Cromatografia Liquida - CLAE
UNISUL
ANÁLISE INSTRUMENTAL
Profa. Denise Esteves Moritz
O que é Cromatografia ?
Definição:
 A cromatografia é uma técnica de separação
na qual os componentes a serem separados
de uma mistura migram entre duas fases
sendo uma fase móvel e a outra estacionária.
 A natureza química e física dos componentes
da mistura definem o grau de afinidade entre
as duas fases, acontecendo o fenômeno de
migração diferencial .
O que é Cromatografia a Líquido
HPLC?
Definição:
Na técnica de cromatografia a líquido a
fase móvel é um líquido e a fase
estacionária é um sólido .
O processo cromatográfico acontece na
fase líquida , sendo que os componentes da
amostras devem estar dissolvidos.
Instrumentação para HPLC
CLAE -HPLC
Fase móvel
Fase estacionária
(amostra)
(Componentes retidos)
Migrações diferenciais
Analitomov
⇋
Analitoest
K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de partição
INSTRUMENTAÇÃO
MIXER
detector
injector
pump
Fase móvel
column
oven
One pump used to
control 4 reservoirs;
mixing is done
before pump.
data
processor
Instrumentação para HPLC
FM
COLUNA
DETECTOR
INJETOR
PURGA
BOMBA
Componentes de um
Cromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes
principais :
 Injetor :
É o dispositivo que tem a função de introduzir a
amostra na fase móvel ;
 Coluna cromatografia :
É o dispositivo que tem a função de separar os
componentes da amostra ;
 Detector :
É o dispositivo que tem a função de detectar os
componentes eluídos da coluna cromatográficas
Componentes auxiliares de um
HPLC
Bomba :
 É o dispositivo que bombeia e controla o
fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );
 É composta de um ou mais pistão acoplados a
um sistema de válvulas.
 Fornece uma alta pressão.
BOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
- Mede a pressão sobre o sistema
- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)
Componentes auxiliares de um HPLC
Válvula de purga:
 É o dispositivo que permite a troca rápida de
solvente desviando o fluxo de solvente para o
dreno.
Misturador:
 É o dispositivo que homogeneíza a mistura de
solventes quando operando com gradiente de
eluição .
Fase estacionária
Colunas Cromatográficas
Fases estacionárias :

Sílica- C8

Sílica- C18

Sílica- C18 ( ODS)

Sílica- NH2

Sílica- Diol

Sílica

Troca Iônica
Pré-Coluna:
 É o uma pequena coluna instalada a montante
da coluna analítica .

Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca

Resinas DVB-ST porosas
 Tem como objetivo reter sólidos e em muitos
casos reter materiais que por reações químicas
podem precipitar sobre a fase estacionária.
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
SÍLICA (suporte + usado):
- Resistência mecânica
- Variedade de forma, tamanho de partículas e
poros
- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou
básicas
- Superfície não homogênea
SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
OH
Si
LIVRES
HO
OH
Si
GEMINAL
OH
OH
Si
Si
VICINAIS
influenciam no grau de acidez da sílica
Fase Estacionária
 A fase estacionária mais utilizada
é composta de partículas
microporosas de sílica.
 São permeáveis ao solvente e
possuem uma área superficial de
varias centenas de metros por
gramas.
 Não
deve ser utilizada em
sistemas com pH acima de 8,0.
MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL
- QUIMICAMENTE LIGADAS
- HÍBRIDAS
- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS
Fases Quimicamente Ligadas
C8
média
C18 (ODS)
amostra
forte
C4
amostra
fraca
amostra
POLIMÉRICAS
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa
- Maior estabilidade
- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS
Matriz orgânica-inorgânica
(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O  SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano
- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais
- Menor quantidade de grupos de silanóis
- Ultra-fast cromatografia
RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS
-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ
INORGÂNICA
- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS
POLÍMEROS ORGÂNICOS
- Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte
- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos
funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos
filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)
Sílica
Zircônia
Titânia
Alumina
• Poli(etileno)
• Poli(butadieno)
• Poli(estireno)
• Poli(dimetilsiloxano)
• Poli(metiloctilsiloxano)
• Poli(metiloctadecilsiloxano)
• Poliéteres
• Polissacarídeos
• Poliaminas
• Polinucleotídeos
• Poliamidas
• Proteínas
PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fases estacionárias
Interações
Si
van der Waals
C8
Si
PH
van der Waals
Si
C2
van der Waals
Fase Estacionária
Fases estacionárias
O
CN
NH2
Si
C
Si
N
H
H
Ligação de
hidrogênio
O
O
O
2OH
Dipolo/Dipolo
N
H
Si
H
Interações
O H
H
H
O
Ligação de
hidrogênio
Fase Estacionária
Fases estacionárias
H3+N
PRS
O
Si
SAX
H3+N
Eletrostática
O-
-O S
3
Si
Eletrostática
SO3-
Si
CBA
Interações
N+(CH3)3
Eletrostática
Processo de Eluição
Definição:
 Pode ser descrita como deslocamento do soluto na
fase estacionária.
Série eluotrópica

Ordena os solventes de acordo com suas habilidades
relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
Força eluente:
 É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:

Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente
menos polar.
Cromatografia com fase reversa:
 Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente
polar e um solvente polar.
DETECTORES - Classificação
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade
eluída de um analito
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas substâncias
com determinada propriedade
físico-química.
DETECTORES
POLARÍMETRO
UV
MS
IR
ELETROQUÍMICO
FLUORESCÊNCIA
Detectores Ultra violeta:
 É mais comum, usado na
CLAE.
 Porque muitos solutos
absorvem a luz ultravioleta.
 São bons para a eluição
por gradiente com
solventes não-absorventes.
Ultra violeta (UV-visível):
Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela
amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
- Seletivo (moléculas com cromóforos)
λ nm
190
Água
210
MeOH
200
ACN
330
Acetona
200
Hexano
Clorofórmio 245
215
THF
Solvente
- Comprimento de onda (λ) fixo
- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)
- Varredura (DAD)
- Solventes também absorvem
Fluorescência:
Princípio: Emissão de energia fluorescente de um
soluto que foi excitado por radiação UV
- Seletivo (moléculas que fluorescem)
- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas
- Mais sensível que UV por ser emissão
- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para
que o analito se torne fluorescente.
- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de
dansila
Detectores por Índice de Refração:
Indice de refração:
Princípio: Mede a diferença no índice de refração da
fase móvel e do eluente vindo da coluna
- Não- seletivo
- Sensível a variações de:
- Temperatura
- Pressão
- Fluxo
- Composição fase móvel
- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar
- Muito usado em cromatografia preparativa
Espectrometria de massas:
Princípio: Determinação da massa de solutos através da
ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
- Destrutivo
- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)
- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI
- Análise de micro e macromoléculas.
- Alta sensibilidade
MODOS DE SEPARAÇÃO
 NORMAL
 REVERSO
 TROCA IÔNICA
MODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAÇÃO:
ADSORÇÃO
Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel
Fase móvel: mistura de solventes orgânicos
Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
MODO REVERSO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO
SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
HIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLAR
Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN
ÁREA DE C SOLUTO
RETENÇÃO
Tempo de Retenção e
Hidrofobicidade
OH
C18 (ODS)
forte
OH
Interação
fraca
Hidrofobicidade
 Se
a amostra possui
 CH3CH2CH2--
 Se
: cadeia carbônica
: grupo aromático
A hidrofobicidade
será forte
a amostra possui
 -COOH
 -NH2
 -OH
: grupo carboxílico
: grupo amino
A hidrofobicidade
: grupo hidróxi
será fraca
TROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminas
Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 L, 5 L e 10 L
agulha (inox 316)
êmbolo
corpo (pirex)
Obs: Seringa de HPLC
Seqüência
 Lavagem da coluna -MeOH por 30 minutos
 Condicionamento da coluna com fase móvel
 Monitoramento da linha de base
 Injeção das amostras
PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
FATOR DE RETENÇÃO (k)
FATOR DE SEPARAÇÃO ()
NÚMERO DE PRATOS (N)
Cromatograma
SINAL
tR
tM
TEMPO
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
A migração de um analito pela
coluna provoca inevitavelmente
o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
BANDA CROMATOGRÁFICA
w
2
na linha de base
FATOR DE RETENÇÃO (k)
k=
t r – to
to
tr = tempo retenção analito
to = tempo morto da coluna
Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases
Não leva em conta o tempo morto da coluna
tr to
k =
to
Se:
t0 = 1,5 min
t1 = 3,5 min
t2 = 4,2 min
k1 = 1,3
k2 = 1,8
FATOR DE SEPARAÇÃO ()
=
k2
k1
AVALIA A SELETIVIDADE
k1 = 1,3
=
k2
k1
Se:
k1 = 1,3
k2 = 1,8
 = 1,38
 = 1 não houve separação
k2 = 1,8
NÚMERO DE PRATOS (N)
2
N = 5,54
tr
w0,5
Mede a eficiência do sistema
Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel
Resolução
é função da
Seletividade ()
Eficiência da coluna (N)
Fator de retenção (k)
Resolução
Rs = 0.8
Rs = 1.05
Rs = 1.25
FASE MÓVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)
- Filtração (membrana 0.45 μm)
- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento
de He ou automático)
- Purgar os solventes
MODOS DE ELUIÇÃO
 ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da
corrida; a composição ds FM é CONSTANTE.
 GRADIENTE:
- Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo
da corrida.
- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
Mudança no modificador orgânico
a
b
a
cd
[ MeOH/H2O ]
par crítico : c,d
c
d
[ THF/H2O ]
par crítico : a,b
d
[ MeOH/THF/H2O ]
b
a
c
b
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
3) EXTRAÇÃO:
- LÍQUIDO-LÍQUIDO
- LÍQUIDO-SÓLIDO
- SOXHLET
- FLUÍDO SUPER CRÍTICO
- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)
Filtração
É necessária, previamente à injeção, usualmente com membranas
de 0.45 m mesh para a remoção do material insolúvel.
DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado de
um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de
cromatogramas da
amostra e de uma
solução padrão do
analito suspeito
ANÁLISE QUANTITATIVA
 A área do pico é proporcional a massa que passa pelo detector
 Cálculo de área:
ANÁLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostos
respondessem igualmente ao
detector poderíamos usar a relação:
Massa A Área A
Massa B Área B
No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá
áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Este método baseia-se na comparação de uma certa
substância presente na amostra com seu respectivo
padrão.
Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x
concentração) da substância padrão:
PADRONIZAÇÃO EXTERNA
Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no
cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração
dessa substância na amostra.
É importante salientar que o gráfico deve ser construído com
concentrações próximas da concentração esperada na
amostra. Outro fator muito importante é que o volume
injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume
injetado de amostra. Por esta razão este tipo de
padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas
para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o
volume injetado.
Neste método não são usados fatores de correção para
corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
PADRONIZAÇÃO INTERNA
Uma quantidade de amostra é pesada juntamente com um padrão
de massa conhecida. Esta mistura é injetada e, a partir dos dados
obtidos no cromatograma, compara-se a área corrigida de cada
componente que se deseja determinar com a área corrigida do
padrão adicionado, do qual se conhece a concentração.
Mx = massa do componente x
Ma = massa da amostra
Mp = massa do padrão
Ap = área do padrão
Ax = área corrigida do componente x
PADRONIZAÇÃO INTERNA
A escolha do padrão deve ser feita, sempre que
possível, entre compostos semelhantes aos que
existem na amostra, não devendo coincidir com
nenhum composto da mesma, e estar próximo ou
entre os picos da amostra. Deve ser também uma
substância pura para que apresente apenas um pico
no cromatograma, e para que esse pico possa ser
relacionado à massa pesada
Este método possibilita a determinação de apenas
um dos componentes de uma mistura, sem haver
necessidade de conhecer os outros componentes.
APLICAÇÕES
APLICAÇÕES cont…
APLICAÇÕES cont…
 TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel;
VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin.
Determinação de corantes marcadores do tipo azo e
antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida com
detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010, vol.33, n.1, pp.
146-150. ISSN 0100-4042.

AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A BOVINOS E EM
AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE LAVRAS, MINAS GERAIS
– BRASIL - Maria Marlucia Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de
Carvalho2, Guilherme Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4,
Thaís Veloso5, Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara
Martins Ribeiro6