ALK IQFISH Break-Apart Probe
Referência G111600-8
Finalidade
A ALK IQFISH Break-Apart Probe destina-se à detecção de redisposições que envolvem o gene
ALK através de hibridização in situ fluorescente (FISH). A sonda deve ser utilizada em secções de
tecido pulmonar impregnado em parafina.
Resumo
As sondas para quebrar são constituídas por duas sondas secundárias concebidas para se encontrarem
em lados opostos do ponto de quebra da translocação de um determinado gene, cada uma das quais
identificada com uma cor diferente. Estas sondas geram sinais nas células normais que têm
aproximadamente o mesmo tamanho e que estão co-localizadas (2 fusão). Após uma translocação, os
sinais são “decompostos” e deixam de estar co-localizados (por exemplo: 1 vermelho, 1 verde, 1 fusão).
Componentes
do kit
Componente
Referência
Volume
Conservação
ALK IQFISH Break-Apart Probe
G111600-85510
200 μl
–20 °C
Mantenha a ALK IQFISH Break-Apart Probe ao abrigo da luz sempre que for possível. Um
certificado de análise é igualmente expedido com o kit.
Avisos e
precauções
1 Para utilização em diagnóstico in vitro.
2 Evitar a contaminação microbiana, que pode causar resultados incorrectos.
3 Todas as amostras e materiais biológicos com os quais entram em contacto devem ser
manuseados como sendo potencialmente infecciosos e eliminados com as precauções
adequadas, em conformidade com os regulamentos locais, estatais e federais. Consultar as
precauções adequadas relativas aos agentes patogénicos transportados pelo sangue indicadas
pelas suas instalações ou pelos regulamentos locais. Nunca pipetar com a boca. Evitar o
contacto da amostra com a pele e membranas mucosas.
Agilent Technologies
4 Ter as precauções convencionais ao obter, manusear e eliminar os reagentes potencialmente
carcinogénicos.
5 Ter cuidado para evitar a contaminação cruzada das amostras durante todas as etapas deste
procedimento, dado que este facto pode conduzir a resultados incorrectos.
6 Utilizar luvas sem pó, sempre que possível, para minimizar a introdução de partículas de pó na
amostra ou nos materiais do kit.
7 Uma vez aberto, este produto permanece estável durante 30 dias quando armazenado à temperatura
de conservação recomendada.
8 Comprovou-se que o desempenho do kit permanece inalterado com, no máximo, 22 ciclos de
congelamento e descongelamento.
9 A interpretação clínica de quaisquer resultados de testes deverá ser avaliada dentro do contexto do
historial médico do doente e de outros resultados de testes laboratoriais de diagnóstico por pessoal
qualificado.
10 Recomenda-se a utilização de lâminas de controlo.
Utilização de
lâminas de
controlo
Recomenda-se que as lâminas de controlo sejam processadas simultaneamente com as lâminas do doente
para monitorizar o desempenho do ensaio e para avaliar a exactidão da contagem de sinais.
Informações de
segurança
A(s) Ficha(s) de Dados de Segurança do Material (FDSM) encontra(m)-se disponível(is) em
www.agilent.com.
Indicações de
instabilidade ou
deterioração
Inspeccionar as embalagens aquando da recepção. Se a etiqueta inviolável estiver aberta na zona das
perfurações, não utilize o conteúdo da embalagem. Para obter assistência ou apoio técnico, contacte a
Agilent Genomics.
Procedimento
para o fluxo de
trabalho
Utilizar a sonda IQFISH em secções de tecido fixado em formol e impregnado em parafina (FFPE). É
fornecido um protocolo na tabela abaixo. O protocolo utiliza os reagentes do Dako Histology Accessory
Kit (Dako refª K5799).
Preparar as lâminas para o método FISH
1 Preparar os reagentes Dako Histology.
• Preparar 50 mL de 1× Dako Pre-Treatment Solution num frasco Coplin.
• Preparar 500 mL de 1× Dako Wash Buffer.
2 Efectuar a desparafinagem das amostras.
• Opcional: Incubar as lâminas das amostras a 60 ºC durante 1 hora.
• Incubar as lâminas num frasco de xilol (ou substitutos de xilol) durante 5 minutos à temperatura ambiente.
Substituir com xilol recém-preparado e incubar durante mais 5 minutos.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 100% durante 2 minutos à temperatura ambiente. Substituir com
etanol a 100% recém-preparado e incubar durante mais 2 minutos.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 70% durante 2 minutos à temperatura ambiente. Substituir com etanol
a 70% recém-preparado e incubar durante mais 2 minutos.
• Incubar as lâminas num frasco de 1× Dako Wash Buffer durante 2 a 5 minutos à temperatura ambiente.
ALK IQFISH Break-Apart Probe
2
3 Pré-tratar as amostras com Dako Pre-Treatment Solution utilizando a Opção 1 ou Opção 2.
Opção 1: Pré-tratar utilizando um banho de água
• Pré-aquecer o frasco de 1× Dako Pre-Treatment Solution a 98 °C num banho de água. Monitorizar a temperatura
dentro do frasco utilizando um termómetro calibrado para assegurar que a temperatura atinge, no mínimo, 95 °C
sem alcançar o ponto de ebulição de 100 °C.
• Adicionar as lâminas ao frasco de 1× Dako Pre-Treatment Solution. Incubar durante 10 minutos a 98 °C.
• Retirar o frasco do banho de água. Remover a tampa e permitir que o conteúdo arrefeça durante 15 minutos à
temperatura ambiente.
• Incubar as lâminas num frasco de 1× Dako Wash Buffer durante 3 minutos à temperatura ambiente. Substituir
com 1× Dako Wash Buffer recém-preparado e incubar durante mais 3 minutos.
Opção 2: Pré-tratar utilizando um microondas
• Adicionar as lâminas do frasco de 1× Dako Pre-Treatment Solution e colocar o frasco num forno de microondas de
1100 watts. Aquecer com a potência a 100% até a solução começar a entrar em ebulição (~1–3 minutos).
• Aquecer com uma potência a 10–20% durante 10 minutos para manter a solução imediatamente abaixo da
temperatura do ponto de ebulição. Se utilizar um microondas com detecção de vapor, aquecer durante 10 minutos
utilizando a função de detecção.
• Retirar o frasco do microondas. Remover a tampa e permitir que arrefeça durante 15 minutos à temperatura
ambiente.
• Incubar as lâminas num frasco de 1× Dako Wash Buffer durante 3 minutos à temperatura ambiente. Substituir
com 1× Dako Wash Buffer recém-preparado e incubar durante mais 3 minutos.
4 Proceder à digestão das proteínas utilizando Pepsin.
• Utilizando um toalhete sem pêlos, secar a área da lâmina em torno da amostra sem tocar na amostra.
• Adicionar 5 gotas de Dako Pepsin Solution fria a cada lâmina, cobrindo a amostra com líquido.
• Incubar as lâminas a 37 ºC durante 7 minutos.
• Incubar as lâminas num frasco de 1× Dako Wash Buffer durante 3 minutos à temperatura ambiente. Substituir
com 1× Dako Wash Buffer recém-preparado e incubar durante mais 3 minutos.
5 Desidratar as amostras.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 70% durante 2 minutos à temperatura ambiente.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 85% durante 2 minutos à temperatura ambiente.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 100% durante 2 minutos à temperatura ambiente.
• Deixar que as lâminas sequem por completo à temperatura ambiente.
Hibridização com a sonda FISH
1 Descongelar a sonda (ALK IQFISH Break-Apart Probe).
• Descongelar a sonda IQFISH à temperatura ambiente.
• Colocar o frasco num agitador tipo vortex durante 15 segundos e, em seguida, centrifugar por breves momentos
numa microcentrífuga.
2 Desnaturar a sonda e o ADN cromossómico.
• Pipetar 10 μL da sonda IQFISH numa lâmina, cobrindo a amostra com líquido. Cobrir com uma lamela de vidro.
• Selar as extremidades da lamela com Dako Coverslip Sealant.
• Incubar as lâminas a 80 ºC durante 10 minutos.
3 Hibridizar a sonda com os cromossomas.
• Reduzir a temperatura de incubação para 45 °C. Incubar as lâminas a 45 °C durante 1–2 horas.
Lavar e visualizar lâminas
1 Lavar as lâminas.
• Preparar 100 mL de 1× Dako Stringent Wash Buffer. Dividir o tampão em dois frascos Coplin.
• Pré-aquecer um dos frascos a 63 °C num banho de água. Deixar o outro frasco à temperatura ambiente.
• Trabalhando com uma lâmina de cada vez, descolar o Dako Coverslip Sealant e, em seguida, remover a lamela. À
medida que conclui este processo em cada lâmina, colocá-la no frasco de 1× Dako Stringent Wash Buffer à
temperatura ambiente.
• Transferir as lâminas do frasco de 1× Dako Stringent Wash Buffer que se encontra no banho de água a 63 °C.
Incubar as lâminas a 63 ºC durante exactamente 10 minutos.
• Incubar as lâminas num frasco de 1× Dako Wash Buffer (não de Stringent Wash Buffer) durante 3 minutos à
temperatura ambiente. Substituir com 1× Dako Wash Buffer recém-preparado e incubar durante mais 3 minutos.
ALK IQFISH Break-Apart Probe
3
2 Desidratar as amostras.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 70% durante 2 minutos à temperatura ambiente.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 85% durante 2 minutos à temperatura ambiente.
• Incubar as lâminas num frasco de etanol a 100% durante 2 minutos à temperatura ambiente.
• Deixar que as lâminas sequem por completo à temperatura ambiente, num local escuro.
3 Visualizar os resultados.
• Pipetar 10 μL de meio de montagem na lâmina e adicionar uma lamela.
• Visualizar a lâmina num microscópio de fluorescência com um filtro duplo Cy3/FITC ou laranja/verde.
Conservar as lâminas a –20 °C.
Limitações do
procedimento
Apoio Técnico
Para um desempenho adequado, é vital que se proceda a uma conservação e manuseamento adequados
dos reagentes e das amostras. Todo o equipamento de laboratório utilizado para preparar o alvo durante
este procedimento deverá ser calibrado e alvo de manutenção para assegurar a exactidão dos resultados.
A medição incorrecta dos reagentes pode afectar o resultado do procedimento.
Country
E-mail
Austria
[email protected]
Telephone (Local toll-free)
01 25125 6800
Belgium
[email protected]
02 404 92 22
Denmark
[email protected]
45 70 13 00 30
Finland
[email protected]
010 802 220
France
[email protected]
0810 446 446
Germany
[email protected]
0800 603 1000
Italy
[email protected]
800 012575
Netherlands
[email protected]
020 547 2600
Spain
[email protected]
901 11 68 90
Sweden
[email protected]
08 506 4 8960
Switzerland
[email protected]
0848 8035 60
UK/Ireland
[email protected]
0845 712 5292
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Tabela de
símbolos
Número de catálogo
Conformidade Europeia
Número de lote
Data limite de utilização
Limite de temperatura
Fabricante
Conteúdo suficiente para <n> testes
Produto médico para diagnóstico in vitro
Irritante
Consultar as instruções de utilização
Representante autorizado na Comunidade Europeia
ALK IQFISH Break-Apart Probe
4
Agilent Technologies, Inc.
1834 State Highway 71 West
Cedar Creek, Texas 78612
EUA
AGILENT TECHNOLOGIES FRANCE
PARC TECHNOPOLIS - ZA COURTABOEUF
3 AVENUE DU CANADA
CS 90263
91978 LES ULIS CEDEX
FRANÇA
© Agilent Technologies, Inc. 2014
Revisão A1, Dezembro de 2014, Português
*5990-7277*
5990-7277
ALK IQFISH Break-Apart Probe
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