Prof. Valmir F. Juliano
QUI624
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
Classificação dos métodos analíticos
CLÁSSICOS E INSTRUMENTAIS
Chamados de métodos
de via úmida
Gravimetria
Volumetria
Baseados em propriedades
físicas (químicas em alguns casos )
Eletroanalítico
Cromatográfico
Espectrométrico
Propriedades
elétricas
Propriedades
ópticas
*Separação: interações físico-químicas.
Propriedades
mistas*
Identificação/quantificação: propriedades ópticas ou elétricas.
Cromatografia
Histórico
Mikhail (Michael, Mikhael) Semenovich Tswett (1903),
botânico russo: Separação de misturas de pigmentos
vegetais em colunas recheadas com adsorventes sólidos e
éter de
solventes variados.
petróleo
mistura de
pigmentos
CaCO3
pigmentos
separados
1906 Cromatografia = chroma [cor] + graphe [escrever] (grego)
Cromatografia
Definição - Princípio Básico
Cromatografia é um método físico-químico de
separação de misturas, identificação e
quantificação de seus componentes.
• A separação depende da interação dos componentes da
mistura com a fase móvel e com a fase estacionária.
• A interação dos componentes da mistura com estas duas fases
é influenciada por diferentes forças intermoleculares,
incluindo iônica, dipolar, apolar, e específicos efeitos de
afinidade e solubilidade.
• A identificação se dá mediante a comparação da
interação de padrões com as fases estacionárias.
• A quantificação é feita também pela comparação com
padrões de concentrações conhecidas, através de
curvas analíticas.
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com o sistema cromatográfico
• Em Coluna
• Cromatografia Líquida
• Cromatografia Gasosa
• Cromatografia Supercrítica
• Planar
• Centrífuga (Chromatotron®)
• Cromatografia em Camada Delgada (CCD)
• Cromatografia em Papel (CP)
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com a fase móvel
• Utilização de Gás
• Cromatografia Gasosa (CG)
• Cromatografia Gasosa de Alta Resolução (CGAR)
• Utilização de Líquido
• Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
• Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
• Utilização de Gás Pressurizado
• Cromatografia Supercrítica (CSC)
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas
• De acordo com a Fase Estacionária
• Líquida
• Sólida
• Quimicamente Ligadas
• De acordo com o modo de separação
•
•
•
•
Por Adsorção
Por Partição
Por Troca Iônica
Por Afinidade
Cromatografia
Classificação das técnicas cromatográficas
Técnica
Planar
FM
Líquido
FE
Líq
Sól
Coluna
Gás
Líq
Sól
Tipo de
cromato- CP CCD CGL CGS
grafia
Líquido
Líq
Sól
CLL CLS
Troca
Iônica
Afinidade
Fase
Ligada
Exclusão
CTI
CB
CLFL
CE
Cromatografia
Analogia
O processo cromatográfico pode ser comparado a um grupo
de abelhas e moscas em sobrevoando uma certa região.
Ao passarem por uma flor, espera-se algum efeito sobre as
moscas e abelhas.
Fase estacionária
Analitos
Cromatografia
Analogia
Para uma mesma mistura, a simples troca da fase
estacionária pode ser suficiente para alterar completamente
a ordem de eluição de componentes da mistura.
Fase estacionária
Analitos
Cromatografia
Princípio Básico
Separação de misturas por interação diferencial dos seus
componentes com uma FASE ESTACIONÁRIA (líquido ou
sólido) e uma FASE MÓVEL (líquido ou gás).
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Fase estacionária líquida suportada na celulose.
Fase móvel
Separação
A cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição, utiliza dois líquidos
(líquido-líquido) sendo um fixado em um suporte sólido (papel de filtro). Um bom
exemplo é a separação da tinta verde. Com o processo de cromatografia é possível
verificar que a cor verde é uma mistura de tintura azul e amarela.
Cromatografia
Cromatografia em papel - CP
A mais simples de todas. Pode-se até fazer em casa!
Desenvolvida por Consden, Gordon e Martin em 1944, é bem
simples e utiliza pequena quantidade de amostra. Aplica-se na
separação e identificação de compostos polares hidrossolúveis.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Teve início em 1938 com os trabalhos de Izailov e Shraiber, mas começou a ser
largamente utilizada na dédaca de 1960. O processo de separação está
fundamentado, principalmente, no fenômeno de adsorção. Entretanto com fases
estacionárias tratadas pode ocorrer também por partição ou troca iônica.
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Termos e parâmetros técnicos
ΔSmancha
Rf 
ΔSsolvente
s
c
b
a
a
Rfa 
s
b
Rfb 
s
c
Rfc 
s
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
FASES ESTACIONÁRIAS
Sílica (SiO2)
Alumina (Al2O3)
Celulose
Poliamida
Ativação de 30 a 60 min
de 105 a 110 oC
Ativação de 10 min
a 105 oC
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
ANÁLISE QUALITATIVA
- Comparação com valores de Rf tabelados
- Comparação com padrão eluído em conjunto
- Extração e aplicação de métodos instrumentais
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Conclusões:
Amostra não contém a espécie B
Amostra pode conter a espécie A
Para se certificar da presença,
eluir em outros solventes
Amostra
A B
Após
Eluição
Cromatografia
Cromatografia de Camada Delgada - CCD
Cromatografia
Bi-dimensional
Solvente 1
Solvente 2
Cromatografia
Cromatografia planar
Chromatotron é uma
cromatografia de camada
fina preparativa acelerada
centrifugamente. Pode
substituir pequenas colunas e
HPLC.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PROCESSOS DE SEPARAÇÃO
Exclusão
Partição
Adsorção
Troca Iônica
Afinidade
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
- Fase Móvel Líq. ou Gás
- Fase Estacionária Sólida
Processos de
Adsorção/Dessorção
Ligações de hidrogênio;
Forças de Van der Waals
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Diferença entre Absorção e Adsorção
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
Fase Estacionária Polar
Aumento da Atividade
-CO2H > -OH > -NH2 >
-SH > -CHO > -C=O >
-CO2R > -OCH3 > -CH=CH-
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Adsorvente
Atividade*
Tamanho de
Partícula (mm)
Alumina Básica
I
63 a 200
Alumina Neutra
I, II e III
63 a 200
Alumina Ácida
I
63 a 200
Celulose Microcristalina
63 a 200
Silicato de Magnésio
75 a 150
Sílica Gel
(Ácido Silícico)
II e III
63 a 200
*Atividade na escala Brockmann: A atividade está relacionada à quantidade de água
adsorvida e é determinada em função de sua capacidade de adsorver uma série de
corantes.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
A função das fases móveis na cromatografia por adsorção
tem sentido amplo:
a) Função solvente
• Solubilizar os componentes
• Ter baixo ponto de ebulição
b) Função eluente
• Conduzir os componentes da mistura pela coluna
• Remover ou dessorver estes componentes do adsorvente (FE)
SOLVENTES: Polaridade em Ordem Crescente
Hexano < Éter de Petróleo < Ciclohexano <
Tetracloreto de Carbono < Benzeno < Tolueno <
Diclorometano < Clorofórmio < Éter Etílico <
Acetato de Etila < Acetona < Etanol <
Metanol < Ácido Acético
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
ADSORÇÃO
Usos:
a) Laboratórios de química orgânica  separar e purificar
reagentes e materiais obtidos em síntese.
b) Laboratórios de produtos naturais  escala preparativa
e analítica.
c) Laboratórios de análises clínicas  separação de
esteróides de urina ou de sangue, etc.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Gasosa
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua volatilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
PARTIÇÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Líquida
Processos de Solubilidade
O processo de partição é
intrafacial e a volta de cada
componente para a fase móvel
depende da sua solubilidade.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
TROCA IÔNICA
Por volta de 1935 começaram a ser fabricadas resinas de troca iônica
orgânicas, muito eficientes, passando a constituir um meio químico de
extraordinário valor em processos analíticos.
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Sólida
Processos de Troca Iônica
Adsorção reversível e
diferencial dos íons da fase
móvel pelo grupo trocador
da matriz
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Fluxo da FM
TROCA IÔNICA
Resinas Catiônicas
e Aniônicas
FE altamente carregada
Maior Interação
• Íons de alta carga
• Íons de menor tamanho
A diferença de afinidade entre
os íons da FM pode ser
controlada por pH e força iônica
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Tipo
Trocador
Fórmula do
Trocador
Ácido Forte
ácido
sulfônico
-SO3- H+
Ácido Fraco
ácido
carboxilíco
-CHCOO- Na+
Base Forte
amônio
quaternário
-CH2N+
(CH3)3Cl-
Base Fraca
polialquiamina
-N+ HR2Cl-
Nome
Comercial
Amberlite,
Dowex,
Lewatit,
Zeocarb,
Zerolit,
Duolite
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
O ajuste do pH proporciona a separação das duas proteínas
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária em Gel
Enquanto as partículas menores penetram nas
cavidades, as maiores vão sendo eluídas
contornando as estruturas moleculares da FE.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
A propriedade que distingue a cromatografia de exclusão,
introduzida por volta de 1960, de outros tipos de
cromatografia é que o recheio (FE) é um gel não carregado
constituído de macromoléculas que têm ligações cruzadas,
com afinidade pelos solventes, mas que neles são insolúveis.
- Separação de tamanhos específicos
- Separação de polímeros e proteínas
- Determinação de Massa Molar
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
EXCLUSÃO
Características
desejáveis para os Géis
-Inércia Química:
Não pode haver uma interação
química entre a matriz e o soluto.
-Estabilidade:
O gel deve suportar uso contínuo
quanto mantido em condições
brandas de temperatura e pH.
-Baixo teor de íons:
Grupos carregados interferem no
processo de separação.
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
Fluxo da FM
EXCLUSÃO
Tipos de Géis
Dextrano (Sephadex)
Poliacrilamida
Ágar e Agarose
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
AFINIDADE
Fase Móvel Líquida
Fase Estacionária Sólida
Propriedades
Biológicas e
Funcionais
Cromatografia
Cromatografia em Coluna
AFINIDADE
Substância
Enzima
Ácidos Nuclêicos
Hormônios e Vitaminas
Possibilidade de Ligação
Substratos, cofatores,
inibidores competitivos
Sequência de bases
complementares, histonas,
enzimas específicas
Proteínas trasnportadoras,
receptores
Anticorpos
Antígenos, células
Células
Lectinas, proteínas específicas
da superfície da célula
Cromatografia
Teoria Básica
SOLUTO
FASE
MÓVEL
⇌
Sem
importância
na CG, mas
com grande
importância
na CLAE
FASE
ESTACIONÁRIA
Cromatografia
Teoria Básica
Coluna cromatográfica: série de estágios independentes onde acontece o
equilíbrio entre o analito dissolvido (sorvido) na fase estacionária e na fase
móvel:
Ocorre um “quase-equilíbrio” entre o analito
sorvido na FE e dissolvido na FM.
KC 
AFE
AFM
KC = Constante de Distribuição
[A]FE = concentração do analito na FE
[A]FM = concentração do analito na FM
Afinidade pela FE
[A]FE
MENOR RETENÇÃO !!!
Volatilidade
[A]FM
Cromatografia
Quantificação da eficiência
Supondo a coluna cromatográfica como uma série de estágios separados
onde ocorre o equilíbrio entre o analito, a FE e a FM:
Cada “estágio” de equilíbrio é
chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teóricos
de uma coluna (N) pode ser
calculado por:
tR
wb
N
Coluna mais
eficiente
Cromatografia
Quantificação da eficiência
ALTURA EQUIVALENTE A UM
PRATO TEÓRICO (H)
“Tamanho” de cada estágio de
equilíbrio
(L = comprimento da coluna)
Capilares, L = 30 m
dc = diâmetro da coluna em mm
df = espessura da fase estacionária em mm
Empacotadas, L = 2 m
Valores típicos de H e N:
dC
df
H
0,10
0,25
0,081
370370
0,25
0,25
0,156
192308
0,32
0,32
0,200
150000
0,32
0,50
0,228
131579
0,32
1,00
0,294
102041
0,32
5,00
0,435
68966
0,53
1,00
0,426
70423
0,53
5,00
0,683
43924
2,16
10%
0,549
3643
2,16
5%
0,500
4000
N
Valores de H para colunas capilares e empacotadas são próximos, mas
como L para capilares é MUITO maior tipicamente elas são mais
eficientes
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Fase estacionária
Detecção
Fase móvel
Separação
Cromatografia
Cromatografia em fase gasosa
Injetor: submetido
à temperatura
controlada
Fase móvel:
gás inerte
Detector:
submetido à
temperatura
controlada
Coluna: contendo a
fase estacionária
está submetida à
temperaturas
controladas
Cromatografia Gasosa
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CG ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de
um gás ela deve dissolver-se, pelo menos parcialmente, nesse gás.
Misturas cujos constituintes sejam
VOLÁTEIS (=“evaporáveis”)
DE FORMA GERAL:
CG é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes tenham PONTOS DE EBULIÇÃO de até 300oC e que
sejam termicamente estáveis.
Cromatografia Gasosa
Equipamento
1
6
1 - Reservatório de Gás e
Controles de Vazão / Pressão.
2 - Injetor (Vaporizador) de
Amostra.
3 - Coluna Cromatográfica e
Forno da Coluna.
4 - Detector.
5 - Eletrônica de Tratamento
(Amplificação) de Sinal.
6 - Registro de Sinal (Registrador
ou Computador).
2
4
5
3
Observação: em azul: temperatura
controlada
Cromatografia Gasosa
Requisitos - Gás de arraste (FM)
INERTE: Não deve reagir com a amostra, nem
com a fase estacionária ou superfícies do
instrumento.
PURO: Deve ser isento de impurezas que
possam degradar a fase estacionária.
Impurezas típicas em
gases e seus efeitos:
H2O, O2
hidrocarbonetos
oxida / hidrolisa algumas FE
incompatíveis com DCE
ruído no sinal de DIC
Cromatografia Gasosa
CUSTO: Gases de
altíssima pureza
podem ser muito
caros.
CUSTO
Requisitos - Gás de arraste (FM)
A
B
C
A = 99,995 % (4.5)
B = 99,999 % (5.0)
C = 99,9999 % (6.0)
PUREZA
COMPATÍVEL COM DETECTOR: Cada detector demanda
um gás de arraste específico para melhor funcionamento.
Seleção de Gases de
Arraste em Função
do Detector:
DCT
He , H2
DIC
N2 , H2
DCE
N2 (SS), Ar + 5% CH4
Cromatografia Gasosa
Injetor
Os dispositivos para injeção (INJETORES ou
VAPORIZADORES) devem prover meios de introdução
INSTANTÂNEA da amostra na coluna cromatográfica
t = 0
Injeção instantânea:
t = x
t = 0
Injeção lenta:
t = x
Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”
1
2
1 - Septo (silicone)
3
4
2 - Alimentação de gás de
arraste)
3 - Bloco metálico aquecido
4 - Ponta da coluna
cromatográfica
Cromatografia Gasosa
Injetor “on column”
1
2
3
1 - Ponta da agulha
da microsseringa é
introduzida no início
da coluna.
2 - Amostra injetada
e vaporizada
instantaneamente no
início da coluna.
3 - “Plug” de vapor
de amostra forçado
pelo gás de arraste a
fluir pela coluna.
Cromatografia Gasosa
Parâmetros de injeção
TEMPERATURA DO INJETOR: Deve ser suficientemente
elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem
decomposição.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da temperatura de ebulição do
componente menos volátil.
VOLUME INJETADO: Depende do tipo de coluna e do estado
físico da amostra.
Sólidos:
convencionalmente
se dissolve em um
solvente adequado e
injeta-se a solução
Amostras
Líquidas
Amostras
Gasosas
empacotada
 = 3,2 mm (1/4”)
0,2 mL ... 20 mL
0,1 mL ... 50 mL
capilar
 = 0,25 mm
0,01 mL ... 3 mL
1 mL ... 100 mL
COLUNA
Cromatografia Gasosa
Microsseringas para injeção
LÍQUIDOS: Capacidades típicas: 1 mL, 5 mL e 10 mL
êmbolo
agulha (inox 316)
Microsseringa de
10 m L:
corpo (pirex)
corpo
agulha
Microsseringa de 1 m L
(seção ampliada):
guia
êmbolo (fio de aço
soldado ao guia)
Cromatografia Gasosa
Colunas
EMPACOTADA
 = 3 a 6 mm
L = 0,5 m a 5 m
Recheada com sólido pulverizado
(FE sólida ou FE líquida
depositada sobre as partículas do
recheio)
CAPILAR
 = 0,1 a 0,5 mm
L = 5 m a 100 m
Paredes internas recobertas com
um filme fino (fração de mm) de
FE líquida ou sólida
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Além da interação com a FE, o tempo que um analito demora
para percorrer a coluna depende de sua PRESSÃO DE
VAPOR (p0).
Estrutura química do analito
p0 = f
Temperatura
da
coluna
Temperatura da coluna
Pressão
de
vapor
ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE
(MENOR RETENÇÃO)
Velocidade
de
migração
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
AUMENTO DA
TEMPERATURA DA COLUNA
CONTROLE CONFIÁVEL
DA TEMPERATURA DA
COLUNA É ESSENCIAL
PARA OBTER BOA
SEPARAÇÃO EM CG
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Misturas complexas (constituintes com volatilidades muito
diferentes) separadas ISOTERMICAMENTE:
TCOL
BAIXA:
TCOL ALTA:
- Componentes mais voláteis são
separados
- Componentes mais voláteis não
são separados
- Componentes menos voláteis
demoram a eluir, saindo como
picos mal definidos
- Componentes menos voláteis
eluem mais rapidamente
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
TEMPERATURA
A temperatura do forno pode ser variada linearmente durante a separação:
TFIM
R
TINI
tINI
Consegue-se boa
separação dos
componentes da
amostra em menor
tempo
TEMPO
tFIM
TINI - Temperatura Inicial
TFIM - Temperatura Final
tINI - Tempo Isotérmico Inicial
tFIM - Tempo Final do Programa
R - Velocidade de Aquecimento
Cromatografia Gasosa
Programação linear de
temperatura
a) Isotérmico a 45 ºC;
b) isotérmico a 145 °C;
c) programado de 30 ºC a 180 ºC
Cromatografia Gasosa
Programação linear de temperatura
Possíveis problemas associados à PLT:
VARIAÇÕES DE VAZÃO
DO GÁS DE ARRASTE: A
viscosidade de um gás
aumenta com a temperatura.
DERIVA
(“DRIFT”)
NA
LINHA DE BASE: Devido ao
aumento de volatilização de
FE líquida
viscosidade
vazão
Cromatografia Gasosa
Fase Estacionária
REGRA GERAL: a FE deve ter características tanto quanto possível
próximas das dos solutos a serem separados (polar, apolar, aromático ...)
FE SELETIVA (ideal): Deve interagir diferencialmente com os
componentes da amostra.
FE Seletiva:
separação adequada dos constituintes
da amostra
FE pouco Seletiva:
má resolução mesmo com coluna de
boa eficiência
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária sólida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE sólida é a ADSORÇÃO
A adsorção ocorre na
interface entre o gás de
arraste e a FE sólida
• Sólidos com grandes áreas superficiais
(partículas finas, poros)
ADSORÇÃO
• Solutos polares
• Sólidos com grande número de sítios
ativos (hidroxilas, pares de elétrons...)
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária líquida
• O fenômeno físico-químico responsável pela interação
analito + FE líquida é a ABSORÇÃO
A absorção ocorre no interior
do filme de FE líquida
(fenômeno INTRAfacial)
• Filmes espessos de FE líquida
ABSORÇÃO
• Grande superfície líquida exposta ao gás
de arraste
• Interação forte entre a FE líquida e o
analito (grande solubilidade)
Cromatografia Gasosa
Fase estacionária quirais
• As propriedades físico-químicas dos isômeros óticos são
MUITO SIMILARES  FE convencionais não interagem
diferencialmente com os isômeros óticos.
PRODUTOS BIOLÓGICOS - Distinção
entre produtos de
origem sintética e natural (natural = normalmente substâncias
oticamente puras; sintético = muitas vezes são misturas racêmicas).
FÁRMACOS - Em
muitos fármacos apenas um dos isômeros óticos
têm atividade farmacológica.
Cromatografia Gasosa
Detectores
Dispositivos que examinam continuamente o material eluído, gerando sinal
quando da passagem de substâncias que não o gás de arraste.
Características ideais:
1. Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2. Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3. Resposta linear para solutos que se estenda por várias
ordens de grandeza.
4. Faixa de temperatura desde a ambiente até pelo menos
400 ºC.
5. Tempo de resposta curto e independente da vazão.
6. Alta confiabilidade e facilidade de uso.
7. Similaridade de resposta para todos os solutos.
8. Não destrutivo.
Cromatografia Gasosa
Detectores
REGISTRO
DE
SINAL
ANALÓGICO
Registradores XY
DIGITAL
Integradores
Computadores
Gráfico Sinal x Tempo = CROMATOGRAMA
Idealmente: cada substância separada aparece como um PICO no cromatograma.
Cromatografia Gasosa
Detectores
DCT
UNIVERSAIS:
Geram sinal para
qualquer
substância eluída.
DCE
SELETIVOS:
Detectam apenas
substâncias
com determinada
propriedade
físico-química.
DNP
ESPECÍFICOS:
Detectam
substâncias que
possuam
determinado
elemento
ou grupo funcional
em suas
estruturas
Cromatografia Gasosa
Detectores
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Variação da condutividade térmica do gás de arraste.
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Íons gerados durante a queima dos eluatos em uma chama de
H2 + ar.
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Supressão de corrente causada pela absorção de elétrons por
eluatos altamente eletrofílicos.
DETECTOR TERMOIÔNICOS (DNP OU NPD): Modificação
do DIC. Os eluatos queimados na chama H2 + ar passam por
uma superfície de silicato de rubídio onde se formam íons de
moléculas com N e P.
Cromatografia Gasosa
Detectores
DETECTOR POR CONDUTIVIDADE TÉRMICA (DCT OU
TCD): Universal. Observa-se para qualquer substância eluída.
Sensibilidade: 0,4 a 1 ng com linearidade até dezenas de mg (104).
DETECTOR POR IONIZAÇÃO EM CHAMA (DIC OU FID):
Quase-universal. Detecta qualquer substância que contenha
ligações C-H. Não responde a gases nobres, H2, O2, N2, CX4, SiX4
(X=halogênio), CO, CO2, CS2, H2O, NO, N2O, NO2, NH3.
Sensibilidade: 10 a 100 pg com linearidade até mg (107 – 108).
DETECTOR POR CAPTURA DE ELÉTRONS (DCE OU ECD):
Seletivo. Responde muito bem a halogenetos orgânicos, aldeídos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Sensibilidade: 0,01
a 1 pg com linearidade até ng. (104)
DETECTOR TERMOIÔNICO (DNP OU NPD): Específico.
Responde a compostos orgânicos com N e P. Sensibilidade: 0,1 a 1 pg
(P) e 0,4 a 10 pg (N) com linearidade até ng. (103 - 105)
Cromatografia Gasosa
Detectores
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico. Um dos
detectores mais poderosos para a cromatografia gasosa é o
espectrômetro de massas. Observa-se para qualquer substância
eluída um sinal, mesmo que complexo, no espectrômetro de massa.
É seletivo ou específico quando monitora-se um fragmento de
determinada razão m/z.
Detecção
TIC
Universal
Similar a DCT
SIM
Seletivo
Maior Sensibilidade
Cromatografia Gasosa
Detectores
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
CONTAGENS
Cromatograma de íons totais:
TIM ou TIC
Em cada posição do
cromatograma tem-se
um espectro de massa.
CONTAGENS
MASSA / CARGA
TEMPO
Cromatografia Gasosa
Detectores
CG-EM (GC-MS): Universal / Seletivo / Específico.
MASSA / CARGA
CONTAGENS
Em cada posição do
cromatograma tem-se
o sinal somente da m/z
selecionada.
Oferece a vantagem
de registrar
somente o sinal do
constituinte de
interesse, sendo
“cego” para os
demais.
CONTAGENS
Cromatograma de íons
selecionados: SIM
TEMPO
Cromatografia Gasosa
Detectores
CG-EM (GC-MS): Interface CG-EM.
EM
CG
Coluna
Capilar
Câmara
de Ionização
Vácuo
Separador Molecular
O gás de arraste leve
(He) difunde mais
rapidamente que o analito
e tende a ser drenado
para o vácuo.
Interface Capilar Direta
Com colunas capilares a
vazão baixa de gás de
arraste pode ser drenada
pelo sistema de vácuo.
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
O parâmetro diretamente mensurável de retenção de um analito é o
TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO, tR’:
tR
SINAL
tR’ = tR - tM
tR = Tempo de Retenção (tempo
decorrido entre a injeção e o ápice
do pico cromatográfico)
tM = Tempo de Retenção do
Composto Não-Retido (tempo
mínimo para um composto que não
interaja com a FE atravesse a
coluna)
tM
TEMPO
tR’ = Tempo de Retenção Ajustado
(tempo médio que as moléculas do
analito passam sorvidas na FE)
Cromatografia Gasosa
Análise qualitativa
Coluna HP-Innowax (PEG – altamente polar): 30 m x 0,25 mm x 0,25 mm
Detector FID: 250 ºC
Injetor com divisão de fluxo 1:25: 250 ºC
Volume injetado: 1 mL
Mistura de benzeno, n-propanona,
n-propanol, n-butanol, isobutanol e
n-pentanol.
Como se explica esta
ordem de eluição?
1. A n-propanona elui primeiro
devido à sua maior volatilidade.
2. O benzeno em segundo devido
sua natureza apolar (menor e).
3. Para os demais compostos,
cujas diferenças de polaridade
não são elevadas, a volatilidade
se torna o principal parâmetro
que define a ordem de eluição.
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
O parâmetro diretamente relacionado à quantidade de analito é:
SINAL
• Altura da banda cromatográfica: não recomendado, pois
a banda necessita ser perfeitamente simétrica.
• Área da banda cromatográfica.
Área
TEMPO
Altura
Cromatografia Gasosa
amostra
Área
Análise quantitativa
Concentração
tempo
Cromatografia Gasosa
Análise quantitativa
MASSA
O fim da zona de linearidade pode
ser detectado quando a razão
(Área / Massa) diverge em mais de
5 % da inclinação da reta na
região linear:
1,05 S
ÁREA / MASSA
ÁREA
A partir de certo
ponto o sinal não
aumenta mais
linearmente
0,95 S
MASSA
Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida
Cromatografia Líquida
Cromatografia em fase líquida
Complete e ganhe
5 pontos:
A. Solventes
B.
C.
D.
E.
F.
G.
H.
I.
J.
K. Computador
L. Impressora
Cromatografia Líquida - CLAE
Aplicabilidade
Quais misturas podem ser
separadas por CLAE ?
para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um líquido
ela deve dissolver-se nesse líquido.
Líquidos e sólidos, iônicos ou covalentes com massa molar
de 32 até 4000000.
DE FORMA GERAL:
CL é aplicável para separação e análise de misturas cujos
constituintes sejam solúveis na FM. Não há limitação de
volatilidade ou de estabilidade térmica.
Cromatografia Líquida
Aumento de polaridade
Insolúvel em água
Solúvel em água
Apolar
Polar não iônico
Tipos e
Partição
102
Aplicações da
Líquida
Adsorção
Massa molecular
Cromatografia
Iônico
103
Partição
em fase
reversa
Partição
em fase
normal
Troca
iônica
104
105
106
Permeação
em gel
Exclusão
Filtração
em gel
Cromatografia Líquida
Esquema de um equipamento completo para CLAE
Cromatografia Líquida
Requisitos dos sistemas de bombeamento
1 – Geração de pressões até 6.000 psi
2 – Saída com ausência de pulsos
3- Velocidades de fluxo de 0,1 a 10 mL/min
4 – Controle e reprodutibilidade de fluxo de
0,5% ou melhor
5 – Componentes resistentes à corrosão
Bomba recíproca (também são chamadas de
bombas de pistão ou de diafragma)
Cromatografia Líquida
Sistemas de injeção de amostras
Suportam pressões de até 7.000 psi
Volumes típicos: 5 a 500 mL
Microamostragem: 0,5 a 5 mL
Cromatografia Líquida
Fase móvel para CLAE
Solvente puros ou misturas de solventes de acordo com a
polaridade requerida na separação.
• Eluição isocrática:
• Quando a separação é feita utilizando um único solvente de
composição constante.
• Eluição com gradiente:
• São utilizados dois ou três sistemas de solventes que
diferem bastante entre si em polaridade.
• Depois que a eluição começa, a razão entre os solventes é
variada de modo programado, de forma contínua ou em
passos.
A eluição com gradiente produz efeitos similares aos
produzidos pela programação de temperatura na CG.
Cromatografia Líquida
Eluição com gradiente
Coluna C18, 5 mm, fase reversa
Detector fluorescência:
excit. 334 nm – emis. 425 nm
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
As colunas geralmente são
construídas de aço inox, embora
tubos de vidro com paredes
resistentes sejam encontrados
ocasionalmente. No entanto, estes
últimos são restritos a pressões
mais baixas do que 600 psi.
Existem comercialmente centenas de colunas
empacotadas, diferindo entre si no tamanho e na fase
estacionária. Preços variam de 200 a 500 dólares.
Cromatografia Líquida
Colunas para CLAE
•Remoção de material particulado
Pré-coluna
•Contaminantes do solvente
•Contaminantes da amostra
•Saturar a FM com a FE
Aumenta a vida útil da coluna
COLUNAS TÍPICAS
•Material: aço inox
•Comprimento: 10 a 30 cm
•Diâmetro: 4 a 10 mm
•FE: Partículas de 5 a 10 mm
•Eficiência: 40 mil a 60 mil
pratos/metro
Cromatografia Líquida
Separação isocrática de alta velocidade
Coluna de alta
velocidade e
alta eficiência
- 4 cm de comprimento
- 0,4 cm d.i.
- FE: spherisorb 3 mm
100.000 pratos/metro
FM: 4,1% EtAc em n-Hexano
1– p-xileno
2- anisol
3- acetato de benzila
4- dioctil-ftalato
5- dipentil-ftalato
6- dibutil-ftalato
7- dipropil-ftalato
8- dietil-ftalato
Cromatografia Líquida
Fase estacionária para CLAE
Basicamente são dois tipos de FE:
• Pelicular:
• Consiste de leitos de polímero ou vidro não-poroso,
esférico, com diâmetros típicos da ordem de 30 a 40 mm,
recoberto com uma camada fina e porosa de:
• Sílica
• Alumina
• Resina de poliestireno-divinil-benzeno
• Resina trocadora de íons
• Partícula porosa:
• Consiste de micropartículas porosas com diâmetros de 3
a 10 mm. As partículas são constituídas dos mesmos
materiais do recobrimento pelicular.
Cromatografia Líquida
Detectores
As características desejáveis para os detectores
para CLAE não são diferentes daquelas para CG.
Existem dois tipos de detectores:
• Propriedades universais (índice de refração, densidade ou
constante dielétrica).
• Propriedades do soluto (absorbância, fluorescência, etc).
Características ideais:
1.Alta sensibilidade: 10-8 a 10-15 g de soluto/s.
2.Boa estabilidade e reprodutibilidade.
3.Resposta linear para solutos que se estenda por várias ordens de
grandeza.
4.Tempo de resposta curto e independente da vazão.
5.Alta confiabilidade e facilidade de uso.
6.Similaridade de resposta para todos os solutos.
7.Não destrutivo.
8.Volume interno mínimo e compatível com a vazão e com a pressão.
Cromatografia Líquida
Detectores
• Absorbância
• UV/Vis – S: 10-9 g/mL – FL: 105
• IV
• Fluorescência – S: 10-9 a 10-12 g/mL – FL: 103
• Índice de refração (universal) –
S: 10-7 g/mL – FL: 104
Cromatografia Líquida
Detectores
• Eletroquímicos: existem vários tipos disponíveis atualmente.
Embora não sejam tão explorados quanto os detectores
ópticos, eles apresentam algumas vantagens como alta
sensibilidade, simplicidade e ampla aplicabilidade.
• Amperométricos
• Coulométricos
• Condutométricos – S: 10-8 g/mL – FL: 104
• Polarográficos – S: 10-12 g/mL – FL: 106
Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa - universal
• Assim como na CG-EM, o acoplamento de um espectrômetro de massa
potencializa a técnica de separação e quantificação
• Um grande problema é o descompasso entre os volumes relativamente
grandes de solventes na CL e os requisitos de vácuo na EM.
Interface CL-EM
Cromatografia Líquida
Detectores
• Espectrometria de massa
SIM
CONTAGENS
CONTAGENS
TIC
CONTAGENS
CONTAGENS
MASSA / CARGA
MASSA / CARGA
TEMPO
TEMPO
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
Ao contrário da CG, onde a FM se comporta como
um gás ideal e não contribui para o processo de
separação, a FM líquida da CLAE interage tanto
quanto a FE com os componentes da amostra.
Isto torna o desenvolvimento dos métodos em
CLAE um tanto mais complexo que na CG.
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• PARTIÇÃO: líquido-líquido e fase ligada. A diferença entre
elas consiste em como a FE é mantida nas partículas do
suporte do empacotamento  Adsorção e ligação química.
Dois tipos podem ser distinguidos: Fase normal e Fase
reversa.
Fase normal: FE de natureza fortemente polar (ex. água)
FM apolar (ex. hexano ou éter isopropílico)
O componente menos polar é eluído primeiro por ser o
mais solúvel na fase móvel.
Fase reversa: FE de natureza apolar (ex. hidrocarbonetos)
FM polar (ex. água, metanol ou acetonitrila)
O componente mais polar aparece primeiro e o aumento
da polaridade da fase móvel aumenta o tempo de eluição.
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• É provável que ¾ de toda a CLAE esteja baseada na fase
reversa ligada, onde o grupo R do siloxano nesses
recobrimentos é uma cadeia C8 (n-octil) ou C18 (n-octadecil)
Cromatografia Líquida
Campo
Tipos de CLAE
Misturas típicas
Farmacêutico
Antibióticos, sedativos, esteróides,
analgésicos
Bioquímico
Aminoácidos, proteínas, carboidratos, lipídios
Produtos alimentícios
Adoçantes artificiais, antioxidantes,
aflatoxinas, aditivos
Produtos químicos
Aromáticos condensados, surfactantes,
propelentes, corantes industriais
Poluentes
Pesticidas, herbicidas, fenóis, PCB (bifenilas
policloradas)
Química forense
Drogas tóxicas, venenos, álcool no sangue,
narcóticos
Clínica médica
Ácidos de bílis, metabólitos de drogas,
extratos de urina, estrógenos
Cromatografia Líquida
Tipos de CLAE
• ADSORÇÃO: líquido-sólido. FE sílica ou alumina. É a forma
clássica da CL introduzida no início do século 20. Sofreu
adaptações e tornou-se o mais importante dos métodos de
HPLC.
• TROCA IÔNICA: líquido-sólido. FE resina com capacidade
de troca iônica.
• EXCLUSÃO: líquido-gel. FE gel. Um material polimérico,
hidrofóbicos ou hidrofílicos, com muitas ligações cruzadas,
são capazes de promover a separação de acordo com os
tamanhos das moléculas  EXCLUSÃO DE TAMANHO. Se o
material reticulado for uma resina de troca iônica, tem-se a
cromatografia de EXCLUSÃO DE ÍONS.
Cromatografia
Para refletir e responder:
A CG pode ser usada indistintamente para qualquer tipo de
analito?
A CL é útil quando a CG não pode ser usada. Quais são os
casos em que isto ocorre?
FIM