KIT CMV BRITE TURBO
Antigenemia para CMV
por Imunofluorescência
Características do Kit
. Resultados em até 2 horas
. Requer de 1 a 2 ml de amostra
. Kit completo
. Procedimento simples
. Fácil interpretação do resultado
. Recomendado para diagnóstico e
monitoramento de infecções por CMV
. Registrado na Anvisa e FDA (EUA)
Apresentação da Técnica
I. Preparação da suspensão de leucócitos
. Diluir a solução de lise 1:10 em água destilada (4oC).
. Misturar 1ml de sangue e completar para 15 ml
com a solução de lise e incubar por 15 min a 4oC.
. Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante.
. Repetir a lise se a primeira for insuficiente, por 5 min.
. Ressuspender o pellet em 5 ml de PBS.
. Centrifugar p/3 min a 2500 rpm. Desprezar sobrenadante.
. Ressuspender o pellet em 0,5 ml de PBS (em pacientes
com neutropenia severa pode-se suspender am até 0,2 ml).
II. Contagem e Concentração Celular
. Utilizar hemocitômetro, contador automático celular
ou câmara de Neubauer
. Ajustar a concentração em 2x106 células por ml
com PBS (ou a critério da instituição).
III. Preparação de lâminas de Citocentrifugado
. Centrifugar 100 μl da suspensão celular a 600 rpm
por 4 minutos em lâminas de vidro na citocentrífuga.
. Preparar pelo menos 2 lâminas por amostra de cada
paciente (1 p/ o teste e outra p/ reserva técnica).
. Secar as lâminas por 20 minutos.
. Circundar o citocentrifugado c/ caneta hidrofóbica.
Obs: As lâminas podem permanecer overnight antes da
fixação
IV. Fixação e Permeabilização
. Diluir o fixador (reag. B) 1:5 em PBS em frasco
escuro antes de usar.
. Diluir a solução de permeabilização (reag. C) 1:5 em
PBS em frasco escuro antes de usar. Não reutilize.
. Imergir as lâminas no fixador diluído por 5 min a
temperatura ambiente em câmara escura.
. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las
imersas por 3 min.
. Imergir as lâminas na sol. de permeabilização diluída
por 1 min a temperatura ambiente em câmara escura.
. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las
imersas por 5 min. Não ultrapassar 60 min.
V. Armazenamento de lâminas (congelamento)
. Secar com ventilador por 20 minutos.
. Embalar em papel laminado e estocar a 4o C ou
congelar a -20o C.
Obs: Quando for utilizar, rehidratar por 5 min com PBS.
VI. Coloração por Imunofluorescência
. Não deixar que as lâminas sequem durante a coloração.
. Rehidratar as lâminas e o controle em PBS por 1 a 2 min.
. Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e
secar cuidadosamente a área do citocentrifugado.
. Aplicar 35 μl do anticorpo monoclonal primário
e incubar por 20 min a 37o em câmara úmida e escura.
. Lavar as lâminas 3x com PBS e, na terceira, deixá-las
imersas por 3 min.
VI. Coloração por Imunofluorescência (cont.)
. Remover 1 lâmina por vez da solução de lavagem, e
secar cuidadosamente a área do citocentrifugado.
. Aplicar 35 μl do anticorpo conjugado e incubar por
20 min a 37o em câmara úmida e escura.
. Lavar 2 vezes em PBS e retirar o excesso batendo a
Lâmina em papel absorvente.
. Montar com glicerina tamponada diluída e cobrir com
lamínula.
VII. Leitura das lâminas
. Realizar a leitura assim que possível. As lâminas
podem ser estocadas a 4o C em câmara fechada para
minimizar a perda da fluorescência.
. Utilizar microscópio de fluorescência usando aumento
de 400x. O aumento de 1000x pode ser usado para
aumentar a resolução e tirar dúvidas.
. Ler toda a lâmina. Células positivas mostram coloração
verde-amarelada no núcleo polilobulado da célula.
VIII. Controle de Qualidade
Controle Positivo
. Lâminas controle negativas e positivas devem ser coradas
Em paralelo com as amostras para demonstrar coloração apropriada. O controle positivo mostra coloração
homogênea verde-amarelada ao redor do núcleo. O
controle negativo não apresenta coloração verde-amarelada. Se os controles não apresentarem estes resultados a coloração deve ser considerada inválida.