TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
CARTÃO DE CONSULTA RÁPIDA
Para obter as orientações relativas à segurança e perigos biológicos, consulte a secção “Safety” no TrueScience™ RespiFinder®
Identification Panels Protocol (PN 4460429). Para obter informações sobre avisos e precauções, consulte o TrueScience™ RespiFinder®
Identification Panels Product Insert (PN 4460486). Para cada produto químico, leia as fichas de dados de segurança (SDS) e siga as
instruções de manipulação. Use óculos, vestuário e luvas de protecção adequados. Para obter mais informações sobre os
TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels, visite www.appliedbiosystems.com/respifinderlit. Para transferir os guias do
utilizador dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels, visite www.appliedbiosystems.com/respifinderlit e, em seguida,
seleccione o separador Literature/Support.
Este cartão de consulta rápida abrange:
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Painéis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
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Descrição do produto e princípios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
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Aplicação. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
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Obter assistência. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
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Antes de começar: procedimentos únicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
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Procedimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Painéis
Este cartão de consulta rápida abrange os seguintes TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels:
Painel
Armazenamento
4460381
TrueScience™ RespiFinder® 15 Viral Identification Panel
50 testes
4460382
TrueScience™
50 testes
RespiFinder®
19 Pathogen Identification Panel
Descrição do produto e princípios
Os TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels utilizam um teste PCR multiplexado para detectar e diferenciar os patogéneos passíveis
de causar infecções do tracto respiratório. O ensaio dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels inclui uma transcrição reversa
combinada com um passo PCR (para converter o ARN viral em cADN e para amplificar o alvo ADN/cADN), um passo de hibridização da
sonda e um passo de ligação/amplificação da sonda. Encontra-se incluído no ensaio um Internal Amplification Control (IAC) para distinguir
as amostras verdadeiro-negativo e as amostras falso-negativo causadas pela degradação dos ácidos nucleicos, inibição do PCR ou erros
de manuseamento. Os alvos podem ser detectados através da análise dos fragmentos calibrados do ADN utilizando a electroferese capilar.
Para mais informações, consulte o TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels Protocol (PN 4460429).
Painel
Patogéneos detectados
Número de
conjuntos de
sondas alvo
TrueScience™ RespiFinder® 15
Viral Identification Panel
14 vírus ARN e 1 vírus ADN
15 mais IAC
TrueScience™ RespiFinder® 19
Pathogen Identification Panel
14 vírus ARN, 1 vírus ADN e 4 bactérias
19 mais IAC
Intervalo de
tamanhos de
sondas
163 a 498
nucleótidos
Aplicação
Os TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels são testes qualitativos com múltiplos parâmetros que se destinam a ser utilizados na
detecção e identificação simultânea de patogéneos respiratórios comuns em ácidos nucleicos totais purificados.
Cartão de Consulta Rápida dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
A amostra de entrada é constituída por ácidos nucleicos totais extraídos e purificados através da colheita de exsudado nasofaríngeo,
aspirações nasais, expectoração e lavagens broncoalveolares (LBA) de pacientes suspeitos de ter infecções do tracto respiratório. A
preparação de amostras clínicas é um processo separado fora do âmbito dos painéis; utilize métodos ou produtos adequados para
manusear as amostras, extrair e purificar os ácidos nucleicos.
Os TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels auxiliam o diagnóstico de infecções do tracto respiratório quando utilizados em
conjunto com outros resultados laboratoriais e clínicos. Os resultados negativos não indicam necessariamente a ausência de uma infecção
bacteriana ou viral do tracto respiratório; os resultados negativos não devem ser utilizados por si só na tomada de decisões relativamente
ao diagnóstico, terapêutica ou tratamento. Os resultados positivos não excluem a existência de uma co-infecção de outros patogéneos. O(s)
patogéneo(s) detectado(s) podem não ser a causa definitiva de doença. Outras análises laboratoriais e a avaliação da apresentação clínica
devem ser incorporadas no diagnóstico final. As características do comportamento funcional foram estabelecidas com base nos painéis
de EQA validados a partir de www.qcmd.org. O produto destina-se a ser utilizado por profissionais de laboratório para utilização com certos
instrumentos e software de análise de dados da Life Technologies.
Obter assistência
Para obter as informações mais recentes sobre serviços e assistência técnica para todos os locais, aceda a www.appliedbiosystems.com
e, em seguida, clique no link para Support ou contacte o representante local da Life Technologies.
Antes de começar: procedimentos únicos
Preparar as estações de trabalho
Para evitar a contaminação, recomenda-se veemente que realize as actividades experimentais em áreas separadas. Consulte o
TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels Protocol (PN 4460429) para mais informações.
Programar o termociclador
Programe o termociclador utilizando os três programas que se seguem:
1. Programa de transcrição reversa
e PCR
3. Programa de ligação e PCR
Tempo
Fase
Temp
Tempo
Fase
Temp
30:00
Desnaturação
do ADN
98 °C
10:00
Ligação da
sonda
54 °C
15:00
95 °C
15:00
Hibridização
da sonda
60 °C
60:00
Desnaturação
inicial
95 °C
2:00
94 °C
00:30
Paragem
60 °C
0:30
00:30
Ciclos:
33 ciclos
94 °C
55 °C
60 °C
0:30
72 °C
01:00
Prossiga
directamente
para o passo
seguinte
72 °C
1:00
20 °C
Prossiga
directamente para
a electroferese
capilar ou
armazene†
Fase
Temp
Transcrição
reversa
50 °C
Activar o Taq
de arranque
a quente
Ciclos:
30 ciclos
Paragem
Tempo
2. Programa de hibridização
de sondas
20 °C
(mm:ss)
(mm:ss)
Paragem
Prossiga
directamente
para o passo
seguinte ou
armazene†
(mm:ss)
† Armazene a 4 °C durante um período máximo de 1 semana ou a −20 °C durante períodos mais prolongados.
Configurar o software de recolha de dados
Antes de utilizar os TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels pela primeira vez, configure o 3130/3130xl Data Collection Software
v3.0 ou v3.1, ou ainda o 3500 Data Collection Software v1.0. Para obter as instruções, consulte TrueScience™ RespiFinder® Identification
Panels Software Setup and Data Analysis User Guide (PN 4460428). Para transferir o guia do utilizador, visite www.appliedbiosystems.com/
respifinderlit e, em seguida, seleccione o separador Literature/Support.
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Cartão de Consulta Rápida dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
Procedimento
1
Extrair os ácidos
nucleicos totais e
adicionar o Internal
Amplification Control
(IAC) às amostras
lisadas
a. Recolha amostras clínicas. Consulte o TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels Protocol
(PN 4460429) para mais orientações.
b. (Recomendado) Proceda ao pré-tratamento das amostras caso estas se encontrem viscosas
e/ou contenham componentes celulares sólidos. Consulte o TrueScience™ RespiFinder®
Identification Panels Protocol (PN 4460429) para mais informações.
c. Extraia os ácidos nucleicos totais (ARN e ADN) utilizando um método de extracção adequado e
seguindo as instruções do fabricante. Consulte o TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
Protocol (PN 4460429) para mais informações sobre os métodos de extracção validados. Na
maior parte dos métodos de extracção, recomenda-se a utilização de 200 µL de material de
amostra para eluição em 100 µL do tampão de eluição.
d. Após a incubação da amostra com o tampão de lise, adicione o Internal Amplification Control
(IAC) e, em seguida, misture bem. Adicione 5 µL de IAC para cada 100 µL do tampão de eluição.
IMPORTANTE! Em todos os protocolos de extracção, adicione o IAC após concluir a incubação
da amostra com o tampão de lise. Se adicionar o IAC à mistura de amostra e tampão de lise
antes de concluir a incubação, os RNases e DNases da amostra podem quebrar o IAC, causando
falsos negativos. O tampão de lise inibe os RNases e DNases e evita a degradação do IAC.
2
Preparar e pipetar a
RT/PCR Mix
a. Descongele os seguintes itens e, em seguida, mantenha-os no gelo.
• Modelo de ácido nucleico total (ARN e ADN)
• Pre-Amplification Primer Mix
• Dilution Buffer
• dNTP Mix
• 5✕ RT-PCR Buffer
b. Prepare uma RT/PCR Mix suficiente para o número de amostras que pretende processar mais
um volume adicional para eventuais perdas que ocorram durante a pipetagem. Ao preparar a
mistura, siga as seguintes orientações de manuseamento de reagentes:
• Para a RT-PCR Enzyme Mix: Remova a mistura do armazenamento imediatamente antes da
pipetagem. Centrifugue a mistura durante 5 segundos e, em seguida, misture pipetando
suavemente para cima e para baixo. Utilize pontas de pipeta de baixa retenção durante o
manuseamento da mistura. Volte a armazenar a mistura imediatamente após a sua
utilização.
• Para todos os outros reagentes e para o modelo de ácido nucleico total: Imediatamente
antes da sua utilização, coloque os tubos no agitador vórtex e centrifugue-os brevemente.
Componente da RT/PCR Mix
Volume por reacção
Dilution Buffer
5,5 µL
5✕ RT-PCR Buffer
5,0 µL
Pre-Amplification Primer Mix
2,5 µL
dNTP Mix
1,0 µL
RT-PCR Enzyme Mix
1,0 µL
Volume total da RT/PCR Mix por
reacção
15 µL
c. Coloque a RT/PCR Mix no agitador vórtex por breves momentos, dispense 15 µL em tubos PCR
de 0,2-mL e, em seguida, feche os tubos. Mantenha os tubos PCR no gelo.
3
Cartão de Consulta Rápida dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
3
Preparar e pipetar a
Probe Hybridization Mix
a. Descongele o Dilution Buffer, Hybridization Buffer, e a Probe Mix e, em seguida, mantenha-os
no gelo.
b. Prepare uma Probe Hybridization Mix suficiente para o número de amostras que pretende
processar mais um volume adicional para eventuais perdas que ocorram durante a pipetagem.
Nota: Imediatamente antes da sua utilização, coloque os reagentes no agitador vórtex e
centrifugue-os.
Componente da Probe Hybridization Mix
Volume por reacção
Dilution Buffer
3,0 µL
Hybridization Buffer
1,5 µL
Probe Mix
1,5 µL
Volume total da Probe Hybridization Mix por
reacção
6,0 µL
c. Pipete 6 µL da Probe Hybridization Mix para tubos PCR novos de 0,2-mL, feche os tubos e, em
seguida, mantenha os tubos PCR a 4 °C até à sua utilização.
4
Configurar e realizar a
transcrição reversa e
PCR
a. Adicione 10 µL de modelo de ácido nucleico total a cada tubo PCR que contenha 15 µL de
RT/PCR Mix. Misture bem o conteúdo pipetando suavemente para cima e para baixo e, em
seguida, centrifugue brevemente.
Mantenha os tubos PCR no gelo até que o termociclador esteja pré-aquecido.
Nota: Se os procedimentos laboratoriais internos da sua instituição exigirem que realize um
controlo negativo, adicione 0,25 µL de Internal Amplification Control a 10 µL de água sem DNase/
RNase e, em seguida, adicione esta mistura a um tubo PCR que contenha 15 µL de RT/PCR Mix.
b. Inicie o programa de transcrição reversa/termociclador PCR. Quando a temperatura atingir os
50 °C, coloque os tubos PCR no termociclador.
5
Configuração e
execução da
hibridização da sonda
a. Adicione 100 µL de água esterilizada (não fornecida) a cada transcrição reversa/reacção PCR e,
em seguida, misture bem pipetando suavemente para cima e para baixo.
b. Adicione 2 µL de transcrição reversa/reacção PCR diluída a cada tubo que contenha 6 µL de
Probe Hybridization Mix e, em seguida, centrifugue brevemente.
c. Coloque os tubos PCR no termociclador e, em seguida, execute o programa de hibridização da
sonda.
IMPORTANTE! Durante os últimos 60 minutos da hibridização da sonda, prepare a TwoStep
Mix. Após a hibridização da sonda, efectue imediatamente o processamento de ligação e do PCR.
Mantenha os tubos PCR no termociclador a 60 °C até estar preparado para prosseguir com a
ligação e o processamento do PCR.
6
(Durante a hibridização
da sonda) Preparar a
TwoStep Mix
Durante os últimos 60 minutos do processamento de hibridização da sonda, prepare a TwoStep Mix:
a. Descongele o TwoStep Buffer e, em seguida, mantenha-o no gelo.
b. Prepare uma TwoStep Mix suficiente para o número de amostras que pretende processar mais
um volume adicional para eventuais perdas que ocorram durante a pipetagem. Mantenha a
mistura no gelo até à sua utilização. Ao preparar a mistura, siga as seguintes orientações de
manuseamento de reagentes:
• Para a Ligase Enzyme e Taq Polymerase: Remova cada reagente do armazenamento
imediatamente antes da pipetagem. Centrifugue cada reagente durante 5 segundos e, em
seguida, misture cada reagente pipetando suavemente para cima e para baixo. Utilize pontas
de baixa retenção durante o manuseamento destes reagentes. Volte a armazenar os
reagentes imediatamente após a sua utilização.
4
Cartão de Consulta Rápida dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
• Coloque a mistura no agitador vórtex e centrifugue brevemente o TwoStep Buffer antes da
pipetagem.
Componente da TwoStep Mix
Volume por reacção
TwoStep Buffer
30,6 µL
Ligase Enzyme
1,0 µL
Taq Polymerase
0,4 µL
Volume total da TwoStep Mix por reacção
7
(Imediatamente após a
hibridização da sonda)
Configurar e executar a
ligação e o PCR
32,0 µL
Imediatamente após o do processamento de hibridização da sonda:
a. Pare o programa de hibridização da sonda e inicie imediatamente o programa de ligação e de
PCR.
b. Quando o termociclador atingir uma temperatura de 54 °C, prima Pause para manter a
temperatura do termociclador nos 54 °C.
c. Prepare as reacções de hibridização da sonda para a ligação e o PCR.
1. Remova as reacções de hibridização da sonda do termociclador.
2. Adicione 32 µL de TwoStep Mix por cada 8 µL de reacção de hibridização da sonda.
3. Coloque os tubos novamente no termociclador.
Nota: Se estiver a processar um elevado número de reacções, realize o passo 7c por lotes. Por
exemplo, se estiver a utilizar 8-tubos em tiras, remova 8 reacções, adicione a TwoStep Mix e,
em seguida, substitua os tubos no termociclador antes de remover as 8 reacções seguintes.
d. Reinicie imediatamente o programa de ligação e de PCR interrompido.
8
Realizar o processo de
electroforese capilar
a. Combine um padrão de tamanho, formamida e produto PCR:
1. Combine os seguintes itens e misture bem. Prepare um volume suficiente para o número
de amostras que pretende processar mais um volume adicional para eventuais perdas que
ocorram durante a pipetagem:
Componente da Size Standard Mix
Volume por reacção
(produto PCR ou
reference marker)
GeneScan™ 600 LIZ™ Size Standard (PN 4366589)
0,5 µL
Hi-Di™ Formamide (PN 4311320)
10,0 µL
Volume total da Size Standard Mix por reacção
10,5 µL
2. Numa placa óptica de 96 poços, pipete 10,5 µL da Size Standard Mix em cada um dos
números necessários de poços.
3. (Recomendado) Pipete 1 µL do Reference Marker (FAM™) num dos poços que contenha a
Size Standard Mix. Utilize a pipeta para misturar.
4. Para cada produto PCR de amostra:
• Dilua 5 µL de produto PCR de amostra em 45 µL de água desionizada.
• Pipete 1 µL do produto PCR de amostra diluído para um poço que contenha a Size
Standard Mix e, em seguida, utilize a pipeta para misturar.
Nota: Em alguns casos (por exemplo, numa carga viral elevada), pode ser necessário diluir
ainda mais o produto PCR para evitar picos fora da escala. Consulte o TrueScience™
RespiFinder® Identification Panels Protocol para mais informações.
5. Sele a placa com uma tampa adequada.
5
Cartão de Consulta Rápida dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
b. Processar a placa de amostra
1. Centrifugue a placa a 1000 ✕ g por 10 segundos para que o líquido fique no fundo dos poços
e para remover as bolhas de ar.
2. Carregue a placa no analisador genético, configure o software de recolha de dados como
descrito no TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels Software Setup and Data Analysis
User Guide (PN 4460428) e, em seguida, ligue a placa e inicie o processamento.
9
Analisar e interpretar os
dados
Proceda à identificação do estado do patogéneo candidato analisando os dados utilizando as
definições de análise, os painéis e os conjuntos de binários recomendados. Para obter instruções,
consulte o TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels Software Setup and Data Analysis User Guide
(PN 4460428).
A Life Technologies recomenda que cada laboratório desenvolva os seus próprios procedimentos e
critérios de interpretação e criação de relatórios.
6
Cartão de Consulta Rápida dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
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Cartão de Consulta Rápida dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels
Not for sale in U.S.A.
Declaração de renúncia de responsabilidade
Os resultados obtidos com estes ou outros painéis de diagnóstico devem ser utilizados e interpretados apenas no contexto do cenário clínico geral. A Life Technologies não aceita qualquer
responsabilidade por quaisquer decisões clínicas tomadas.
A Life Technologies não apresenta este guia como um resumo completo de todos os resultados possíveis derivados da utilização dos TrueScience™ RespiFinder® Identification Panels. Este
guia destina-se a ser utilizado apenas como um auxiliar de memória. Não se destina a ser utilizado em qualquer interpretação clínica dos resultados do ensaio. Os laboratórios devem interpretar
e efectuar relatórios dos resultados do ensaio de acordo com os seus próprios procedimentos desenvolvidos a nível local.
Information in this document is subject to change without notice.
APPLIED BIOSYSTEMS DISCLAIMS ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY OR
FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE. TO THE FULLEST EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALL APPLIED BIOSYSTEMS BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY,
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THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF, WHETHER OR NOT FORESEEABLE AND WHETHER OR NOT APPLIED BIOSYSTEMS IS ADVISED OF THE POSSIBILITY
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OS TRUESCIENCE™ RESPIFINDER® IDENTIFICATION PANELS SÃO FORNECIDOS PARA TESTES DE DIAGNÓSTICO PROFISSIONAL IN VITRO. ESTE PRODUTO NÃO FORNECE UMA LICENÇA
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