SEQUENCIAMENTO DE DNA NO LABORATÓRIO DE BIOTECNOLOGIA DA UNIVERSIDADE
CATÓLICA DE BRASÍLIA
O Laboratório de Biotecnologia da pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
da Universidade Católica de Brasília realiza sequenciamento de DNA para pesquisadores
vinculados a universidades e instituições de pesquisa. Estamos utilizando o seqüenciador ABI
3130xl da Applied Biosystems. Seguem abaixo algumas normas para a utilização dos serviços.
1.
Amostra.
Amostras de DNA produto de PCR ou mini-prep com qualidade e quantidade suficientes
para garantir boas seqüências. Produtos de mini-prep devem ser ressuspensos em água Milli-Q.
A purificação e quantificação dos produtos antes da reação de sequenciamento são de
responsabilidade do pesquisador.
Purificação de produtos de PCR:
Como regra geral, sugerimos purificação com enzimas exo-sap.
Se em gel de agarose 2% a reação apresentar uma única banda bem definida e sem resto de
primer aparente, pode-se tentar o sequenciamento direto. Mas a opção e responsabilidade são do
pesquisador solicitante.
Quantidades de amostra sugeridas pelo fabricante do kit de seqüenciamento:
(Observar volume máximo – ver item 3).
Template
Quantity
PCR product:
100–200 bp
1–3 ng
200–500 bp
3–10 ng
500–1000 bp
5–20 ng
1000–2000 bp
10–40 ng
>2000 bp
20–50 ng
Single-stranded
25–50 ng
Double-stranded
150–300 ng
Cosmid, BAC
0.5–1.0 μg
Bacterial genomic DNA
2–3 μg
2.
Primers.
O laboratório dispõe apenas dos primers universais M13 F, M13 R, T7 e SP6. Primers
específicos devem ser enviados já misturados às amostras numa quantidade final de 3.2 pmol
por reação (observar volume máximo – ver item 3).
A temperatura de anelamento padrão utilizada no programa para a reação de
sequenciamento é 50ºC. Casos de primers específicos com temperatura muito diferente desta
devem ser informados no pedido.
3.
Volume máximo.
O volume final de primer + DNA deve ser igual a 7,0 µl. Devendo ser completado com
água milliQ autoclavada.
No caso de uso dos primers universais do laboratório, o volume de DNA + água enviado
deve ser de 5,5 µl e deve-se informar qual o primer a ser utilizado.
4.
Identificação das amostras.
Para evitar erros de identificação, as amostras devem ser entregues em placas de PCR ou
tubos de 1,5 ml ou 0,2 ml (tampa chata) numerados de 1 até 96. As amostras serão aplicadas em
placas, por colunas (1=A1 2=B1....8=H1; 9=A2....16=H2;.............96=H12). A correspondência
dessa numeração com a identificação pessoal é de responsabilidade do pesquisador.
Devem ser informados o conteúdo e o volume dos tubos/placa, e-mail e telefones de contato do
responsável pelas amostras.
5.
Envio das amostras.
As amostras devem ser entregues no seguinte endereço:
Alessandra Reis
Laboratório de Biotecnologia
Pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia
Universidade Católica de Brasília
SGAN 916 - CEP: 70 790-160
Brasília – DF
Pesquisadores fora de Brasília podem enviar as amostras por Sedex (pode ser à temperatura
ambiente).
6.
Resultados
Os resultados serão enviados por e-mail no formato .ab1 e os eletroferogramas poderão ser
visualizados, por exemplo, pelo software Chromas http://www.technelysium.com.au/chromas.html.
Todos os resultados são acompanhados por uma sequência controle que foi preparada nas
mesmas condições e correu no mesmo gel das amostras em questão.
7.
Prazos
A estrutura do laboratório atende também à demanda interna da Universidade e os pedidos
são intercalados, respeitando-se a ordem de chegada. Faremos o possível para que o resultado
de seja entregue em até uma semana. Pedidos com número insuficiente para fechar uma injeção
(menos de 16) não tem previsão de entrega, já que devem aguardar este número ser completado
por amostras de outros pesquisadores.
8.
Custos
O valor cobrado cobre as despesas com reagentes utilizados, mão-de-obra dos técnicos,
energia elétrica e manutenção/desgaste dos equipamentos.
Reação de sequenciamento, clean-up e injeção no sequenciador: R$ 12,00/seqüência
Apenas injeção no seqüenciador (caso o solicitante faça as reações utilizando kit BigDye V3.1 da
Applied Biosystems e a purificação da reação de seqüenciamento): R$ 6,00/seqüência.
Com exceção de casos de comprovação problemas no procedimento técnico no
Laboratório de Sequenciamento (confirmados pela amostra controle), mesmo as seqüências de
qualidade insatisfatória serão cobradas. Não nos responsabilizamos por seqüências ruins devido à
qualidade das amostras ou problemas com o primer.
9.
Pagamento
Como não emitimos nota fiscal, o pagamento deve ser feito preferencialmente na forma de
reagentes e plásticos para consumo no laboratório. O valor total do serviço é convertido nesses
itens de acordo com cotação obtida na data do pagamento e os produtos e marcas são definidos
pela responsável pelo laboratório, em acordo com o pesquisador.
10.
Maiores esclarecimentos.
Alessandra Reis
E-mail: [email protected]
Fones: (61) 3448 7154 – Sala
(61) 3448 7183 – Laboratório de sequenciamento
(61) 3448 7213 - Laboratório geral.