NOVA Lite® dsDNA Crithidia luciliae Kits/Substrate Slides
Para Diagnóstico In Vitro
Código do Produto: 708200, 708205
508200.10, 508205.20, 508205.80
Complexidade CLIA: Elevada
Aplicação Diagnóstica
®
NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae é um ensaio imunofluorescência indirecta para o rastreio e
determinação semi-quantitativa de anticorpos anti-duplicação de DNA entrançado (dsDNA) no soro humano.
A presença de anticorpos antinucleares pode ser usada em conjunto com outros testes serológicos e
descobertas clínicas para ajudar no diagnóstico de lúpus eritematoso sistémico (SLE).
Resumo e Explicação do teste
®
O teste NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae é um teste de anticorpo imunofluorescente indirecto que
emprega o hemoflagelado, Crithidia luciliae, como um substrato. Este organismo de célula única possui uma
mitocondria gigante contendo uma massa altamente condensada de dsDNA circular.1 Esta massa de
dsDNA, conhecida como o cinetoplasto, parece estar isenta de histonas ou de outros antígenos nucleares
mamíferos.1,2 Funciona como um substrato sensível e específico para detectar auto-anticorpos para dsDNA.
Os auto-anticorpos para dsDNA ocorrem quase exclusivamente em pacientes com lúpus eritematoso
sistémico (SLE) e como tal são considerados anticorpos marcadores. Os auto-anticorpos para dsDNA foram
incluídos nos Critérios Revistos de 1982 para a Classificação de Lúpus Eritematoso Sistémico por uma
subcomissão da Associação de Artrite e Reumatismo.3
Enquanto que o teste Anticorpo Antinuclear (ANA) usado normalmente é um teste de rastreio sensível para
SLE e outras doenças de tecido conjuntivo, não é de modo algum específico para SLE. Em consequência
disto, todas as amostras de ANA positivas deverão ser testadas para anticorpos específicos para dsDNA. A
presença de anticorpos para dsDNA indica fortemente SLE; no entanto, a ausência destes anticorpos não
exclui SLE em todos os casos.
Foram empregados uma diversidade de métodos ao longo dos anos para detectar anticorpos para dsDNA.
Estes métodos incluem fixação de complemento4, aglutinação passiva5 e RIA.6-8 A vantagem principal de um
C. luciliae baseado no teste dsDNA é a sua especificidade, devido à natureza da massa enrolada fortemente
de dsDNA circular no cinetoplasto.9-11 Esta característica é extremamente importante para um teste de
anticorpo marcador.
Princípio do Procedimento
Na técnica de imunofluorescência indirecta, as amostras são incubadas com o substrato antigénico e
anticorpos não reactivos são retirados. O substrato é incubado com conjugado especifico marcado com
fluoresceína e depois o reagente em excesso é retirado. Quando se observa através de um microscópio de
fluorescência, as amostras positivas com auto-anticorpos, exibirão uma fluorescência verde maçã
correspondendo às áreas da célula ou do núcleo onde se ligaram os auto-anticorpos.
Composição do dispositivo
1.
Lâminas de substrato Crithidia luciliae (dsDNA); 12 poços/lâmina ou 6 poços/lâmina, com excicante
Apenas em kit
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Conjugado IgG Anti-Humano (cabra) sem Evan’s azul, marcado com fluoresceína em tampão
contendo 0,09% de azida de sódio
Controlo dsDNA, 1 frasco de tampão contendo 0,09% de azida de sódio e anticorpos de soro
humano para dsDNA, pré-diluído
Controlo Negativo IFA, 1 frasco de tampão contendo 0,09% de azida de sódio e sem anticorpos de
soro humano para dsDNA, pré-diluído
PBS II concentrado (40x)
Meio de Montagem, 0,09% de azida de sódio
Lamelas
Advertências
1.
2.
Todo o material de origem humana usado na preparação de controlos para este produto foi testado e
considerado negativo para anticorpos anti HIV, HBsAg, e HCV pelos métodos aprovados pela FDA.
No entanto, nenhum teste pode garantir segurança total em relação à ausência de HIV, HBV, HCV
ou de outros agentes infecciosos. Assim, o Controlo de Padrão de Ponto Final de Titulagem ANA e o
Controlo Negativo IFA deverão ser manuseados como material potencialmente infeccioso.12
A Azida de Sódio é usada como um conservante. A Azida de Sódio é um veneno e pode ser tóxica
se for ingerida ou absorvida através da pele ou dos olhos. A azida de sódio pode reagir com chumbo
ou com canalizações de chumbo para formar azidas metálicas potencialmente explosivas. Lave as
bacias, se forem usadas para despejar reagentes, com grandes volumes de água para impedir a
formação de azida.
1
3.
4.
Use equipamento de protecção pessoal apropriado enquanto trabalhar com os reagentes fornecidos.
Os reagentes derramados deverão ser limpos imediatamente. Cumpra todos os regulamentos
ambientais federais, estatais e locais quando descartar detritos.
Precauções
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Este produto (kit) é para Uso de Diagnóstico In Vitro.
A substituição de componentes do dispositivo, por componentes diferentes dos fornecidos neste
sistema pode conduzir a resultados inconsistentes.
A lavagem incompleta ou ineficiente dos poços IFA pode causar uma elevada interferência de fundo.
A adaptação deste ensaio para uso com processadores de amostras automatizados e outros
dispositivos de manuseamento de líquidos, totalmente ou em parte, podem produzir diferenças nos
resultados dos testes em relação aos obtidos com o procedimento manual. É da responsabilidade de
cada laboratório validar os seus procedimentos automatizados.
Uma diversidade de factores influencia o desempenho dos ensaios. Estes incluem a temperatura de
início dos reagentes, a potência da lâmpada do microscópio usado, a exactidão e reprodutibilidade
da técnica de pipetagem, a eficácia de lavagem e a duração dos períodos de incubação durante o
ensaio. É necessária uma atenção cuidadosa em relação à consistência para obter resultados
exactos e reprodutíveis.
É recomendado um cumprimento rigoroso dos protocolos.
Condições de Armazenamento
1.
2.
Armazene todos os lâminas e reagentes a 2-8°C. Não congele. Os reagentes ficam estáveis até à
data de validade quando são armazenados e manuseados conforme indicado.
O tampão PBS II diluído é estável durante 4 semanas a 2-8°C.
Colheita de Amostras
Este procedimento deverá ser efectuado com uma amostra de soro. A adição de azida ou de outros
conservantes às amostras podem afectar negativamente os resultados. Amostras com contaminação
microbiana, tratadas termicamente ou contendo partículas visíveis não deverão ser usadas. As amostras de
soro com hemólise macroscópica ou altamente lipémica deverão ser evitadas.
Após colheita, o soro deverá ser separado do coágulo. O Documento H18-A3 da NCCLS (CLSI) recomenda
as seguintes condições de armazenamento para as amostras: 1) Armazene as amostras à temperatura
ambiente durante um período não superior a 8 horas. 2) Se o ensaio não estiver concluido dentro de 8 horas,
guarde a amostra a 2-8°C. 3) Se o ensaio não for efectuado em 48 horas, ou se houver transporte da
amostra, congele a -20°C ou a temperatura inferior. As amostras congeladas devem ser bem misturadas
após descongelação e antes do teste.
Procedimento
Material fornecido (kits)
708200
10
1
1
1
1
1
1
Laminas com Substrato Crithidia luciliae (dsDNA), 6- poços
4 ml de FITC Conjugado IgG Anti-Humano
0,5 ml de Controlo dsDNA
0,5 ml de Controlo Negativo IFA
25 ml de PBS II Concentrado (40x)
7 ml de Meio de Montagem
10 Lamelas
708205
20
1
1
1
2
1
1
Laminas com Substrato Crithidia luciliae (dsDNA), 12- poços
4 ml de FITC Conjugado IgG Anti-Humano
0,5 ml de Controlo dsDNA
0,5 ml de Controlo Negativo IFA
25 ml de PBS II Concentrado (40x)
7 ml de Meio de Montagem
20 Lamelas
Material fornecido (lâminas)
508200.10
508205.20
508205.80
10 x dsDNA Crithidia luciliae Lâminas com Substrato, 6- poços
20 x dsDNA Crithidia luciliae Lâminas com Substrato, 12- poços
80 x dsDNA Crithidia luciliae Lâminas com Substrato, 12- poços
Material Necessário Não Fornecido
Micropipetas de 15-1000 µL de volume
Água destilada ou desionizada
Frascos de pressão ou pipetas Pasteur
Câmara húmida
Recipiente de 1L (para diluir PBS II)
Tinas
Microscópio de fluorescência com filtro de 495 nm e filtro barreira de 515 nm
2
Método
Antes de começar
1.
2.
3.
Todos os componentes devem encontrar-se á temperatura ambiente (20-26ºC) e ser bem
misturados.
Diluir o PBS II Concentrado : IMPORTANTE: Dilua o PBS II Concentrado 1:40 adicionando o
conteúdo do frasco de PBS II Concentrado para 975 ml de água destilada ou desionizada e misture
completamente. O tampão PBS II é usado para diluir as amostras dos doentes e como tampão de
lavagem. O tampão diluidopode ser armazenado até 4 semanas a 2-8°C.
Diluir as Amostras :
a.
Rastreio Inicial: Dilua as amostras 1:10 com o tampão PBS II diluido (i.e., adicione 100 µL de
soro para 900 µL de Tampão PBS II).
b.
Titulação: Faça diluições em série, duplas, a partir da diluição de rastreio inicial para todas as
amostras positivas com Tampão PBS II diluído (i.e. 1:20, 1:40,... 1:640).
Procedimento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Preparar as Lâminas: Deixe que a Lâmina atinja a temperatura ambiente antes de a remover da
saqueta. Marque-a com um lápis e coloque-a numa câmara húmida adequada. Adicione uma gota
(20-25 µL) do controlo não diluído positivo e negativo aos poços 1 e 2 respectivamente. Adicione 1
gota (20-25 µL) da amostra do doente diluída aos poços remanescentes.
Incubação da Lâmina: Incube a lâmina durante 30 ±5 minutos numa câmara húmida (uma toalha de
papel humedecida colocada numa base plana de um recipiente de plástico ou de vidro fechado
manterá as condições de humidade adequadas). Não deixe secar o substrato durante o
procedimento.
Lavagem de Lâminas: Após a incubação, use um frasco de pressão de plástico ou uma pipeta para
lavar suavemente o soro com o tampão PBS II diluído. Oriente a lâmina e o fluxo do tampão PBS II
de modo a minimizar o transbordo das amostras entre os poços. Evite direccionar o fluxo
directamente para os poços para impedir danos nos substratos. Coloque as lâminas na tina de
lavagem com PBS II diluído durante mais 5 minutos. Se desejado, coloque as lâminas em um frasco
de Coplin do amortecedor diluído de PBS II por até 5 minutos.
Adição de Conjugado Fluorescente: Deite fora o excedente do tampão PBS II. Coloque novamente
a lâmina na câmara húmida e cubra imediatamente cada poço com uma gota de conjugado
fluorescente. Incube as lâminas durante mais 30 + 5 minutos.
Lavagem de Lâminas: Repita o Passo 3.
Lamela: O procedimento para colocar a lamela varia de laboratório para laboratório; no entanto, são
recomendados os seguintes procedimentos:
a.
Coloque uma lamela numa toalha de papel.
b.
Aplique meio de montagem numa linha contínua na extremidade da lamela.
c.
Deite fora o excesso de tampão PBS II e toque com a extremidade inferior da lâmina na
extremidade da lamela. Baixe a lâmina suavemente no sentido da lamela de tal modo que o
meio de montagem flua para a extremidade superior da lâmina sem a formação de bolhas de
ar ou artefactos.
Controlo de Qualidade
O Controlo dsDNA o Controlo Negativo IFA deverão ser colocados em todas as lâminas para assegurar que
todos os reagentes e procedimentos foram efectuados correctamente. Outros controlos adequados podem
ser preparados alíquotando amostras de soro humano e armazenando a < -70°C. De forma a que os
resultados dos testes sejam considerados válidos, todos os critérios defenidos devem ser satisfeitos. Se
algum destes critérios não for satisfeito, os resultados do teste deverão ser considerados inválidos e o
ensaio deverá ser repetido.
1.
O Controlo dsDNA não diluído deve ser > 2+.
2.
O Controlo Negativo IFA deve ser negativo.
Interpretação dos Resultados
Reacção Negativa. Uma amostra é considerada negativa se a fluorescência cinetoplasto específica for igual
ou inferior ao Controlo Negativo IFA. A fluorescência de outras estruturas tais como o corpo basal, o flagelo
ou o núcleo sem coloração concomitante do cinetoplasto deverá ser considerada negativa, para reactividade
de dsDNA.
Reacção Positiva. Uma amostra é considerada positiva se a fluorescência cinetoplasto específica ou o
cinetoplasto mais a fluorescência nuclear específica for superior ao Controlo Negativo IFA.
Determine o grau ou intensidade de fluorescência usando estes critérios:
4+
Fluorescência verde maçã brilhante
3+
Fluorescência verde maçã clara
2+
Fluorescência positiva claramente distinguível
1+
Fluorescência específica mais baixa que permite que a fluorescência cinetoplasto seja
claramente diferenciada da fluorescência de fundo
3
Limitações do Procedimento
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
O utilizador deverá ter consciência dos efeitos do excesso de anticorpos e da possibilidade de obter
padrões de coloração não-dsDNA enquanto lê as lamelas.
Uma diversidade de factores externos influenciam a sensibilidade do teste incluindo o tipo de
microscópio de fluorescência usado, a potência e a idade da lâmpada, a ampliação usada, o sistema
de filtro e o observador .
Se for usado um filtro diferente do filtro de barreira 515, pode ser observado uma fluorescência
artificial aumentada.
Deve apenas ser usado um lápis para etiquetar as lâminas. A utilização de qualquer outro material de
escrita pode provocar fluorescência artificial.
Todas as tinas usadas para lavagem de lâminas deverão estar isentas de todos os resíduos de
corantes. O uso de tinas contendo resíduos de corantes pode provocar fluorescência artificial.
Os resultados deste ensaio deverão ser usados em conjunto com descobertas clínicas e outros
testes serológicos.
As características do ensaio não foram estabelecidas para matrizes diferentes do soro.
As lâminas vendidas em separado têm a classificação de “Reagentes específicos de analitos”.
®
Excepto como componente do kit NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae, as características analíticas e de
desempenho não foram estabelecidas.
Valores Esperados
®
Utilizando o teste NOVA Lite dsDNA Crithidia luciliae, foram testados diversos doentes com doenças do
tecido conjuntivo, bem como 200 dadores de sangue aleatórios . Os resultados obtidos foram os seguintes:
Grupo
SLE
Lúpus Induzido por Medicamento
Artrite Reumatóide
Escleroderme
Dermatomiosite
Síndroma de Sjogren
Normais
®
Número
Número de Positivos NOVA Lite dsDNA
Crithidia luciliae
42
0
0
0
0
0
0
105
24
40
24
14
14
200
4
Referências
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
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Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 5th Edition. Centers for Disease
Control/National Institute of Health, 2009
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