AVALIAÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO E FONTE DE CARBONO NA
PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA LEVANA DE Bacillus Subtilis
Natto
Tamires Minucelli (PIBIC/CNPq/UEL), Maria Antonia P. Colabone Celligoi
(Orientadora), e-mail: [email protected].
Universidade Estadual de Londrina /Centro de Ciências Exatas/
Departamento de Bioquímica / Londrina, PR.
Área: Ciências Biológicas e sub-área: Microbiologia Industrial e de
Fermentação.
Palavras-chave: Bacillus subtilis, levana, massa molar.
Resumo
Levana é um polímero de frutose que pode ser obtido por fermentação da
sacarose pela bactéria Bacillus Subtilis Natto. Apresenta diversas aplicações
industriais quando as condições de fermentação são adequadas. O objetivo
desse trabalho foi avaliar a concentração, a fonte de carbono e o tempo de
fermentação na produção de levana. Os resultados demostraram que a
condição de máxima produção foi em meio de sacarose com 24 horas de
fermentação, atingindo uma produtividade de 1,07g/L.h -1 .
Introdução
A produção de metabólicos microbianos por via fermentativa é uma
alternativa que pode reduzir custos e otimizar a produção para uso industrial.
Microrganismos naturalmente produzem uma variedade de carboidratos:
oligossacarídeos e polissacarídeos, dentre eles a levana que pode ser
produzida por algumas bactérias durante a fermentação de sacarose.
Apresenta as características dentre elas a de ser um pó branco, não
hidroscópico, solúvel em água quente e fria, não tóxica, não mutagênica,
inodora e insípida, o que a torna um polímero com grande potencial de
aplicação na indústria de alimentos, farmacêutica e de cosméticos, também
podendo ser utilizada na medicina como agente hipocolesterêmico,
anticarcinôgenico, imunoregulador e antiinflamatório.
Para uma boa produção de levana as condições de fermentação
como concentração inicial de açúcar no meio de cultivo, a temperatura e
tempo de cultivo são importantes (Ananthalakhmy; Gunasekaran, 1999).
Para estudar diversos fatores associados o planejamento estatístico do
experimento se faz necessário para uma produção satisfatória.
O trabalho teve como objetivo estudar o efeito da fonte e
concentração de açúcar inicial utilizado nos meios de fermentação (frutose e
sacarose), e os tempos de fermentação empregados para a produção de
levana por Bacillus Subtilis Natto.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
Materiais e métodos
O microrganismo: Bacillus Subtilis Natto, isolado no Departamento de
Bioquímica e Biotecnologia e identificado pela Fundação André Tosello
Pesquisa e Tecnologia – Campinas, SP.
Os meios de fermentação (g.L-1): Sacarose ou frutose 50 e 100 1,
acrescidos dos demais componentes: Extrato de levedura 2,0; KH2PO4 1,0,
(NH4)2SO4 3,0; MgSO4.7H2O 0,6 ; MnSO4 0,2.
Os inóculos foram padronizados com 0,2 gL -1 de células. Ao término
da fermentação, os cultivos foram interrompidos por centrifugação a 9000
rpm, por 15 minutos a 4°C, para a separação da biomassa e do
sobrenadante. A biomassa foi determinada por turbidimetria e comparada a
uma curva de biomassa em g/L.
Do sobrenadante foi precipitada a levana, utilizando etanol 90% a
4°C na proporção de 3:1 (etanol: sobrenadante) por 12 horas. A levana foi
separada por centrifugação a 14000 rpm por 15 minutos, a 4 oC. A levana foi
hidrolisada por HCl 1N por uma hora a 100°C, resfriada e neutraliza com
0,1mL de NaOH 2N. A concentração desse EPS foi estimado por açúcares
redutores pelo método Somogyi (1952) e Nelson (1944),.
O consumo de açúcares foi pela determinação de açúcares totais das
fermentações pelo método fenol-sulfúrico (DUBOIS et al., 1956). A levana
precipitada foi dialisada e liofilizada. Esta levana foi submetida a
cromatografia de coluna de exclusão utilizando sephadex gel, para a
avaliação da sua massa molar. Os padrões com massa molar
correspondente a 50,000; 150.00, 410.000, 670.000 e 1.400.000 Da foram
usados como referências.
Resultados e Discussão
A partir dos resultados é possível observar que as maiores
produções de levana ocorreram nos meios contendo sacarose na
concentração de 100 g.L-1 e que não há grande variação de produção em
relação ao tempo. As melhores produções foram 25,74 g.L -1 em 24 horas e
21,31 g.L-1 em 48 horas (Tabela 1). A produtividade caiu consideravelmente
de 1,072 g/L.h-1 para 0,444 g/L.h-1 com o aumento do tempo. Quanto a
frutose, não é consideranda uma opção viável para a produção desse EPS,
pois apesar do consumo de açúcar ter sido maior no meio com frutose esse
monossacarídeo não convertido à levana, uma vez que sua produção não
ultrapassou 3,1 g/L.h-1. A enzima levanasacarase utiliza preferencialmente a
sacarose e a frutose não estimulou a produção.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
Tabela 1: Condições dos meios de cultivo e resultados das
fermentações
Meio
1
2
3
4
5
6
7
8
Açúcar
Condiçoes
Concentração
g.L-1
Tempo
Sacarose
Sacarose
Frutose
Frutose
Sacarose
Sacarose
Frutose
Frutose
100
100
100
100
50
50
50
50
24h
48h
24h
48h
24h
48h
24h
48h
Aç. Totais
consumidos
g.L-1
31,23
28,82
58,08
52,42
20,11
16,36
23,53
28,44
Levana
g.L-1
25,7
21,3
2,6
3,1
7,9
5,4
1,1
1,1
Os padrões tiveram sua eluição no tubo 14 (1.400.000 Da) e no tubo 8 a de
baixa molar (50.000 Da). Os cromatogramas revelaram predominante levana
(Fig. 1) de 1.400.000 Da de alto peso molecular, mas que com o aumento do
tempo a massa molecular diminui. Os meios com frutose predominam
levanas de 50.000 Da (Fig.2), indicando presença de oligossacarídeos
(FOS) e confirmando que a frutose não é utilizada na síntese da levana.
1,4
Abs
1,2
1
meio 1
0,8
meio 2
0,6
meio 5
0,4
meio 6
0,2
0
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
21
23
25
27
29
Tubos
Fig. 1 - Resultado da cromatografia dos meios contendo sacarose
2
Abs
1,5
meio 3
meio 4
1
meio 7
meio 8
0,5
0
1
3
5
7
9
11
13
15 17
Tubos
19
21
23
25
27
29
Fig. 2 - Resultado da cromatografia dos meios contendo frutose
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Conclusões
A maior produção de levana foi de 25,74 g.L -1 correspondendo a uma
produtividade de 1,072 g/L.h -1 no meio contendo 100 g.L-1 de sacarose em
24 horas, o aumento do tempo para 48 horas reduziu a produtividade para
0,444 g/L.h-1. A frutose não é viável para produção de levana uma vez que a
enzima levanasacarase preferencialmente utiliza sacarose. A massa molar
predominante foi de 1.400.000 Da nos meios contendo sacarose,
independente da concentração (100 g/L.h -1 ou 50 g/L.h-1) e do tempo de
fermentação (24 ou 48 horas). O meio contendo frutose a massa molar
predominante foi de 50.000 Da, o que caracteriza o aparecimento de
oligossacarídeos de frutose.
Agradecimentos
À minha orientadora pela oportunidade de trabalho e à Fundação Araucária
pelo apoio financeiro.
Referências
Ananthalakshmy, V.K.; Gunasekaran, P. Optimization of levan production by
Zymomonas mobilis. Brazilian Archives of Biology and Technology. 1999, 42,
3, 291.
Calazans, G. M. T; Lima, R.C; França, F.P.de e Lopes, C. E. Molecular
Weight and antitumour activity of Zymomonas mobilis levans. International
Journal of Biological Macromolecules. 2000, 2, 245.
Ernandes, F. M. P. G; Garcia-Cruz, C. Zymomonas mobilis: um
microrganismo. Semina: Ciências Agrárias. 2009, 30, 2, 361.
Han, Y. W. Microbial levan. Adv. Appl. Microbiol. 1990, 35, 171.
Nelson, N. A photometric adaptation of the Somogy method for determination
of glucose. Biochemistry. 1944, 84, 375.
Somogy, M. A. A new reagent for determination of sugar. Journal Biology
Chemistry. 1952,160, 61.
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