HPLC
High Performance Liquid
Chromatography
CLAE
Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
1. Introdução
CROMATOGRAFIA = método físico de separação no qual
os constituintes de uma amostra a serem separados
são distribuídos entre 2 fases:


estacionária: geralmente de grande área, sólida ou
líquida
móvel: um fluido insolúvel que percola através da
primeira
FASE MÓVEL
Fase
estacionária
injeção
separação
eluição
DETECTOR
CROMATOGRAFIA
SFC
Cromatografia a
Fluido Supercrítico
LC
Planar
Cromatografia
Papel
Coluna Capilar
empacotada
dc <= 350 um
GC
Cromatografia a
Gás
LC
Cromatografia a
Líquido
CCD
Cromatografia
Camada Delgada
Coluna
Microbore
350 um < dc < 1 mm
LC
Coluna
Coluna
Empacotada
Coluna
"Analítica"
1 mm < dc < 8 mm
FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.
Coluna "Open
Tubular" Capilar
dc < 350 um
Coluna
Preparativa
dc >= 8 mm
LC Clássica
Fluxo por gravidade
HPLC Moderna*

Partículas da fase estacionária extremamente
pequenas (diâmetro < 10 m)  bombas para
operações a altas pressões (até 500 atm) e
baixas vazões (0,01 a 2-3 mL / min) ........High
Pressure LC

Solventes especiais e ultra-puros

Detectores seletivos e super-sensíveis, com
tamanho de célula de detecção < 10 L
HPLC Moderna*
Injetor
Reservatórios para
os solventes
Precoluna
Bomba HPLC
Coluna Analitica
Sistema de Tratamento
de Dados
Detector
Filtro em linha Scavenger
Substâncias não analisáveis por GC:

compostos iônicos

sais inorgânicos e orgânicos
aminoácidos puros
compostos polares de alto PM
polímeros
compostos termicamente instáveis
corantes salinos
etc.






Aplicações HPLC
Substâncias químicas








Proteínas
Ácidos nucleicos
Aminoácidos
Corantes
Polissacarídeos
Pigmentos plantas
Metabólitos
plantas
Produtos
farmacêuticos







Compostos iônicos
Íons metálicos
Cátions e ânions
Lipídeos polares
Complexos metais
pesados
Explosivos
Polímeros
sintéticos
Vantagens da HPLC





Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas,
biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de todos
os componentes contra uns 15% para GC
Alta resolução
 resolve (separa) centenas de componentes em
amostras complexas
Detecção de alta sensibilidade
 detecta nos limites de pg - ng
Análises rápidas e precisas
 análises de 1 - 60 min, precição de 1% RSD
Análises automatizadas
 usando autosampler e sistema de tratamento de dados
4. Modos de Separação

Cromatografia de adsorção (sólido-líquido)

Cromatografia de partição (líquido-líquido)

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia por exclusão de tamanho
Fase Estacionária


Sólida
Apresenta na superfície cargas iônicas ou polares.
Exemplos:





Sílica gel
Alumina
Florisil
Carvão
Carbonato de cálcio
Fase Móvel










Hexano
Isooctano
Cloreto de butila
Clorofórmio
Diclorometano
Tetraidrofurano
Acetonitrila
Iso e n-propanol
Metanol
Água
Fluxo
Cromatografia de
Adsorção
apolar
Cromatografia de partição clássica
FASE ESTACIONÁRIA
 Fina camada de líquido que cobre as partículas de um
suporte sólido
 Este líquido pode ser:


polar: polietilenoglicol, ODPN (, ´-oxidipropionitrila)
apolar: hexano
FASE MÓVEL
 Sempre de polaridade contrária
 Baixa estabilidade
Cromatografia de partição com fases
quimicamente ligadas
FASE ESTACIONÁRIA
 Líquido é quimicamente ligado ao suporte
sólido.
FASE MÓVEL
 Sempre de polaridade contrária
 Alta estabilidade
Fases polares quimicamente ligadas
frequentemente utilizadas
MODO
GRUPO
FUNCIONAL
ESTRUTURA DO
GRUPO LIGADO
Amino
NH2
Ciano (nitrila)
CN
FASE
NORMAL
Si
Diol
O
CH2
O
Si
O
CH
CH2OH
OH
O
CH2
CH
OH
CH2OH
Fases apolares quimicamente ligadas
freqüentemente utilizadas
MODO
GRUPO
FUNCIONAL
ESTRUTURA DO
GRUPO LIGADO
Dimetil silil
Si
CH3
CH3
FASE
REVERSA
Octil silil
Si
CH2
(CH2)6
Octadecil silil
Si
CH2
(CH2)16
Fenil silil
Si
CH3
CH3
OH
Cromatografia de Partição
Fluxo
apolar
polar
polar
Cromatografia Fase Normal (NPC)
x
Cromatografia Fase Reversa (RPC)



Classificação baseada na Natureza da Fase
Móvel
NPC
 Fase móvel Apolar  hexano, isooctano
 Fase estacionária Polar  sílica, alumina
RPC
 Fase móvel Polar  metanol, água
 Fase estacionária Apolar  C8, C18
Portanto..........
GERALMENTE:

NPC  Cromatografia Adsorção

RPC  Cromatografia Partição
4.3. Cromatografia de troca iônica

FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente
ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM).
Pode ser:




trocadora de cátions: grupo iônico = sulfonato
trocadora de ânions: grupo iônico = amônia quaternária
FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH). Por
exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia, acetato sódio,
borato sódio, etc.
APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos,
proteínas/peptídeos, etc
Cromatografia de troca iônica
+
pH
-
+
SO3 Na
Fluxo
Suporte
Polimérico
ou de Silica
SO3- Na
4.4. Cromatografia por exclusão de
tamanho

A separação é baseada no tamanho da molécula e não em
fenômenos de interações físicas ou químicas

FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro médio de poro
fabricado sob medida. Assim, algumas moléculas (menores)
podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros médios, ou
seja, são permeadas seletivamente. As moléculas grandes são
excluídas  exclusão tamanho.
Cromatografia por exclusão de
tamanho
FLUXO
Gel
Poro
Resolução (Rs)
Rs = tr1 - tr2 / wb
Rs = separação real dos picos
Rs = 0 (sem separação), Rs = 1
(separação parcial), Rs = 1.5
(separação da linha base)
t
Injeção
W
W
1. Colunas

Sistema separação (adsorção, partição, etc)

Comprimento (10-25 cm)




cromatografia rápida  3 cm
Diâmetro interno*
Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros)
Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8,
C18, sulfonato)


Tamanho da partícula (3-20 m)
Tamanho do poro (60-300 Å)
Diâmetro da coluna
Tipo de Coluna
i.d.
(mm)
Capacidade de Velocidade
amostra
de Fluxo
(mg)
(mL/min)
10-50
5-30
Semi-preparativa
8-20
Analítica
4.6
1
1
Narrowbore
2.0
0.2
0.2
Microbore
1.0
0.05
0.05
2. Bombas / Fase Móvel

Velocidade fluxo



0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas
> 5,0 mL/min para colunas preparativas
Pressão operação

500-2000 psi para colunas analíticas
Eluição Isocrática /
Gradiente

ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel
não muda durante a corrida.

GRADIENTE = a composição da fase móvel
varia de acordo com a polaridade dos analitos.
Bomba binária/quaternária.
3. Injeção da Amostra

INJETOR MANUAL
Da
bomba
Da
bomba
Amostra
da seringa
Para
coluna
Para coluna
Descarte
Loop
Loop
3. Injeção da Amostra

AUTOSAMPLER
Corpo
da
Seringa
Solvente
Amostragem
da Seringa
Válvula de
injeção
Vials na bandeja
Frasco de lavagem
4. Detectores

Equipamento com uma pequena célula de
fluxo conectado na saída da coluna e que
monitora a concentração dos analitos.

Detectores mais comuns:
UV/Vis (absorvância)
 Fluorescência
 Índice de Refração
 Outros: Eletroquímico, Condutividade,
Infravermelho, etc.

4.1. Detectores UV/Vis e Rede de
Diodos (DAD)





PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são
expostos à radiação, sofrem excitação eletrônica a
qual resulta na absorção de energia em comprimentos
de onda específicos para os grupos.
Comprimento onda: 210-380 nm  UV
Comprimento onda: 380-800 nm  Visível
 90% compostos orgânicos absorvem luz em algum
lugar da região UV-Vis
 65% das amostras analisadas por LC absorvem luz
na região de compr. Onda = 254 nm
Detector de Absorvância UV/Vis
Detector de Rede de Diodos (DAD)
4.2. Detectores de Fluorescência

Detectam compostos
com fluorescência
natural (aflatoxinas)
ou que se tornam
fluorescentes após
reação de derivação
(cloreto dansyl,
fluoresceína, OPA)
4.3. Detectores de Índice de Refração (IR)

PRINCÍPIO: mede a mudança do índice de refração
dos efluentes das colunas

IR : característica física de cada composto

IR da substância analisada  IR da fase móvel

Análise isocrática, controle temperatura

Detector universal, não seletivo e pouco sensível

Aplicações: separações preparativas, cromatografia
polímeros (exclusão tamanho), açúcares, etc.
Detector de Índice de Refração (IR)
Detectores

SENSIBILIDADE
Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível que
UV-Vis
 UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR


ESPECIFICIDADE

Aumenta com a sensibilidade
FIM !!!!!!!!!