Cromatografia em Camada
Delgada
Discentes: Daniely de Godoy Silva
Germano Blaquez Junior
Gislaine Ap. da Cunha
Docentes: Profº. Drº José Eduardo de Oliveira
Profª Amanda Coelho Danuello
Histórico da Cromatografia em
Camada Delgada
BEYERINCK em 1889 usou sólidos em camada delgada
sobre vidro, para o desenvolvimento circular de misturas
de sais inorgânicos.
Em 1938 IZMAILOV e SCHRAIBER reintroduziram a
Cromatografia em Camada Delgada, para análise de
produtos farmacêuticos, mas não foi muito usada até o
desenvolvimento, por KIRCHNER do método de aderir os
sólidos ao suporte.
Em 1956 atingiu grande desenvolvimento, pelo método
de preparar as placas com reprodutibilidade por STAHL.
Cromatografia :
Método físico-químico de separação dos componentes de uma
mistura, realizada através da distribuição destes componentes
entre duas fases, que estão em contato íntimo.Uma das fases
permanece estacionária enquanto a outra move-se através dela.
Técnicas cromatográficas
Cromatografia planar: Fase estacionária permanece em um plano
Cromatografia em coluna:
Fase estacionária permanece num tubo
Critério de classificação
Planar
Técnica
Fase Móvel
Líquido
Fase
Estacionária
Líquido Sólido
Tipo de
cromatografia
Cromatografia
CP
CCD
Coluna
Gás
Fase
ligada
CCD
Líquido Sólido
CGL
CGS
Líquido
Fase Líquido Sólido
ligada
Fase
ligada
CGFL CLL CLS CE CLFLCTI CB
Outra Classificação
Fase Normal
Polaridade: FE > FM
> polaridade
< polaridade
FE utilizada : Sílica G
Fase Reversa
Polaridade: FE < FM
FE utilizada: Sílica C18
< polaridade
> polaridade
MECANISMO DE AÇÃO
ABSORÇÃO
ADSORÇÃO
Mecanismos
Adsorção
Líquido/gás
sólido
Troca Iônica
Líquido
sólido
+
+
+
-
Partição
Líquido/gás
Exclusão
líquido
Líquido/gás
gel/sólido
FORÇAS INTERMOLECULARES
MOLÉCULAS APOLARES
Ex: Hidrocarbonetos
FORÇAS DE DISPERSÃO DE LONDON
Molécula
apolar
Molécula
apolar
Afastadas
atração
=
Não
existe
Aproximação = Indução
Dipolo
instantâneo
Atração
Dipolo - Dipolo
Molécula polar sem H ligado a
F, ou O ou N
Moléculas Polares
Ligação de Hidrogênio
H ligado a F, ou O, ou N
Cromatografia em Camada Delgada
Consiste na separação dos componentes de uma
mistura através da migração diferencial sobre
uma camada delgada de adsorvente retido sobre
uma superfície plana.
Aplicações:
Estudos preliminares da complexidade dos componentes de um
extrato orgânico;
Investigação de: Casos de envenenamento; ingestão de
estimulantes por atletas;
 Estudos de reações : presença de intermediários estáveis;
Análise da pureza de compostos;
Análise da eficiência de: destilação e cristalização
Vantagens da Cromatografia em Camada Delgada
a. Simplicidade;
b. Baixo custo;
c. Facilidade de raspar a camada, com espátula fina ou com
uma lâmina para microscopia, para recuperar, por eluição o
conteúdo de uma mancha ou de uma banda;
ADSORVENTES UTILIZADOS EM CCD
Processo de separação varia em função da quantidade de água presente no
adsorvente:
Ausência de água
=
Adsorção
Presença de água
=
Partição
Exemplos de adsorventes:
Sílica-Gel ou àcido Silícico;
Óxido de alumínio ou alumina;
Celulose;
Kieselgur;
Kieselgur
Alumina
Poliamida;
Sílica gel
Sílica gel ou Ácido silícico
Mais usada na CCD
O
O
Substância porosa e amorfa.
Apresenta caráter ácido.
O
Si
O
Si
O
O
OH
Possui característica polar, devido à presença de
grupos hidroxilas denominados silanóis. Deve
apresentar número de hidroxilas razoável para ser
seletivo na separação de substâncias de diferentes
polaridades
Mecanismo de adsorção:
-Si-OH: Interações polares por ligação de hidrogênio, como doador ou aceptor de H.
-Si-OH e –Si-O-Si-: dipolo/dipolo
Tratamento térmico  eliminação de água ( temperatura recomendada para a sua ativação de
105 a 110ºC)
CUIDADO! A aspiração da sílica causa
Caracterização do tipo básico de sílica gel :
silicose, um tipo de inflamação
G: adição de sulfato de cálcio, gipsita, (aglutinante);
pulmonar crônica!
H: indica ausência de aglutinante;
F: indica adição de substâncias fluorescentes;
P: indica adsorvente para uso preparativo;
R: indica adsorvente de alto grau de pureza;
Preparação: 30g de sílica com 60-70 mLde água = 5 placas de 20x20cm com espessura de 0,3
mm
Sílica C18
CH3
CH3
H3C
CH3
Si HO
H3C
O
Si
O
H3C
Si
O
Si
O
OH
O
CH3
CH3
Usada em cromatografia de fase
reversa, em que a fase
estacionária é menos polar que a
fase móvel
Alumina ou Óxido de Alumínio
Segundo adsorvente mais empregado em CCD;
Há três grupos deste adsorvente:
ÁCIDA
pH 4,0
BÁSICA
pH 9,0
NEUTRA
pH 7,0
Mecanismo de adsorção:
Al3+: campo positivo favorece interação com moléculas polarizáveis ( sistemas conjugados)
O2-: sítios básicos favorecem a interação com doadores de H+
A ativação da alumina faz-se,após secagem ao ar durante cerca de 2 h, pelo
aquecimento em estufa a 120ºC por 60 min.
A alumina é caracterizada pelo diâmetro dos poros dos grânulos.
Tipo E: apresenta superfície específica de 120 – 180 m2. g-1.
Tipo T: apresenta superfície específica de 60 – 90 m2. g-1.
Preparação: 5 placas de 20x20 cm e espessura de 0,3 mm, recomenda-se a
utilização de uma suspensão de 30 g de alumina em 40 mL de água destilada.
Celulose
Existem dois tipos de celulose empregadas em
CCD: a nativa ( celulose fibrosa) e a celulose
microcristalina.
Existem ainda as celuloses quimicamente tratadas
aplicadas na CCD:
Mecanismo: Partição ou troca iônica.
Kieselgur ou terra de diatomáceas
É um tipo de ácido silícico oriundo de carapaças de diatomáceas fósseis.
Comparado a sílica e alumina é menos adsorvente e com menor poder de resolução.
Poliamida
Separação de fenóis e ácidos carboxílicos
A separação depende da intesindade das forças
decorrentes das ligações de hidrogênio com o
analito.
Baixa aderência ao vidro: dificuldade de
preparação da placas
Técnica Geral
Escolha da fase estacionária;
Preparação das placas cromatográficas;
Ativação das placas cromatográficas;
Seleção da fase móvel;
Aplicação das amostras nas cromatoplacas;
Preparação da cuba cromatográfica e desenvolvimento do cromatograma;
Revelação dos cromatogramas;
Documentação;
Calculo do fator de retenção Rf;
Escolha da fase estacionária
Liofilicidade e liofobicidade
Interação com os componentes (polaridade)
Necessidade de aditivos
Aglutinantes
Substâncias fluorescentes
Capacidade adsorvedora
Preparação da placas
As placas devem ser: resistentes, inertes aos reagentes e solventes, resistentes à
temperatura e uniformes.
Dificuldades: Obtenção de camada uniforme.
Placas pré fabricadas: Dispensam a fase de preparação; são mais uniformes e
homogêneas, melhorando a separação e tornando os valores de Rf mais
reprodutíveis.
Procedimentos para a preparação das placas
Limpeza da placa de vidro  detergente e água corrente (eliminação de
gordura);
Secagem  em estufa
Preparação das camadas finas dos adsorventes:
Utilização de espalhadores ( mais empregada);
Submersão, aspersão ou vertendo-se sobre as placas suspensão do
adsorvente apropriado.
Riscar as placas,
determinando a altura
de ínicio e fim da
cromatografia
Ativação das placas
Objetivo: retirar substâncias interferentes e
eliminar água
Metodologia : Varia de uma adsorvente para outro.
Exemplo : Sílica e alumina  estufa 105 – 110 ºC por 30 –
60 min;
Celulose  estufa 105ºC por 10 min;
Seleção da fase móvel
Depende: natureza química das substâncias a serem separadas e polaridade da fase
móvel.
Método de seleção
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por adsorção: levar em conta a
natureza da fase móvel, da fase estacionária e do soluto.
Seleção da fase móvel em um sistema cromatográfico por partição: constitui um
processo de separação que depende das diferenças de solubilidade dos componentes
das amostras, nas fases estacionária e móvel e na imiscibilidade dessas fases.
Aplicação das amostras
A amostra é aplicada na forma de solução 0,1 – 1%,dependendo
da sensibilidade do revelador, usando solventes mais voláteis
possíveis.
Aplica-se a amostra com micropipetas, microsseringas ou tubos
capilares.
As amostras devem estar a mais ou menos 2,0 cm da parte
inferior da placa, afim de que essas não entrem em contato
direto com o solvente durante o desenvolvimento do
cromatograma.
Alinhamento horizontal uniforme.
Preparação da cuba
A cuba deve estar saturada com vapor de fase móvel, para isso,
coloca-se papel de filtro na cuba, que indica o nível de saturação.
A cuba deve ser dotada tampa esmerilhadas de forma a vedá-la
hermeticamente, garantindo uma boa saturação da atmosfera
interna.
Desenvolvimento de um cromatograma numa
cuba
A placa deve ser colocada, rapidamente ( para evitar evaporação) e
verticalmente, após aplicadas as amostras, numa cuba de vidro contendo a fase
móvel desejada
Revelação dos cromatogramas
A- Procedimentos Físicos: Luz ultravioleta (aromáticos ou
dupla ligação conjugada).
B- Procedimentos Biológicos e Enzimáticos: Antibióticos,
Enzimas e Substratos.
C- Procedimentos Químicos: Aplicação de um reativo
químico para formar um derivado colorido ou fluorescente.
Reveladores Físicos
Radiação ultravioleta para compostos fluorescentes.
Ex: clorofila.
Reveladores Químicos
Iodo
Ác. fosfomolibdico
Anisaldeído
Consiste em utilizar reveladores químicos que, em contato com
as substâncias da amostra, as tornam coloridas e visíveis.
Tipos de reveladores químicos
Alcalóides: Dragendorff, iodoplatinato
Flavonóides: NP-PEG
Anti-oxidantes: β-caroteno
Saponinas, terpenos e esteróides: anisaldeído sulfúrico
Antraquinonas e cumarinas: vapor de amônia
Fenólicos, saponinas e terpenóides: vapor de iodo e solução de CeSO4
Compostos fenólicos: FeCl3
Reveladores Biológicos
Utiliza-se reações enzimáticas ou bacterianas para
tornar a mancha visível.
Ex.: para testar se uma amostra contém substância antifúngica, revela-se o cromatograma com esporos de
fungos. Os fungos não crescerão onde houver essas
substâncias.
Fator de Retenção Rf (Relation front ou Rate
factor)
Rf = distância percorrida pela substância / distância percorrida pela fase
móvel.
Os valores Rf variam entre 0 e 1 e são dados com dois algarismos após a
vírgula.
Linha de chegada da FM
dr1
dr2
dm
Ws1
Ws2
Ponto de partida da amostra
Profundidade da FM
Parâmetros Utilizados na Cromatografia Planar
•
Fartor de Retenção (Rf):
•
Rf = dr / dm
•
Resolução (Rs):
•
Rs = 2(dr1 – dr2) / (Ws1 + Ws2)
•
Eficiência:
•
n = 16 (dr – Ws)2
Desvantagens da CCD
Difícil reprodutibilidade:
quantidade de amostra aplicada
obtenção de cromatoplacas com características idênticas.
Dificuldade de detecção devido à difusão da amostra
Difícil determinação exata do Rf.
Constantes Físicas
Bibliografia
•COLLINS, Carol H. et al, introdução a métodos cromatográficos, 6ª ed, ed.
Unicamp,Campinas,1995.
•NETTO, J. Z., CAZETTA, J. O. Cromatografia Plana, Funep, Jaboticabal, 2005
•THE MERCK INDEX, 13th, ed. Merck & CO., Inc., Usa, 2001.
•Labjeduardo.iq.unesp.br
Agradecimentos
• Marquinho
• Alberto Camilo Alécio
• Amanda Coelho Danuello