiscomitrella
GFP-talina
Estudo da Estrutura de um promotor
1) Análise por deleção
Estudo da Estrutura de um promotor
2) Análise por mutagênese
Estudo da Estrutura de um promotor
3) Análise por transativação