Cromatografia em Fase Gasosa (GC), Cromatografia
Líquida (HPLC) e Espectrometria de
Absorção Atômica em Análises
Toxicológicas
Disciplina: Toxicologia Geral
CROMATOGRAFIA
A Cromatografia é uma técnica analítica onde os
componentes a serem separados são distribuídos entre uma
fase móvel e uma fase estacionária.
CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Cromatografia
Planar
Coluna
Gasosa
Líquida
Camada
delgada
Papel
CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA
GC - GAS CHROMATOGRAPHY
Fase móvel : gás de arraste (hélio, hidrogênio,
nitrogênio)
Fase estacionária: coluna cromatográfica
- Substâncias que podem ser analisadas por GC:
gases, substâncias voláteis e termicamente estáveis.
Exemplos: etanol, metanol, cocaína, tolueno,
benzeno, anfetaminas, praguicidas.
ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE GC
5
2
6
3
1
4
1) Fonte de gás de arraste em um cilindro de
alta pressão - A escolha do gás de arraste (fase
móvel) depende de certos fatores como preço,
disponibilidade, pureza e tipo de detector
utilizado. Também deve ser um gás inerte.
Associado a fonte de gás estão os reguladores de
pressão e os medidores de vazão que permitem
controlar e monitorar o escoamento do gás de
arraste: a eficiência da técnica varia com a vazão
do gás (fluxo).
2) Sistema de injeção de amostra - A amostra
líquida é introduzida com a ajuda de uma
microseringa de vidro. A agulha penetra uma
borracha de silicone que é um septo auto-selante.
A utilização da seringa, de modo ideal, permite
uma reprodutibilidade da técnica. A temperatura
do injetor deve ser tal que o líquido amostral seja
rapidamente vaporizado sem haver decomposição
térmica (próximo ao ponto de ebulição do
componente menos volátil). Temperaturas comuns
de análise são da ordem de 200-300C.
2) Sistema de injeção de amostra
“split”
“splitless”
3) Coluna: A separação efetiva dos componentes da
amostra é realizada na coluna cromatográfica onde o tipo e
a quantidade da fase estacionária são fatores importantes
para se ter a eficiência desejada.
Coluna cromatográfica
gás
gás
gás
DETECTOR
3)
Coluna:
De acordo com a natureza da fase
estacionária, é possível dividir-se a cromatografia em
fase gasosa em:
A) Cromatografia gás-líquido (CGL) ou partição: a
fase estacionária é uma película delgada líquida nãovolátil a qual recobre um sólido inerte denominado
suporte. A base para a separação cromatográfica é a
distribuição da amostra dentro e fora desta película, ou
seja, a partição da amostra entre a fase móvel e a fase
estacionária líquida.
B) Cromatografia gás-sólido (CGS) ou adsorção: a
fase estacionária é um sólido de grande área
superficial, usualmente um adsorvente como carvão
vegetal, sílica-gel ou peneira molecular. Empregado na
separação de gases como nitrogênio, oxigênio,
monóxido de carbono, etc.
3) Coluna:
Tipos de coluna:
- Empacotada
- Capilar
Em colunas capilares temos uma maior eficiência,
uma melhor resolução cromatográfica e um tempo
de análise menor.
3) Coluna:
Eficiência da coluna pode ser calculada pelo número de pratos
teóricos (N):
N = 16 (TR / Wb)2 = 5,545 (TR / Wh) 2
TR
= tempo de
retenção
Wb = largura da base
do pico
Wh = largura a meia
altura do pico
Um prato teórico é definido como sendo um equilíbrio de
distribuição do soluto entre as duas fases; quanto maior o
valor de N, mais equilíbrios existirão e a separação será
maximizada.
3) Coluna:
Os parâmetros operacionais de uma coluna
podem ser melhor avaliados por seu efeito sobre a
altura equivalente a um prato teórico (AEPT ou
H)que corresponde à razão entre o comprimento
da coluna, L (em cm) e o número de pratos
teóricos, N.
H = AEPT = L /N
Portanto, H é o comprimento necessário de uma
coluna para gerar um prato teórico; quanto maior
N, menor será H e mais eficiente será a coluna.
3) Coluna:
Resolução:
A Resolução (R) é uma medida quantitativa da
separação de dois picos consecutivos, sendo determinada
por dois fatores: TR e Wb.
R = 2 TR / Wb1 + Wb2
3) Coluna:
Resolução:
4) Forno:
-Temperatura
-Análise isotérmica: quando a análise em cromatografia
em fase gasosa é realizada com forco mantido à
temperatura constante desde o início até o final.
-Temperatura programada: a temperatura muda durante o
decorrer da análise
A) Balístico B) Linear C) Multilinear
4) Forno:
4) Forno:
5) Detectores:
A) Detector de Ionização de Chama (FID)
B) Detector de Condutividade Térmica (TCD)
C) Detector de Nitrogênio-Fósforo (NPD)
D) Detector de Captura de Elétrons (ECD)
Obs: Em geral utiliza-se temperaturas mais elevadas no detector do
que no forno, para evitar condensação de substâncias no detector
(contaminação).
5) Detectores:
A) Detector de Ionização de Chama (FID)
-Íons são gerados na chama e detectados.
-Detecta
substâncias
ionizáveis
em
(hidrocarbonetos)
chama
FID:
Detector
resistente,
robusto.
5) Detectores:
B) Detector de Condutividade Térmica (TCD)
Princípio: A velocidade de perda de calor de um corpo
quente depende dos gases presentes na região.
-Apresenta resposta a todos os compostos, universal.
-Detector simples, baixo custo e boa estabilidade.
corrente elétrica
filamento
Referência
Gás de arraste
5) Detectores:
C) Detector de Nitrogênio-Fósforo (NPD)
O detector de nitrogênio-fósforo utiliza um sistema
similar ao FID. Entretanto ele utiliza uma pequena
pérola de rubídio (elemento ativo) que é eletricamente
aquecido. Na presença dessa fonte termoiônica,
compostos que contém nitrogênio ou fósforo na
molécula são eficientemente ionizados. Os íons são
coletados e a corrente elétrica é medida.
-Dispendioso e de estabilidade regular,
-Altamente seletivo
-Excelente detector para compostos contendo nitrogênio
ou fósforo na molécula.
5) Detectores:
C) Detector por Captura de Elétrons (ECD)
O ECD tem seu funcionamento baseado na acaptura de
elétrons pela substância a ser detectada, elétrons
estes gerados pela ionização do gás de arraste por
uma fonte radioativa.
 elemento radioativo Ni63- emite partículas 
  + N2
N2+ + e- (são detectados por um anodo)
 X + eX- + N2+
X + N2
-Insensível a presença de hidrocarbonetos, álcoois e
cetonas.
-Sensível
para
compostos
clorados,
bromados
(halogênios), compostos organometálicos.
6) Registradores (sistemas de dados)
Impressora (integrador)
-fácil de operar
-preço moderado
Computador (workstation)
-mais caro
-mais flexível, poderoso.
ANÁLISE QUALITATIVA
A identificação de substâncias por cromatografia em
fase gasosa se dá através do tempo de retenção (TR)
da substância na coluna cromatográfica comparada
com padrões.
Injeção de amostra
Injeção de padrão
ANÁLISE QUANTITATIVA
A quantidade de analito (substância) é proporcional à
área ou a altura do pico correspondente.
1 ng de substância
2 ng de substância
ANÁLISE QUANTITATIVA
Para se calcular a concentração de uma
substância em uma amostra é necessário se fazer
uma curva de calibração.
Duas formas:
A) Método do padrão externo
B) Método do padrão interno
ANÁLISE QUANTITATIVA
A) Padrão externo
Faz-se uma curva com várias concentrações do analito. A
seguir injeta-se o extrato da amostra cuja concentração se quer
determinar e lança-se no gráfico as áreas obtidas dos picos
contra as concentrações dos adicionados.
ANÁLISE QUANTITATIVA
B) Padrão Interno (PI)
O padrão interno (PI) é um composto que se adiciona à
amostra, antes de qualquer manipulação (extração) de forma
que não interfira com a análise. O PI tem a função de corrigir
possíveis imprecisões durante a manipulação da amostra (fase
de extração, injeção da amostra) ou mesmo variações no
equipamento de GC.
O PI também tem a função de monitorar possíveis erros de
operação ou procedimentos durante a análise.
O PI deve ter preferencialmente as seguintes
características:
a) nunca ser encontrado na amostra;
b) ser disponível em elevado grau de pureza;
c) ser bem resolvido dos outros picos;
d) ser estruturalmente semelhante ao analito, ou possuir os
mesmos grupos químicos do analito.
ANÁLISE QUANTITATIVA
B) Padrão Interno (PI)
Exemplos:
1
N
CH3
N
CH3
O CH3
C O CH CH3
O
C O CH3
O
O
Cocaína
2
CH3
Etanol
O
C
O
C
Isopropilbenzoilecgonina (PI)
CH2
OH
CH3
CH2
Propanol (PI)
CH2
OH
Obs:
Para análise qualitativa, também é importante a presença do
padrão interno, pois os tempos de retenção (TR) podem
variar de uma injeção para outra, devido às variações no
próprio equipamento. Desta forma, para identificação da
substância, utiliza-se o tempo de retenção relativo (TRR)
que é o tempo de retenção do analito dividido pelo tempo de
retenção do padrão interno. Esse valor está menos sujeito à
variações.
TR PI
TR X
TRRx = TRx / TRPI
X
PI
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
HPLC- HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPH
Fase móvel : solução, solventes (solução tamponada,
metanol, acetonitrila)
Fase estacionária: coluna cromatográfica
- Substâncias que podem ser analisadas por HPLC:
antibióticos, diuréticos, fármacos, drogas de abuso,
proteínas, a.a., tensoativos, etc..
Ao contrário do GC podem ser analisadas substâncias
não voláteis ou termicamente instáveis.
ESQUEMA DE UM EQUIPAMENTO DE HPLC
4
5
7
3
2
1
6
1) Válvula de injeção de amostra
-injeção manual (loop)
-injeção automática (amostrador automático)
2) Bombas de pressão:
100 a 500atm - permite velocidade de fluxo razoável
para o empacotamento de partículas de 3 a
10m. As vazões normalmente empregadas em
HPLC vão de 0,005 até no máximo 4 a 5ml/min.
3) Fase móvel:
A fase móvel deve ser desgaseificada para remover
gases
dissolvidos
que
poderiam
causar
interferências. Utiliza-se ultra-som e bombas de
vácuo. Também deve ser filtrada para evitar
entupimento da coluna cromatográfica.
Podem ser utilizados dois tipos de eluição:
-isocrática: quando se mantém a composição da fase
móvel constante durante toda a análise
cromatográfica.
-programação de gradiente: quando altera-se a
composição da fase móvel durante a execução da
análise. Utiliza-se dois ou mais solventes com
polaridades diferentes
4) Coluna cromatográfica:
- Fase normal:
Fase estacionária polar (ex. trietilenoglicol)
Fase móvel relativamente apolar (Ex. hexano, éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da Fase móvel, o tempo de
eluição diminui.
-Fase reversa
Fase estacionária não polar (Ex. hidrocarbonetos)
Fase móvel relativamente polar (água, metanol, acetonitrila)
O componente mais polar é eluído primeiro,
Aumentando-se a polaridade da fase móvel, o tempo de eluição
aumenta.
Obs. A maioria das separações por HPLC são de fase reversa
com empacotamentos ligados de C8 ou C18 siloxanos.
5) Detectores:
A) Detectores UV/Vis
B) Detectores de fluorescência
C) Detectores por índice de refração
D) Detectores eletroquímicos
5) Detectores:
A) Detectores UV/Vis
Os fotômetros UV foram os detectores mais empregados em
HPLC. Eles medem as variações na absorbância na luz na
região de 190 a 350nm durante a passagem do efluente da
coluna na célula de fluxo. O mesmo projeto de detector,
com poucas variáveis permite a leitura na região do
visível (350 a 700nm), onde, porém, a sensibilidade é bem
menor.
Devido a algumas razões técnicas envolvendo as lâmpadas
de UV empregadas, os primeiros detectores assumiam
como comprimento de onda universal de 254nm.
Atualmente existem os detectores de rede de diodos (diode
array detector-DAD) que praticamente permitem levantar
o espectro da substância durante a eluição.
5) Detectores:
B) Detectores de fluorescência
Detectam substâncias que emitem fluorescência.
C) Detectores por índice de refração
Os detectores por índice de refração medem as mudanças
do índice de refração do efluente das colunas.
É um detector universal, não seletivo, não muito sensível e
por isso empregado quando os outros não respondem ao
composto de interesse.
D) Detectores eletroquímicos
Os detectores eletroquímicos se baseiam na possibilidade
de muitos compostos serem oxidados ou reduzidos
quando estiverem na presença de um potencial elétrico.
CARACTERÍSTICAS DAS DUAS TÉCNICAS (GC E HPLC)
-Eficiente, altamente seletivo, largamente aplicável,
-Quando utilizado PI, análises bastante precisas,
-Boa sensibilidade,
-Necessitam de procedimentos de extração da
amostra,
-Necessitam de equipamentos específicos e
profissionais treinados para operá-los.
-Possibilidade de se detectar várias substâncias em
uma mesma análise,
-Há possibilidade de interferentes.
Referências
CIOLA, R. Fundamentos de cromatografia a líquido de alto
desempenho HPLC. São paulo: Ed. Edgard Blücher, 1998.
LANÇAS, F. Cromatografia Em Fase Gasosa. Ed. São Carlos: ACTA,
1993.
YONAMINE, M. Apresentação oral: aula expositiva. São Paulo, ago.
2004, abr. 2005.