UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA
POLIGALACTURONASE DE Cylindrocladium pteridis
RAFAELA INÊS DE SOUZA LADEIRA
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2013
i
RAFAELA INÊS DE SOUZA LADEIRA
PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE UMA
POLIGALACTURONASE DE Cylindrocladium pteridis
Dissertação
apresentada
à
Universidade
Federal de Ouro Preto como parte das
exigências do Programa de Pós-graduação
em Biotecnologia, para obtenção do título de
Magister Scientiae.
OURO PRETO
MINAS GERAIS – BRASIL
2013
ii
Dedico este trabalho
A Deus
Aos meus pais
Aos meus irmãos
À Giries Tanus Àzar Júnior
“Se vi mais longe foi por estar de pé
sobre o ombro dos gigantes”
Isaac Newton
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me permitir chegar até aqui me dando força, sabedoria e me
iluminando nos momentos difíceis.
Aos meus pais e irmãos pelo amor incondicional e por acreditarem no
meu potencial
Ao meu noivo Giries, pelo incentivo, apoio, compreensão e carinho.
À Universidade Federal de Ouro Preto e ao Programa de Pós-graduação
em Biotecnologia pela oportunidade e pelo suporte acadêmico.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular por disponibilizar sua estrutura laboratorial para realização
dos experimentos.
A Capes pela bolsa concedida.
À minha orientadora Professora Valéria Monteze Guimarães, pela
confiança no meu trabalho, pela paciência, conselhos e amizade. Enfim, por ter
me motivado em todos os momentos.
Ao Professor Sebastião Tavares de Resende, pela co-orientação neste
trabalho.
Aos professores Ieso de Miranda Castro e Luciano Gomes Fietto, por
aceitar o convite de composição da banca e me auxiliar nas correções e
nas melhorias deste trabalho.
A
todos
os
professores
do
Programa
de
Pós-graduação
em
Biotecnologia da Universidade Federal de Ouro Preto, pelo conhecimento
compartilhado que tanto contribuiu para minha formação profissional.
Ao
estudante
de
pós-doutorado
Daniel
Luciano
disponibilidade e ajuda ao longo do mestrado.
À Petiane, pelo auxílio nos experimentos iniciais.
iv
Falkoski
pela
A todos os meus amigos do grupo de pesquisa coordenado pela
professora Valéria e pelo professor Sebastião, em especial a Rafaela Ventorim,
Larissa Trevizano e Maíra Nicolau, pelo auxílio constante, torcida e prazer da
convivência.
Aos amigos de laboratório Tiago Leal e Cristina Alves, pelo papel
fundamental na parte final dos experimentos e por tornar tudo mais leve.
Obrigada por tudo!
Aos amigos do Mestrado em Biotecnologia, especialmente à Rafa,
Thalita, Cris e Diogo por tornar a minha estadia em Ouro Preto mais agradável.
Foi um prazer conhecê-los.
Ao
Josino,
secretário
do
programa
de
pós-graduação
em
Biotecnologia, por sempre me socorrer e retirar todas minhas dúvidas até
mesmo por e-mail.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular da Universidade Federal Viçosa, especialmente ao secretário
Eduardo Pereira Monteiro e ao técnico Jean, por se mostrarem sempre tão
solícitos.
À família de Ana Pimenta pela acolhida e suporte durante minha
passagem por Ouro Preto.
Às minhas amigas Brenda, Ana, Bel, Paola, Thábata e todas as amigas
de Coimbra por compreender a ausência durante esses dois anos.
A toda minha família, especialmente minha vó Dinah, que se fez
presente durante toda a minha vida. Agradeço suas orações!
A todas as pessoas que direta ou indiretamente torceram e contribuíram
de alguma forma, meu muito obrigado.
Agradeço a todos os gigantes presentes nessa caminhada!
v
BIOGRAFIA
RAFAELA INÊS DE SOUZA LADEIRA, filha de Nilson Geraldo Ladeira e
Maria Terezinha de Souza Ladeira, nasceu na cidade de Coimbra, Minas
Gerais, em 28 de abril de 1987.
Em janeiro de 2011, graduou-se em Bioquímica pela Universidade
Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil.
Iniciou o Programa de Pós-graduação em Biotecnologia em março de
2011, em nível de mestrado, na Universidade Federal de Ouro Preto, Minas
Gerais, Brasil. Submetendo-se à defesa de dissertação em 18 de março de
2013.
vi
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS E TABELAS ...................................................................... x
RESUMO........................................................................................................... xii
ABSTRACT ...................................................................................................... xiv
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 3
2.1. Parede celular de plantas ........................................................................ 3
2.1.1. Composição da parede celular ...................................................... 3
2.2. Pectina ..................................................................................................... 5
2.2.1. Elementos estruturais da pectina ................................................... 6
2.2.1.1. Homogalacturonana .......................................................... 6
2.2.1.2. Xilogalacturonana.............................................................. 7
2.2.1.3. Rhamnogalacturonana I .................................................... 7
2.2.1.4. Rhamnogalacturonana II ................................................... 8
2.2.1.5. Arabinana, arabinogalactana I e II..................................... 8
2.2.2. Função da pectina .......................................................................... 9
2.2.2.1. Funcionalidade na planta .................................................. 9
2.2.3. Aplicações da pectina .................................................................... 9
2.2.4. Degradação da pectina ................................................................ 11
2.2.4.1. Degradação química ....................................................... 11
2.2.4.2. Degradação enzimática ................................................... 13
2.3. Pectinases ............................................................................................. 13
2.3.1. Poligalacturonases ....................................................................... 15
2.3.1.1. Aplicações das poligalacturonases ................................. 17
2.3.2. Pectina metil esterase .................................................................. 18
2.3.3. Pectina liase e pectato liase ......................................................... 18
2.3.4. Endo xilogalacturonana hidrolase ................................................ 19
2.3.5. Pectinases que degradam a rhamnogalacturonana ..................... 19
2.4. Micro-organismos patógenos de plantas ............................................... 20
2.4.1. Cylindrocladium pteridis ............................................................... 21
2.4.2. Cylindrocladium pteridis e a infecção do eucalipto....................... 21
vii
3. OBJETIVOS ................................................................................................. 23
3.1. Objetivos Gerais..................................................................................... 23
33.2. Objetivos Específicos ........................................................................... 23
4. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 24
4.1. Reagentes .............................................................................................. 24
4.2. Micro-organismo .................................................................................... 24
4.3. Manutenção da cultura ........................................................................... 24
4.4. Preparo das fontes de carbono .............................................................. 24
4.5. Meio de cultura, cultivo do micro-organismo e produção enzimática ..... 25
4.6. Ensaios enzimáticos .............................................................................. 25
4.6.1. Poligalacturonase ......................................................................... 25
4.7. Determinação da concentração de proteínas ........................................ 26
4.8. Purificação da poligalacturonase de C.pteridis...................................... 26
4.9. Determinação do grau de pureza ........................................................... 28
4.9.1. Eletroforese.................................................................................. 28
4.9.2. Coloração dos géis de eletroforese ............................................. 28
4.10. Determinação da massa molecular ..................................................... 29
4.11.Caracterização enzimática .................................................................... 29
4.11.1. Efeito do pH ................................................................................... 29
4.11.2. Efeito da temperatura .................................................................... 30
4.11.3. Estabilidade de pH ......................................................................... 30
4.11.4. Termoestabilidade e cálculo da meia vida da enzima.................... 30
4.11.5. Determinação dos parâmetros cinéticos ........................................ 30
4.11.6. Determinação da especificidade de substrato................................ 31
4.11.7. Efeitos de íons, agentes redutores e açúcares .............................. 31
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 32
5.1. Seleção da melhor fonte de carbono para produção enzimática ........... 32
5.2. Purificação da poligalacturonase de C. pteridis LPF-59 ........................ 37
5.3. Determinação da massa molecular ....................................................... 41
5.4. Caracterização enzimática .................................................................... 42
5.4.1. Efeito do pH ..................................................................................... 44
5.4..2. Efeito da temperatura ..................................................................... 44
5.4.3. Análise da termoestabilidade ........................................................... 46
viii
5.4.3.1. Meia-vida da poligalacturonase ............................................... 48
5.4.4. Determinação dos parâmetros cinéticos .......................................... 49
5.4.5. Especificidade de substrato ............................................................. 50
5.4.6. Efeitos de íons, agentes redutores e açúcares ................................ 51
6. CONCLUSÕES ............................................................................................ 55
7. PERSPECTIVAS .......................................................................................... 57
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 58
ix
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura 1. Esquema dos principais componentes estruturais da parede celular
primária e seu provável arranjo. ......................................................................... 4
Figura 2. Representação esquemática dos elementos estruturais da pectina ... 6
Figura 3. Estrutura química da pectina. .............................................................. 7
Figura 4. Comparação da composição em peso seco das biomassas ricas em
pectina e das biomassas lignocelulósicas ........................................................ 10
Figura 5. Principais modificações nas substâncias pécticas ........................... 12
Figura 6. Modo de ação das pectinases envolvidas na degradação da
homogalacturonana, rhamnogalacturonana I e xilogalacturonana ................... 15
Figura 7. Modo de ação da poligalacturonase ................................................. 16
Figura 8. Estrutura denominada “egg-box” formada pelas ligações dos íons
Ca+2 com o polímero de homogalacturonana na pectina ................................. 18
Figura
9.
Sequências
dos
métodos
utilizados
para
purificação
da
poligalacturonase de Cylindrocladium pteridis ................................................. 27
Figura 10. Atividade de poligalacturonase (U.mL-1) no sobrenadante da cultura
de C.pteridis LPF-59 nas diferentes fontes de carbono. .................................. 32
Figura 11. Atividade específica de poligalacturonase (U.mg-1) no sobrenadante
da cultura de C.pteridis LPF-59 nas diferentes fontes de carbono. .................. 34
Figura 12. Atividade de poligalacturonase real (colorido) e teórica (preto) de
acordo com as diferentes fontes de carbono ao longo do tempo de cultivo. .... 36
Figura 13. Perfil cromatográfico obtido após a aplicação do extrato bruto
centrifugado em coluna de troca iônica DEAE–Sepharose. ............................. 38
Figura 14. Perfil cromatográfico obtido após a aplicação da fração ativa
concentrada, proveniente da troca iônica, em coluna de gel filtração Sephacryl
S-200. ............................................................................................................... 39
Figura 15. Eletroforese desnaturante (SDS-PAGE 12 %) corado com prata das
amostras com atividade de poligalacturonase de C.pteridis LPF-59. ............... 40
Figura 16. Determinação da massa molecular da poligalacturonase purificada
de C.pteridis LPF-59, a partir de SDS-PAGE. .................................................. 41
Figura 17. Efeito do pH na atividade da poligalacturonase purificada de
C.pteridis LPF-59 na temperatura de 50oC. ..................................................... 42
x
Figura 18. Efeito do pH na estabilidade da poligalacturonase purificada de
C.pteridis LPF-59 após 60 minutos de incubação a 25oC em diferentes valores
de pH ................................................................................................................ 43
Figura 19. Efeito da temperatura na atividade da poligalacturonase purificada
de C.pteridis LPF-59 em pH 4,0. ...................................................................... 45
Figura 20. Efeito da temperatura na estabilidade da poligalacturonase
purificada de C.pteridis LPF-59. ....................................................................... 46
Figura 21. Valores de meia-vida estimados para poligalacturonase purificada de
C.pteridis LPF-59 ............................................................................................. 48
Tabela 1. Atividade de poligalacturonase detectada nos meios de cultura de
C.pteridis contendo diferentes fontes de carbono. ........................................... 35
Tabela 2. Resumo das etapas de purificação da poligalacturonase de C.pteridis
LPF-59. ............................................................................................................ 37
Tabela 3. Valores de KM, Vmax e Vmax.KM-1 obtidos para poligalacturonase
purificada de C.pteridis LPF-59, ....................................................................... 49
Tabela 4. Especificidade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59
para os diferentes substratos na concentração final de 0,2% (p/v). ................. 51
Tabela 5. Atividade relativa da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF59 submetida aos diferentes efetores na concentração final de 2 mM. ............ 52
xi
RESUMO
LADEIRA, Rafaela Inês de Souza, M. Sc., Universidade Federal de Ouro Preto,
Março
de
2013.
poligalacturonase
Produção,
de
purificação
Cylindrocladium
e
caracterização de
pteridis.
Orientadora:
uma
Valéria
Monteze Guimarães. Co-orientador: Sebastião Tavares de Resende.
Os objetivos deste trabalho foram selecionar diferentes fontes de
carbono
indutoras
da
poligalacturonase
em
cultura
submersa
de
Cylindrocladium pteridis LPF-59, purificar e caracterizar a enzima para
identificação das propriedades funcionais interessantes para possíveis
aplicações biotecnológicas e industriais. Para produção da poligalacturonase, o
fungo foi cultivado por 168 horas em meio líquido composto por uma das seis
diferentes fontes de carbono: resíduo de viveiro de eucalipto antigo, resíduo de
viveiro de eucalipto novo, folha de eucalipto, caule jovem de eucalipto, caule
lignificado de eucalipto e farelo de trigo. A enzima produzida a partir da cultura
fúngica em meio contendo folha de eucalipto foi purificada por cromatografias
de troca iônica e filtração em gel. Ao final do processo, a poligalacturonase
apresentou um fator de purificação de 13,32 vezes, com rendimento de
18,91%. A massa molecular da enzima foi de aproximadamente 68 KDa
quando estimada por SDS-PAGE. A enzima apresentou atividade máxima em
pH 4,0 e na temperatura de 60oC. Os valores de meia-vida para a
poligalacturonase foram de 260 e 66 minutos, nas temperaturas de 50 e 60oC,
respectivamente. Os valores de KM e Vmax, utilizando o substrato ácido
poligalacturônico, foram 0,525 mg.mL-1 and 5,862 U.mL-1, respectivamente e
6,770 mg.mL-1 e 16,166 U.mL-1 para a pectina cítrica. A enzima apresentou
atividade hidrolítica para ácido poligalacturônico, pectina cítrica e PDA (potato
dextrose agar) . A atividade enzimática foi 97 % inibida por HgCl 2 e 85 % por
SDS, e na presença de CaCl2, FeSO4, lactose e EDTA, a enzima ainda
manteve aproximadamente 50% da atividade original. A poligalacturonase
identificada neste trabalho apresentou propriedades adequadas para sua
possível aplicação em indústrias alimentícias, uma vez que sua atuação em
xii
ambientes ácidos e em altas temperaturas indica que poderia ser utilizada no
processo de preparação e clarificação do suco de frutas.
xiii
ABSTRACT
LADEIRA, Rafaela Inês de Souza, M. Sc., Federal University of Ouro Preto,
March de 2013. Purification and characterization of a polygalacturonase
Cylindrocladium
pteridis.
Advisor:
Valéria
Monteze
Guimarães.
Co-
supervisor: Sebastião Tavares de Resende.
The objectives of this study were to select different carbon sources
induce polygalacturonase in submerged culture of Cylindrocladium pteridis LPF59, purify and characterize the enzyme to identify the functional properties of
interest
for
potential
biotechnological
and
industrial
applications.
To
polygalacturonase production, the fungus was grown for 168 hours in liquid
medium composed of the six different carbon sources: old residue from nursery
eucalyptus, new residue from nursery eucalyptus, eucalyptus leaf, young stem
eucalyptus, woody stem eucalyptus and wheat bran. The enzyme produced
from the fungal culture in medium containing eucalyptus leaf was purified by ion
exchange chromatography and gel filtration. At the end of the process,
polygalacturonase had a purification factor of 13.32 times, with yield of 18.91%.
The molecular mass of the enzyme was about 68 kDa when estimated by SDSPAGE. The enzyme showed maximal activity at pH 4.0 and at a temperature of
60oC. The values of half-life for polygalacturonase were 260 and 66 minutes at
temperatures of 50 and 60 ° C respectively. The values of KM and Vmax, using
the substrate polygalacturonic acid were 0.525 mg.mL-1
and 5.862 U.mL-1
respectively and 6.770 mg.mL-1 and 16.166 U.mL-1 for citrus pectin. The
enzyme showed hydrolytic activity for polygalacturonic acid, citrus pectin and
PDA (potato dextrose agar). The enzyme activity was inhibited by 97% and
85% HgCl2 for SDS, and in the presence of CaCl2, FeSO4, EDTA and lactose,
the enzyme still retained approximately 50% of the original activity. The work
presented in this polygalacturonase identified suitable properties for their
possible application in the food industry, since his action in acidic environments
and at high temperatures indicates that it could be used in the preparation
process and clarification of fruit juice.
xiv
1. INTRODUÇÃO
A pectina é um dos principais constituintes da parede celular de plantas
e provavelmente um dos maiores complexos de macromoléculas existentes na
natureza (Voragen et al., 2009). A pectina é um complexo de polissacarídeos
composto principalmente de polímeros de ácido D-galacturônico unidos por
ligações α-1,4-glicosídicas (Jurick et al., 2009). Ao se complexar com a
hemicelulose se torna componente crítico para a organização tecidual da
planta, uma vez que fornece integridade para sua parede celular. Pelo fato da
parede celular das plantas serem uma estrutura dinâmica e heterogênea, sua
complexidade demanda um arsenal diverso de enzimas produzidas por microorganismos para degradar lignina, celulose, hemicelulose e pectina (King et al.,
2011). Dentre essas enzimas, as pectinases são as responsáveis pela
degradação das substâncias pécticas e são classificadas de acordo com o
mecanismo de ação. As metilesterases (EC 3.1.11.1) removem grupos metoxil
de
galacturonana
altamente
ou
parcialmente
esterificada.
As
poligalacturonases catalisam a hidrólise de ligações glicosídicas de forma
randômica (endopoligalacturonase EC 3.2.1.15) ou na porção final nãoredutora da homogalacturonana liberando resíduos de ácido galacturônico ou
digalacturônico (exopoligalacturonases EC 3.2.1.67 e EC 3.2.1.82). E as liases
clivam as ligações glicosídicas por trans-eliminação (pectato liase EC 4.2.2.2 e
exopectato liase EC 4.2.2.9) (Alkorta et al., 1998).
Muitos micro-organismos associados a plantas, tanto patogênicos como
saprófitos, que quebram a parede celular de plantas, possuem capacidade
genética para sintetizar essas enzimas. Pectinases fúngicas estão entre as
mais importantes enzimas industriais, uma vez que são amplamente aplicadas
em processos têxteis, na degomagem das fibras de plantas, em fermentações
de café e chá, na extração e clarificação de sucos de frutas, na extração de
óleos, na preparação de fibras de celulose para roupa e na manufatura de juta
e papel (Gomes et al., 2011). Esta enzima também tem sido identificada como
agente de patogenicidade no processo de infecção de plantas por fungos.
Muitos fitopatógenos contam com as enzimas que degradam a parede celular
das plantas (CWDE) para quebrar a barreira e obter nutrientes para sua
1
sobrevivência, enquanto subvertem as respostas de defesa da planta. Isso
sugere que esses patógenos produzem quantidades substanciais de enzima
com alta eficiência catalítica e de uma forma estritamente regulada e
coordenada (Donna et al., 2011).
A produção de enzimas pectinolíticas tem sido amplamente citada em
bactérias e fungos filamentosos (Mohamed et al., 2003). No entanto, há
interesse na descoberta de novas fontes dessas enzimas, que sejam eficientes,
robustas e tenham propriedades catalíticas mais adequadas para as aplicações
industriais.
Estudos anteriores do nosso grupo de pesquisa indicaram que o fungo
fitopatogênico Cylindrocladium pteridis LPF-59, isolado de plantações de
eucalipto, foi capaz de secretar enzimas essenciais para degradação da parede
celular vegetal, sendo a poligalacturonase uma das enzimas mais ativas.
Portanto, a purificação e o estudo das propriedades da poligalacturonase
de C.pteridis LPF-59 podem contribuir para a compreensão do possível papel
desta enzima no processo de infecção de plantas. Por outro lado, esse estudo
pode revelar propriedades funcionais desta enzima que a qualifiquem para
utilização em possíveis aplicações industriais.
Considerando os aspectos discutidos, o objetivo deste trabalho foi
produzir, purificar e caracterizar a poligalacturonase de C.pteridis LPF-59. Para
isso, a enzima foi produzida a partir do cultivo do fungo C.pteridis LPF-59 em
meio
líquido
utilizando
folha
de
eucalipto
como
fonte
de
carbono.
Posteriormente a enzima foi purificada e caracterizada visando a identificação
de
propriedades
funcionais
interessantes
para
possíveis
aplicações
biotecnológicas. Tanto na indústria de alimentos como para degradação da
biomassa lignocelulósica para produção de etanol.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1.
PAREDE CELULAR DE PLANTAS
A função mais notável da parede celular nas plantas é a determinação
do tamanho e do formato das células (Taiz et al., 1984). A parede celular é o
primeiro obstáculo que um patógeno enfrenta na penetração da planta. Por ser
uma importante barreira entre a planta e o patógeno, milhões de anos de
coevolução
foram
necessários
para
que
as
plantas
desenvolvessem
estratégias de proteção da sua parede celular e os patógenos por sua vez
criassem caminhos para driblar essas estratégias. Para isso, os patógenos
secretam inúmeras enzimas para degradar a parede celular das plantas e
assim utilizar seus componentes como fonte de nutritiva (Lagaert et al., 2009).
2.1.1. Composição da parede celular
A parede celular das plantas é uma estrutura dinâmica e heterogênea. A
parede celular primária das plantas é composta aproximadamente por 10% de
proteínas e 90% de polissacarídeos (Lagaert et al., 2009). A parede celular
vegetal possui como elementos básicos: celulose, hemicelulose, lignina e a
pectina (Gibson, 2012). A complexidade dos polissacarídeos existentes na
parede celular contribui para resistência à hidrólise, necessitando de um
conjunto
de
componentes
enzimas
para
estruturais
da
sua
completa
parede
representados na figura 1.
3
degradação.
celular
primária
Os
principais
vegetal
estão
Figura 1. Esquema dos principais componentes estruturais da parede celular
primária e seu provável arranjo. As microfibrilas de celulose são revestidas com
hemicelulose, que podem ligar as microfibrilas entre si. As pectinas formam um
gel de matriz de ligação, interagindo com as proteínas estruturais (Brett e
Waldron, 1996).
A composição da parede celular difere de acordo com a linhagem da
planta (Sarkar et al., 2009). A parede celular das angiospermas e
gimnospermas contém microfibrilas de celulose embebidas em uma matriz de
pectina, hemicelulose, lignina e proteínas estruturais. O tipo de polímero e a
quantidade relativa de cada um na planta variam de acordo com a espécie da
planta e a maneira como a parede celular amadurece. De acordo com Vogel
(2008), à medida que a parede celular primária vai se transformando em
secundária, as quantidades de xiloglucana, pectina e proteínas estruturais
decresce enquanto a quantidade de xilana e lignina aumentam. Isso ocorre
tanto em monocotiledôneas quanto em dicotiledôneas.
4
É improvável que as diferenças na composição da parede celular entre
as monocotiledôneas e as dicotiledôneas determinem a especificidade da
planta hospedeira em relação ao seu patógeno. Porém, existem evidências de
que os fitopatógenos secretam diferentes quantidades de enzimas dependendo
do seu local de desenvolvimento em monocotiledônea ou dicotiledônea
(Cooper et al., 1988; Zalewska-Sobczak, 1985).
2.2.
A
PECTINA
pectina
é
definida
como
um
heteropolissacarídeo
composto
predominantemente de resíduos de ácido poligalacturônico. Embora o ácido Dgalacturônico seja o principal constituinte das substâncias pécticas, proporções
variáveis de outros açúcares, tais como D-galactose, L-arabinose, D-xilose, Lramnose, L-fucose também podem ser encontradas. O grau de esterificação, a
proporção de açúcares neutros e o grau de polimerização são características
responsáveis pela heterogeneidade das substâncias pécticas provenientes de
diferentes origens (Menezes, 2006). A representação esquemática da
composição dos elementos estruturais da pectina pode ser observada na figura
2.
5
Figura 2. Representação esquemática dos elementos estruturais da pectina
(Voragen et al., 2009).
2.2.1. Elementos estruturais da pectina
2.2.1.1.
Homogalacturonana
É o tipo de pectina mais abundante na parede celular de plantas,
contabiliza aproximadamente 60% da quantidade total desse polissacarídeo
(Mohnen et al., 2008). A cadeia principal desse polímero consiste de resíduos
de ácido poligalacturônico (GalA) unidos por ligações glicosídicas α-1,4. O
comprimento mínimo dessa cadeia principal é de 72-100 resíduos para pectina
dos cítricos, da maçã e da beterraba sacarina. Geralmente, metade dos
resíduos de GalA dentro da cadeia principal pode ser esterificado no C-6 e/ou
O-acetilado no O-2 e/ou O-3. A metilesterificação da pectina tem ganhado
atenção especial dos pesquisadores, uma vez que é responsável por suas
propriedades físicas. É necessário ressaltar que não é só a quantidade de
metil-esterificação que é importante, mas também a distribuição desses ésteres
ao longo do polímero (Voragen et al., 2009).
6
Figura 3. Estrutura química da pectina. Cadeia principal linear de unidades
repetidas de α-(1→ 4)-D-ácido galacturônico, sendo que parte destas unidades
apresenta-se esterificada, com éster metílico (Hourdet et al., 1991).
2.2.1.2.
Xilogalacturonana
É o polímero de homogalacturonana substituído nas cadeias laterais por
uma unidade de β-D-Xylp (1 → 3). O grau de xilosidação pode variar de 25%
(melancia) a 75% (maçã). Parte dos resíduos de GalA na xilogalacturonana
está metil-esterificado e os metil- ésteres estão distribuídos igualmente entre os
resíduos de GalA substituídos e não-substituídos (Schols et al., 1995) Embora
a xilogalacturonana esteja presente principalmente nos tecidos reprodutivos
como frutos e sementes, Zandleven et al. (2007) demonstraram a presença
deste elemento em vários tecidos de Arabidopsis thaliana.
2.2.1.3.
Rhamnogalacturonana I
A cadeia principal da rhamnogalacturonana I (RGI) é composta de
unidades repetidas do dissacarídeo [→ 2)–α–L–Rhap–(1→4)-α-D- GalpA(1→]. Algumas células podem apresentar até 300 unidades. Os resíduos
rhamnosil da rhamnogalacturonana I podem ser substituídos na posição O-4
por açúcares neutros formando as cadeias laterais. A cadeia lateral é composta
principalmente de resíduos de galactosil e/ou arabinosil. A proporção de
7
resíduos rhamnosil ramificados varia de 20% a 80% dependendo da origem do
polissacarídeo (Albersheim
provavelmente
et al., 1996). Os resíduos GalA da RGI são
não-esterificados,
pois
a
rhamnogalacturonana
não
é
degradada em condições de β-eliminação (Kravtchenko et al., 1992).
A RGI representa 20-35% da pectina, com alto grau de especialização
celular e expressão dependente do desenvolvimento, e varia quanto ao tipo e
número de açúcares simples e oligossacarídeos ligados a essa cadeia. A razão
para esse nível de variação em RGI não é conhecida, mas sugere diversidade
funcional (Canteri et al., 2012).
2.2.1.4.
Rhamnogalacturonana II
A rhamnogalacturonana II (RGII) é uma estrutura altamente conservada
no reino das plantas e pode ser liberada pela ação da endopoligalacturonase. A
estrutura
é
caracterizada
como
uma
região
distinta
dentro
da
homogalacturonana (HG) por conter grupos de quatro diferentes cadeias
laterais.
Essas
cadeias
laterais
estão
ligadas
a
um
fragmento
de
homogalacturonana de aproximadamente nove resíduos de GalA, dos quais
alguns estão esterificados (Ishii et al., 2001). A RGII é o segmento
estruturalmente mais complexo e compõe 10% da pectina (Canteri et al., 2012).
2.2.1.5.
Arabinana, arabinogalactana I e II
A arabinana consiste de uma cadeia principal de resíduos α-1,5-L-Araf
que usualmente estão substituídos nas cadeias laterais com α-L-Araf-(1→2)-,
α-L-Araf-(1→3) e/ou α-L-Araf-(1→3)- α-L-Araf-(1→3). A arabinogalactana I
(AGI) é composta de uma cadeia principal de β-1,4-D-Galp com resíduos de αL-Araf ligados em O-3 de resíduos de galactose. A arabinogalactana II (AGII) é
composta de uma cadeia principal de β-1,3-D-Galp, contendo pequenas
cadeias laterais de α-L-Araf-(1→6)-[β-D-Galp-(1→6)]n, onde n=1, 2 ou 3. Os
resíduos galactosil das cadeias laterais podem ser substituídos com resíduos
de α-L-Araf-(1→3). Ela está associada principalmente a proteínas (3-8%),
também sendo chamadas de proteínas arabinogalactanas (AGPs). A maior
8
parte das AGPs, mais de 90%, é constituída de polissacarídeo (Voragen et al.,
2009).
2.2.2. Função da pectina
2.2.2.1.
Funcionalidade na planta
A pectina está presente na lamela média, na parede celular primária e
secundária das plantas e é depositada nos estágios iniciais de crescimento
durante a expansão celular (Crombie et al., 2003). Esse polímero representa
35% dos polissacarídeos da parede celular primária das dicotiledôneas e
monocotiledôneas não-gramíneas. Já as gramíneas apresentam de 2% a 10%
de pectina (Mohnen, 2008).
A pectina atua estruturalmente na parede celular das plantas sendo
importante nos processos de crescimento, desenvolvimento, morfogênese,
defesa, adesão célula-célula e expansão celular. Ela influencia diversas
propriedades da parede celular das plantas como a porosidade, a carga da
superfície, o pH e o balanço de íons (Voragen et al., 2009).
Outra função está ligada aos mecanismos de defesa vegetal. O ácido
galacturônico, unidade básica da pectina, é um componente essencial de
elicitores ativos da parede celular, substâncias que provocam o acúmulo de
fitoalexinas com propriedades antibióticas nos locais de infecção vegetal
(Canteri et al., 2012).
2.2.3. Aplicações da pectina
A maioria da pectina aplicada na indústria alimentícia é proveniente da
casca de maçã e cítricos, e é extraída em pH baixo e alta temperatura. É
utilizada como agente estabilizante, de gelificação e no aumento da
viscosidade em produtos como geleia, preparações de frutas para iogurtes,
bebidas e sucos de frutas concentrados, sobremesas de frutas e leite, produtos
lácteos gelificados, produtos de confeitaria e produtos lácteos acidificados
diretamente ou fermentados. Dentre outras propriedades estão a prevenção de
9
flotação, a maciez a partir da melhoria da textura, a estabilização dos produtos
de panificação o aumento do volume (Canteri et al., 2012).
A biomassa rica em pectina é uma fonte abundante e amplamente
subutilizada e inclui resíduos como o bagaço de maçã, restos cítricos e a polpa
de beterraba sacarina. Todos esses tipos de biomassa são resíduos deixados
após a fruta ou vegetal serem processados para a produção de sumo ou
açúcar (Edwards et al., 2012).
As biomassas ricas em pectina apresentam alta concentração de
pectina, variando de 12% a 35% da biomassa seca. A parede celular de outras
biomassas que não são ricas em pectina apresenta apenas de 2% a 10% de
pectina (Mohnen 2008; Zhou et al., 2008).
Outra característica interessante das biomassas ricas em pectina é a
baixa concentração de lignina. A figura 4 compara a composição da biomassa
rica em pectina com outros tipos de biomassa.
Figura 4. Comparação da composição em peso seco das biomassas ricas em
pectina (bagaço de maçã, resíduo cítrico, polpa de beterraba) e das biomassas
lignocelulósicas (milho, pinheiro e gramínea) (Edwards et al., 2012).
O resíduo cítrico e a polpa de beterraba apresentam aproximadamente
2% do peso seco de lignina contra 26% de lignina existente no pinheiro. Esse
aspecto é significante uma vez que a lignina interfere na degradação
10
enzimática da celulose e hemicelulose e não é fermentável em etanol. A
presença de lignina na biomassa requer pré-tratamentos para quebrar a ligação
desse componente com os carboidratos da biomassa e assim viabilizar a
geração do etanol (Guo et al., 2009).
O custo estimado para produção de etanol a partir de resíduos cítricos é
maior que o custo do etanol de milho, porém é menor que o custo dos
processos de etanol lignocelulósico. Uma razão da maior viabilidade
econômica do etanol produzido a partir dos resíduos cítricos em relação ao
etanol de biomassa lignocelulósica é a geração do limoneno, co-produto
derivado dos cítricos. O limoneno pode ser vendido e assim ajudar nos custos
da produção desse tipo de etanol (Zhou et al.,2007).
As principais aplicações da biomassa rica em pectina são como
fertilizante animal e na produção de vinho, cera, ácido cítrico, butanol, metano,
vinagre de maçã, óleo de sementes e da pectina propriamente dita.
Atualmente, o uso mais comum desse tipo de biomassa é na ração animal.
Essa biomassa tende a apresentar baixo teor de gordura, proteínas e fósforo,
mas alto teor de fibras e cálcio (Edwards et al., 2012).
2.2.4. Degradação da pectina
2.2.4.1.
Degradação química
As substâncias pécticas podem degradar-se por dois mecanismos
químicos principais, esquematizados em três tipos de acordo com a figura 5.
11
Figura 5. Principais modificações nas substâncias pécticas (Canteri et al.,
2012).
O primeiro tipo deles é a desesterificação, com liberação de metanol e
formação de pectatos. Em meio ácido (pH entre 1 a 3), em temperaturas
inferiores a 10 °C, predominam as desesterificações. O outro mecanismo,
denominado de despolimerização (diminuição do tamanho da cadeia
polimérica) pode acontecer por hidrólise (ácida ou enzimática) das ligações
α(1→4), ou ainda por reações de β-eliminação. Em temperaturas acima de 10
°C em meio ácido, são mais frequentes as hidrólises de ligações α - (1→4)
(Shingthong et al., 2004). Na β-eliminação, o hidrogênio em C5, mais ácido em
função do grupo éster metílico é atacado pelo íon hidróxido, resultando na
transferência eletrônica e levando à ruptura da ligação glicosídica e à
formação, entre C4 e C5, de dupla ligação conjugada com aquela da função
carboxílica. Essa reação pode ser acelerada pelo aumento da concentração de
produtos alcalinos e da temperatura ou na presença de íons tais como Ca +2,
Mg+2, K+, Cl-, citrato, malato ou fitato. Abaixo de 10 °C, o grau de metilação das
12
pectinas é suficientemente reduzido para impedir, por repulsão elestrostática, a
aproximação dos íons hidróxidos e essa reação não mais ocorre (Canteri et al.,
2012).
2.2.4.2.
Degradação enzimática
As substâncias pécticas são degradadas igualmente por enzimas
sintetizadas por vegetais ou por micro-organismos. Nesse caso, a degradação
pode seguir duas vias principais: desmetilação preliminar pela pectinaesterase, seguida da hidrólise ácida das ligações α - (1→4) pelas
poligalacturonases; despolimerização direta das pectinas por reações também
de β-eliminação sob ação das pectinas liases e pectato liases de origem
microbiana (Shingthong et al., 2004).
2.3.
PECTINASES
As pectinases hidrolisam as substâncias pécticas. Elas representam
cerca de 25% da venda global de enzimas para alimentos e são uma das mais
amplamente distribuídas, estando presente em bactérias, fungos e plantas
(Thakur et al., 2010).
Atualmente, a maioria das pectinases comerciais são misturas de
pectinases produzidas por fungos filamentosos. Essas misturas são muito
empregadas na indústria de alimentos, pois além dos fungos serem potentes
produtores de enzimas pécticas, estas possuem um pH ótimo muito próximo do
pH dos sucos de frutas, entre 3 e 5,5 (Kant et al., 2013). Estes organismos são
muito eficientes na degradação dos polissacarídeos da parede celular vegetal e
utilizam um amplo conjunto de enzimas para convertê-los em açúcares
monoméricos. No entanto, a composição de enzima destes conjuntos difere
significativamente entre as espécies de fungos. Esse fato também é observado
para o subconjunto de enzimas pectinolíticas, por exemplo, Rhizopus spp.
secreta principalmente enzimas para a degradação da homogalaturonana,
parte principal da pectina, enquanto Aspergillus produzem enzimas para
hidrolisar todos os elementos estruturais pécticos (Benoit et al., 2012).
13
A produção de pectinas por fungos geralmente é influenciada pela
composição do meio de cultivo, particularmente pela fonte de carbono e
nitrogênio. É influenciada também pelas condições físico-químicas como pH,
temperatura e aeração, além do sistema de fermentação empregado. A
fermentação em estado sólido (SSF) e a fermentação submersa (SMF) são as
mais comumente empregadas para produção de enzimas em condições
laboratoriais utilizando resíduos agrícolas e agro-industriais (Gomes et al.,
2009).
Hoje, as pectinases são de grande importância nas indústrias de
alimentos e têxtil, de sacarificação de resíduos alimentares, bem como na
indústria de polpa e papel. Pectinases também desempenham um papel
importante na hidrólise de polpa de beterraba sacarina, aumentando o acesso
das celulases à celulose. Inúmeros estudos têm sido desenvolvidos para
melhor compreensão do sinergismo existente entre as pectinases e as
celulases. Dessa maneira, os benefícios dessa parceria poderão ser elucidados
(Zhang et al., 2013).
Pectinases acidófilas são usadas na preparação e clarificação do suco
de maçã, para facilitar a prensagem e extração de sumo. Além disso, essas
enzimas pécticas são utilizadas para reduzir a névoa ou gelificação do sumo de
uva na fabricação de vinho e para melhorar a qualidade de cidra de maçã que
varia entre amargo, doce ou azedo. Já as pectinases alcalinas também têm
várias aplicações industriais, tais como no tratamento de águas residuais, na
fabricação de papel, na extração de óleo, fermentação de café e chá,
processamento e degomagem de fibras vegetais (Kant et al., 2013).
Devido à grande variedade de pectinas existentes nas plantas, a sua
hidrólise é obtida pela ação sinérgica de um sistema pectinolítico (Martins et al.,
2007). As pectinases são classificadas de acordo com o substrato e com o
modo de ação no polímero de pectina. As principais pectinases estão
representadas na figura 6.
14
Figura 6. Modo de ação das pectinases envolvidas na degradação da
homogalacturonana, rhamnogalacturonana I e xilogalacturonana. (Voragen et
al., 2009).
2.3.1. Poligalacturonases
As poligalacturonases possuem domínios com cerca de 8 a 10 voltas de
folhas β-paralelas com regiões de duas curvas, formando um túnel para a
ligação do substrato. A sequência conservada indica que o sítio ativo da
poligalacturonase é composto por dois aminoácidos conservados, aspartato e
lisina no seu centro, que atuam como resíduos catalíticos. Argininas e lisinas
dão um potencial eletrostático no qual se ligam os substratos. Em algumas das
enzimas, uma histidina perto do sítio ativo atua influenciando a eficiência
catalítica. O aspartato conservado atua como base catalítica e doador de
próton no mecanismo enzimático (PickersgillI et al., 1998).
15
As poligalacturonases são as pectinases que catalisam a clivagem
hidrolítica da cadeia de ácido poligalacturônico, seu principal constituinte
(Rombouts e Pilnik, 1980).
As endopoligalacturonases (EndoPG; EC 3.2.1.15) clivam as ligações α1,4 existentes nos segmentos de homogalacturonana. A enzima ataca o
substrato de maneira randômica e libera ácido poligalacturônico. Geralmente
mostram maior capacidade para hidrolisar substratos não-esterificados e
apresentam decréscimo da atividade com o aumento do grau de metilesterificação (Voragen et al., 2009).
As exopoligalacturonases (ExoPG; EC 3.2.1.67) atacam o substrato a
partir da extremidade não-redutora e é capaz de remover resíduos de ácido
poligalacturônico na porção terminal da cadeia de homogalacturonana.
(Voragen et al., 2009). O modo de ação das poligalacturonases é exemplificado
na figura 7.
Figura 7. Modo de ação da poligalacturonase (Sathynayara e Panda, 2003).
A depolimerização enzimática da pectina enfraquece a parede celular da
planta e expõe os outros polímeros a ação das celulases e hemicelulases.
Quando o fungo cresce sobre a parede celular da planta, as pectinases são
invariavelmente as primeiras enzimas a serem secretadas, seguidas pelas
hemicelulases e celulases (D’Ovidio et al., 2004).
A contribuição das enzimas que degradam a parede celular das plantas
para a patogenicidade ou virulência do fungo tem sido estudada em vários
sistemas de infecção, e as pectinases estão sendo relatadas como fatores de
virulência para fungos fitopatogênicos (D’Ovidio et al., 2004).
16
2.3.1.1.
Aplicações das poligalacturonases
O uso comercial das poligalacturonases está principalmente relacionado
à indústria de alimentos, sendo que sua maior aplicação encontra-se na
clarificação de sucos de frutas (Silva et al., 2005). No processamento industrial
de sucos de frutas, o objetivo principal do tratamento de clarificação é remover
componentes responsáveis pela turbidez e substâncias que causam turvação e
formação de precipitados após o envasamento do suco ou durante a
estocagem (Meyer et al., 2001). A adição de pectinases proporciona um
processamento mais eficiente da fruta, melhorando a sacarificação o que
confere ao suco um sabor mais adocicado, melhorando a cor e o aroma do
suco, prevenindo a formação de gel e aumentando o rendimento do suco
(Collet et al., 2005).
Na indústria de vinhos, elas são adicionadas durante o esmagamento
das uvas, antes da fermentação. Essas enzimas pectinolíticas são utilizadas
para conferir a estabilidade de vinhos tintos e melhorar suas características
visuais, como a cor e a turbidez (Revilla e Ganzalez-San Jose, 2003).
Já na indústria têxtil, as poligalacturonases são utilizadas juntamente
com as amilases, lipases, celulases e hemicelulases em diversas aplicações.
Na degomagem das fibras de algodão, elas podem substituir a soda cáustica,
que era utilizada anteriormente na remoção das impurezas não celulósicas, de
maneira segura e ecologicamente correta, sem causar efeitos negativos na
degradação da celulose (Hoondal et al., 2000).
Durante o processamento do papel, as poligalacutoronases podem
auxiliar a despolimerização das pectinas e, consequentemente, diminuir a
demanda de cloro utilizado no branqueamento da polpa celulósica (Reid e
Richard, 2004).
Silva et al. (2005) relataram a utilização de elevados níveis de
poligalacturonase na maceração de frutos e vegetais destinados à alimentação
de bebês . As poligalacturonases também têm sido citadas como aplicáveis na
extração de azeite de oliva e de óleos essenciais, uma vez que elimina as
propriedades emulsificantes da pectina, que interferem na extração dos óleos
vegetais (Jayani et al., 2005).
17
2.3.2. Pectina metil esterase (PME; 3.1.1.11)
A pectina metil esterase catalisa a demetilesterificação específica da
cadeia de homogalacturonana dentro da parede celular da planta, liberando
metanol
e
prótons.
Essa
reação
gera
grupos
carboxil
carregados
negativamente. O polímero de homogalacturonana demetilesterificado pode
formar ligações com Ca+2 promovendo a formação de uma estrutura
denominada “egg-box”. Essa estrutura pode formar géis ou tornar-se um alvo
para
as
demais
enzimas
pécticas
de
degradação,
tais
como
as
poligalacturonases, que afetam a textura e a rigidez da parede celular. Assim, a
PME desempenha um papel importante na remodelação da pectina (Pelloux et
al., 2007).
Figura 8. Estrutura denominada “egg-box” formada pelas ligações dos íons
Ca+2 com o polímero de homogalacturonana na pectina (Morris et al., 1982).
2.3.3. Pectina liase (PL; 4.2.2.10) e pectato liase (PAL; 4.2.2.9)
A pectina liase é capaz de despolimerizar a região menos ramificada da
pectina por β-eliminação, resultando na formação de uma ligação insaturada
Δ4, 5 na extremidade não-redutora recém-formada. Essa enzima cliva entre
dois resíduos α-1,4-D-GalpA metil-esterificados. A atividade de pectina liase
muitas vezes aumenta à medida que o grau de esterificação da pectina cresce.
A pectato liase (PAL; 4.2.2.9) também atua na despolimerização da pectina por
18
β-eliminação. Assim como a pectina liase, a pectato liase forma uma ligação
insaturada Δ4, 5 na extremidade não-redutora. O que diferencia uma enzima
da outra, é que a pectato liase cliva entre dois resíduos α-1,4-D-GalpA sem
metil-esterificação. A pectato liase é geralmente ativa em pectina com um grau
moderado de metil-esterificação (0-50%). As pectato liases caracterizadas até
então necessitam de íons Ca+2 para melhoria da atividade, enquanto as
pectinas liases não. Essa é a única propriedade que distingue essas enzimas,
uma vez que a distinção entre a especificidade do substrato não é rigorosa
(Van Alebeek et al., 2002).
2.3.4. Endo xilogalacturonana hidrolase (XGH; EC 3.2.1.-)
A endo xilogalacturonana hidrolase hidrolisa as ligações α-1,4 da xilose
substituída por xilogalacturonana. A atividade enzimática aumenta por meio da
remoção de ligações ésteres da galacturonana por saponificação (Voragen et
al., 2009).
2.3.5. Pectinases que degradam a rhamnogalacturonana
Diversas pectinases degradam essa cadeia existente na pectina. A
rhamnogalacturonana hidrolase (RGH; EC 3.2.1.-) hidrolisa a ligação α-D-1,4GalpA-α-L-1,2-Rhap na cadeia de rhamnogalacturonana I liberando Rhap da
extremidade não-redutora. Dentro dos produtos formados, os resíduos de
rhamnose podem ser substituídos por unidades de galactose simples. A
enzima
é
intolerante
para
acetil-esterificação
da
cadeia
de
rhamnogalacturonana. A atuação da rhamnogalacturonana liase (RGL; EC
4.2.2.-) ocorre através da clivagem eliminativa de α-L-1,2-Rhap-α-D-1,4-GalpA
da cadeia de rhamnogalacturonana I liberando um grupo de ácido
poligalacturônico insaturado, o 4-deoxi-β-L-threo-hex-4-enepiranosilurônico da
extremidade não-redutora. A atividade dessa enzima aumenta após a remoção
dos
grupos
acetil
da
cadeia
principal.
Já
rhamnogalacturonana
rhamnohidrolase (RGRH) é uma exo-pectinase que possui a especificidade de
liberar resíduos terminais de rhamnosil ligados (1→4) a resíduos de α19
galacturonosil. A enzima é intolerante para substituições de galactose e ainda
não foi classificada dentro da família de glicosil hidrolases. Por sua vez, a
rhamnogalacturonana galacturono hidrolase (RGGH) é capaz de liberar o
motivo de ácido poligalacturônico conectado ao resíduo de rhamnose da
extremidade não-redutora das cadeias de rhamnogalacturonana I, mas é
incapaz de liberar ácido poligalacturônico da cadeia de homogalacturonana. A
classificação dentro da família das glicosil hidrolases ainda está sendo avaliada
(Voragen et al., 2009).
2.4.
MICRO-ORGANISMOS PATÓGENOS DE PLANTAS
Os micro-organismos patógenos de plantas oferecem uma fonte única
para a descoberta de novas enzimas acessórias importantes para a penetração
no hospedeiro. Os fitopatógenos podem causar mais de 10000 diferentes
doenças nas plantas (Pennisi, 2001).
Os patógenos de plantas possuem a capacidade de adaptação às
plantas hospedeiras particulares. Alguns patógenos invadem e colonizam todos
os tecidos da planta, enquanto outros atacam apenas tecidos e órgãos
particulares, tais como folhas, raízes, caules, estruturas florais e sementes
(Gibson et al., 2011).
Os patógenos de plantas possuem uma relação íntima com seu
hospedeiro, exigindo a penetração da parede celular e a colonização do tecido
vivo. Muitos fungos patogênicos ativamente matam e degradam o tecido da
planta e utilizam os carboidratos liberados para o crescimento e reprodução
(King et al., 2011).
Pesquisas recentes têm revelado que fungos patogênicos de plantas são
produtores altamente competentes de enzimas que degradam a parede celular,
e os padrões de atividade enzimática refletem a especificidade do hospedeiro
(Gibson et al., 2011).
20
2.4.1. Cylindrocladium pteridis
O fungo Cylindrocladium pteridis é um micro-organismo patógeno de
plantas caracterizado por apresentar conídios cilíndricos a levemente curvados,
com as extremidades arredondadas possuindo predominantemente um septo.
Além disso, outra característica marcante da espécie é a presença de uma
vesícula clavada e estreitamente elipsoidal, com o diâmetro variando de 4 a 5
µm (Crous, 2002). O gênero Cylindrocladium possui espécies que são
importantes patógenos para espécies florestais como Eucalyptus, Pinus e
Acacia, para espécies agronômicas como amendoim, batata, ervilha, soja,
assim como para algumas espécies ornamentais (Crous et al., 1991).
As perdas em virtude das doenças causadas por esse patógeno são
relatadas com frequência em diversos países do mundo, como África, Brasil,
Costa Rica, Camarões, Índia, Malásia, Cingapura, África do Sul, Venezuela e
Estados Unidos (Alfenas, 1986, Crous, 2002).
No Brasil, esse patógeno foi descrito pela primeira vez em 1975 na
Bahia e novamente em 1986 no Pará, causando doença em Pinus caribaea
var. hondurensis. Em 1981, o fungo foi relatado por causar mancha foliar em
coqueiro (Cocos nucifera) no Maranhão. No mesmo ano ele foi isolado a partir
de amostras de solo coletadas de Crotalaria sp. no Distrito Federal (Graça et
al., 2009).
2.4.1.1.
Cylindrocladium pteridis e a infecção do eucalipto
Várias espécies de Cylindrocladium infectam o eucalipto causando
doenças como podridão radicular, cancro da haste, desfolha e a mancha foliar.
As manchas nas folhas e a desfolha são as principais doenças que atingem o
eucalipto. A doença foi relatada pela primeira vez em 1995 na Bahia e no Pará,
em uma procedência australiana de Eucalyptus grandis. Nessa cultura houve
uma desfolha intensa do povoamento (Ferreira et al., 1995). Atualmente, a
doença está amplamente distribuída nos diversos países, afetando plantios a
partir de seis meses até a idade de corte (Alfenas et al., 2009).
Na maioria das espécies de eucalipto, C.pteridis causa manchas
inicialmente pequenas, circulares ou alongadas, de coloração cinza-clara
21
progredindo para marrom-clara, podendo ocupar toda folha, o que resulta na
desfolha em genótipos susceptíveis. Porém, em outras espécies de eucalipto,
como E. cloeziana, as manchas são marrom-arroxeada (Ferreira & Milani,
2002).
O conhecimento da patogenia desse fungo no eucalipto (penetração e
multiplicação), bem como os fatores que influenciam tais processos, são prérequisitos básicos para as investigações morfológicas e citoquímicas
necessárias para compreender os mecanismos da expressão de genes
envolvidos na resistência. De acordo com Graça et al. (2009), o genótipo do
hospedeiro, a concentração do inóculo, o período de umidade foliar após a
inoculação do fungo, a idade da planta e o estádio fenológico da folha afetam
significativamente a severidade da doença causada por C.pteridis no eucalipto.
22
3. OBJETIVOS
3.1.
Produzir,
OBJETIVO GERAL
purificar
e
caracterizar
uma
poligalacturonase
do
fungo
Cylindrocladium pteridis LPF-59.
3.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Avaliar diferentes fontes de carbono indutoras da enzima em meio
líquido;
 Purificar
a
enzima
poligalacturonase
por
meio
de
técnicas
cromatográficas;
 Caracterizar bioquímico-cineticamente a enzima purificada;
 Identificar
propriedades
funcionais
aplicações biotecnológicas e industriais.
23
interessantes
para
possíveis
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado nos laboratórios de Tecnologia Bioquímica,
Enzimologia Aplicada e Análises Bioquímicas da Universidade Federal de
Viçosa, Minas Gerais, Brasil.
4.1.
Reagentes
O ácido poligalacturônico foi obtido da ICN Biomedica, a pectina de
cascas cítricas da Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA) e o PDA
(potato destrose agar) foi adquirido da Acumedia – Neogen do Brasil . As
resinas DEAE-Sepharose e Sephacryl S-200 foram obtidas da GE Healthcare
(Uppsala, Sweden).
Os demais reagentes utilizados para a execução deste trabalho
apresentavam procedência e grau de pureza analíticos.
4.2.
Micro-organismo
O fungo Cylindrocladium pteridis LPF-59 cedido para este trabalho,
pertence à coleção de fungos do Laboratório de Patologia Florestal da
Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil.
4.3.
Manutenção da cultura
O fungo mantido em placas de ágar foi ativado em novas placas também
contendo ágar e incubado em câmara de crescimento por 7 dias a 28oC. As
placas foram mantidas a 4oC e este estoque foi repicado para geração de
novas placas e padronização do inóculo.
4.4.
Preparo das fontes de carbono
As fontes de carbono testadas foram o farelo de trigo, o resíduo de
viveiro de eucalipto, o caule jovem de eucalipto, o caule lignificado de eucalipto
24
e a folha de eucalipto. O farelo de trigo foi adquirido no comércio local. O
material proveniente do eucalipto foi coletado no setor de Fitopatologia da
Universidade Federal de Viçosa. Os ramos frescos do eucalipto foram
recolhidos e separados em quatro partes denominadas: resíduo do viveiro
(ramo inteiro), folhas, caule jovem e caule lignificado. As porções foram
depositadas em bandejas e colocadas na estufa a 70 oC durante 2 dias. Após a
secagem, cada material separadamente foi triturado em moinho com peneira
correspondente a 20 mesh.
4.5.
Meio de cultura, cultivo do micro-organismo e produção
enzimática
A enzima poligalacturonase foi produzida por fermentação submersa em
frascos erlenmeyer de 250 mL contendo 125 mL de meio mineral líquido
esterilizado composto por: MgSO4.7H2O (0,5%), KH2PO4 (1,5%), NH4NO3
(1,0%), CaCl2.2H2O (0,2%), extrato de levedura (1,5%), fonte de carbono
(1,5%) e MnSO4, FeSO4, ZnSO4.7H2O como elementos traços. Os frascos
contendo o meio foram autoclavados, inoculados com 1 disco da placa do
fungo C.pteridis LPF-59 para cada 10 mL de meio e incubados no shaker a 180
rpm , 28 oC durante 168 horas. Alíquotas foram retiradas a cada 24 horas,
centrifugadas a 10000 x g por 10 minutos e armazenadas a -20 oC para
análises posteriores.
4.6.
Ensaios enzimáticos
4.6.1. Poligalacturonase
A atividade enzimática da poligalacturonase foi ensaiada em uma
mistura reacional contendo 100 µL do extrato enzimático e 400 µL de solução
de ácido poligalacturônico (0,25% p/v), previamente dissolvido em tampão
acetato de sódio 100 mM pH 5,0. Essa mistura foi incubada a 50oC durante 15
minutos em banho-mar. Após a incubação foi adicionado 500 µL de solução de
ácido dinitrosalicílico (DNS) e o ensaio foi submetido ao banho fervente por 5
25
minutos para paralisação da reação e desenvolvimento da cor . O conteúdo
dos tubos de ensaio foi transferido para microtubos e centrifugado a 16000 x g
por 10 minutos. O sobrenadante foi coletado, e adicionado 1 mL de água
destilada. Os açúcares redutores liberados foram quantificados pelo método de
Miller, (1956), usando glicose como padrão. Uma unidade de enzima (U) foi
definida como sendo a quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol
de açúcar redutor por minuto nas condições do ensaio.
4.7.
Determinação da concentração de proteínas
A concentração de proteínas foi determinada pelo método de Bradford
(1976). Esse método baseia-se no desenvolvimento da cor em função da
ligação da proteína com o corante Coomassie Brilhant Blue G-250. A leitura foi
realizada a 595 nm e a absorvância foi convertida em concentração de
proteínas a partir da curva padrão construída com BSA.
4.8.
Purificação da poligalacturonase
O processo utilizado para purificar a enzima poligalacturonase do fungo
Cylindrocladium pteridis está representado de forma resumida no fluxograma a
seguir:
26
Figura
9.
Sequências
dos
métodos
utilizados
para
purificação
da
poligalacturonase de Cylindrocladium pteridis
O extrato bruto. foi centrifugado a 21350 x g durante 30 minutos a 4oC.
O material precipitado foi descartado e o sobrenadante foi transferido para
frascos identificados e armazenados a -20oC.
Uma alíquota da amostra centrifugada foi submetida à cromatografia de
troca iônica convencional em uma coluna (3,0 x 7,5 cm) de DEAE-Sepharose
previamente equilibrada com tampão acetato de sódio, 50 mM, pH 5,5. As
proteínas foram eluídas pela aplicação de um gradiente salino crescente
formado por 100 mL de tampão acetato de sódio, 50 mM, pH 5,5, e 100 mL do
mesmo tampão contendo 0,5 M de NaCl. Todo o processo foi realizado a 4 oC,
com fluxo de 60 mL/h. Frações de 3 mL foram coletadas e aquelas que
apresentaram atividade de poligalacturonase foram reunidas.
O processo de ultrafiltração foi utilizado para concentração da amostra
enzimática proveniente da cromatografia de troca iônica. As frações foram
coletadas usando uma membrana de ultrafiltração Amicon® Ultra, Millipore
(Billerica, MA, USA) com um poro de exclusão de 3 kDa. O processo foi
27
realizado em centrífuga refrigerada Thermo Scientific a 6000 x g, por 1 hora, a
4 °C (rotor AM 50.14).
A amostra concentrada, proveniente da ultrafiltração, foi submetida à
cromatografia
de
filtração
em
gel
em
FPLC
(Fast
Protein
Liquid
Chromatography) em uma coluna (16/60) de Sephacryl S-200 previamente
equilibrada com tampão acetato de sódio, 50 mM, pH 5,5. As proteínas foram
eluídas com o mesmo tampão com fluxo contínuo de 30 mL/h e foram
coletadas frações de 2 mL. As frações com atividade de poligalacturonase
foram reunidas.
4.9.
Determinação do grau de pureza da enzima
4.9.1. Eletroforese
A eletroforese em gel de poliacrilamida (12%), contendo SDS e βmercaptoetanol foi realizada conforme descrito por Laemmli (1970). Os minigéis foram preparados a partir de solução estoque de acrilamida/N,N-metileno
bisacrilamida (bis) 30 % (p/v), tampão Tris/HCl 1,5 M, pH 8,6, para o gel
separador e tampão Tris/HCl 0,5 M, pH 6,8, para o gel empilhador, persulfato
de amônio 10 % (p/v), dodecil sulfato de sódio (SDS) 10 % (p/v) e, N,N,N,Ntetrametil-etilenodiamino de sódio (TEMED). As corridas eletroforéticas foram
realizadas à temperatura ambiente, a 100 V, em placas do Sistema de gel MiniPROTEAN da Bio-Rad. As amostras submetidas à eletroforese foram,
previamente, precipitadas com ácido tricloroacético (TCA) 50 % (p/v), lavadas
com acetona gelada e adicionadas ao tampão de amostra desnaturante 3
vezes concentrado (0,19 M Tris/HCl, pH 6,8, 2,3 % p/v de SDS, 1 % v/v de
glicerol, 5 % v/v de β-mercaptoetanol e azul de bromofenol), fervidas durante 5
minutos e aplicadas no gel (Laemmli, 1970).
4.9.2. Coloração dos géis de eletroforese
As proteínas presentes nos géis foram reveladas com nitrato de prata,
conforme procedimento descrito por Blum et al.(1987). Após a corrida
28
eletroforética, os géis foram colocados em 50 mL de solução fixadora (metanol,
ácido acético glacial e água, na proporção de 50:12:38 em volume) por no
mínimo 2 h, seguido de 3 lavagens de 10 minutos com solução de etanol 50 %
(p/v). Os géis foram lavados, por 1 minuto, em solução de tiossulfato de sódio
0,02 % (p/v). Em seguida, os géis foram rapidamente lavados com água
destilada e incubados, por 30 minutos, em solução de nitrato de prata 0,2 %
(p/v), contendo 37 µL de formaldeído 37 % (v/v) e lavados 3 vezes, por 20
segundos, com água destilada. Posteriormente, os géis foram tratados com a
solução reveladora (carbonato de sódio 4 %, contendo 2 mL de solução de
tiossulfato de sódio 0,02 % e 50 µL de formaldeído 37 %), até a visualização
das bandas protéicas. A reação foi interrompida pela adição de ácido acético.
4.10. Determinação da massa molecular
Para a determinação da massa molecular da poligalacturonase de
C.pteridis foi utilizada a eletroforese em gel de poliacrilamida (12%). Os
marcadores de massa molecular utilizados foram os da Fermentas Life
Sciences, uma mistura de 14 proteínas altamente purificadas, com suas
massas moleculares pré-definidas. A massa molecular da poligalacturonase foi
estimada correlacionando-se, por meio de uma curva padrão, os perfis de
migração das proteínas padrão (distância percorrida no gel, em centímetros)
com o logaritmo das massas moleculares.
4.11. Caracterização enzimática
4.11.1.
Efeito do pH
O ensaio para verificar o efeito do pH na atividade da poligalacturonase
foi o mesmo descrito no item 4.6.1 exceto que o ensaio foi realizado em
diferentes valores de pH utilizando-se tampões Mcllvaine (Mcllvaine, 1921), na
faixa de 2,6 a 8,0. O substrato ácido poligalacturônico 0,25% (w/v) foi
previamente preparado nos diferentes tampões McIlvaine 100 mM e seus
respectivos valores de pH aferidos.
29
4.11.2.
Efeito da temperatura
Para o estudo do efeito da temperatura na atividade enzima, as
condições de ensaio foram as mesmas descritas no item 4.6.1 exceto que o
ensaio foi realizado em várias temperaturas compreendidas entre 20 e 80 oC.
4.11.3.
Estabilidade de pH
O efeito do pH na estabilidade da poligalacturonase foi testado préincubando a solução da enzima na faixa de pH de 2,6 a 8,0, por 60 minutos a
25oC. A proporção da solução foi 100 µL da enzima pura para 400 µL de
tampão McIlvaine 100 mM nos valores de pH citados acima. Após o período de
pré-incubação, a atividade da enzima foi realizada conforme item 4.6.1.
4.11.4.
Termoestabilidade e cálculo da meia vida da enzima
A estabilidade térmica da poligalacturonase foi avaliada a 50 e 60°C. A
amostra contendo a poligalacturonase purificada foi pré-incubada nas
temperaturas acima citadas, em tampão acetato de sódio 100 mM pH 4,0, por
diferentes tempos. Para o ensaio conduzido a 50oC, a atividade residual foi
avaliada até 12 horas. Já para o ensaio conduzido a 60 oC a atividade residual
foi avaliada até 120 minutos. Após cada tempo de pré-incubação, uma alíquota
de 100 µL de amostra foi retirada e então o ensaio enzimático foi realizado
conforme o item 4.6.1.
Os valores de meia-vida da enzima foram calculados a partir do ajuste
de uma equação exponencial decadente, do tipo y=a.e -bx, a partir dos dados
obtidos no experimento utilizando o programa Sigma Plot.
4.11.5.
Determinação dos parâmetros cinéticos
Para determinação dos valores de KM e Vmax para a poligalacturonase de
C.pteridis, os ensaios de atividade enzimática foram realizados utilizando-se
30
concentrações crescentes do substrato ácido poligalacturônico ou pectina
cítrica. Os ensaios enzimáticos foram conduzidos como descrito no item 4.6.1,
porém, as concentrações utilizadas foram de 0,02% a 0,2% (w/v) para o ácido
poligalacturônico e de 0,08% a 0,8% (w/v) para a pectina cítrica.
Os valores de KM e Vmax para a enzima foram calculados pela curva de
velocidade em função da concentração de substrato - Curva de MichaelisMenten, pelo programa Sigma Plot.
4.11.6.
Determinação da especificidade de substrato
Ensaios enzimáticos foram realizados com diversos substratos com o
objetivo de determinar a especificidade da poligalacturonase purificada. Os
substratos testados foram o ácido poligalacturônico, a pectina de cascas
cítricas e o reagente PDA (potato dextrose agar). Os ensaios de atividades
foram realizados conforme o item 4.6.1.
4.11.7.
Efeito de íons, agentes redutores e açúcares
Os efeitos de íons, agentes redutores e açúcares na atividade da
poligalacturonase, foram avaliados na concentração final de 2 mM.. Os
compostos testados foram: iodeto de potássio, nitrato de prata, cloreto de
potássio, fluoreto de sódio, cloreto de potássio, nitrato de sódio, cloreto de
manganês, sulfato de cobre, cloreto de zinco, cloreto de mercúrio, sulfato de
magnésio, cloreto de cálcio, sulfato ferroso, cloreto de cobalto, glicose,
galactose,
lactose,
sacarose,
xilose,
ureia,
β-mercaptoetanol,
ácido
etilenodiaminotetracético (EDTA) e dodecil sulfato de sódio (SDS). Após adição
de cada efetor, os ensaios da atividade de poligalacturonase foram conduzidos
conforme descrição no item 4.6.1.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
31
5.1.
Seleção
da
melhor
fonte
de
carbono
para
produção
enzimática
A atividade de poligalacturonase foi quantificada no sobrenadante da
cultura de C.pteridis LPF-59 , contendo as diferentes fontes de carbono.
Figura 10. Atividade de poligalacturonase (U.mL-1) no sobrenadante da cultura
de C.pteridis LPF-59 nas diferentes fontes de carbono. (■) resíduo de viveiro de
eucalipto antigo, (■) resíduo de viveiro de eucalipto novo, (■) folha de eucalipto,
(■) caule jovem de eucalipto, (■) caule lignificado de eucalipto e (□) farelo de
trigo.
Todas as fontes de carbono testadas foram capazes de induzir a
expressão de poligalacturonase por C.pteridis. Entretanto, o resíduo de viveiro
antigo, o resíduo de viveiro novo e a folha de eucalipto se destacaram na
indução da poligalacturonase em relação às demais fontes. Do conjunto de
fontes de carbono testadas, cinco foram constituídas de material proveniente
do eucalipto e uma foi composta por farelo de trigo, que é uma fonte de
carbono padronizada para secreção de enzimas por fungos que degradam a
parede celular de plantas.
32
Uma vez que o fungo C. pteridis LPF-59 é fitopatogênico e foi isolado de
plantações de eucalipto, era de se esperar que a utilização de diferentes partes
do eucalipto para indução da atividade de poligalacturonase promovesse
diferenças no perfil de atividade da enzima. .
O resíduo de viveiro compreende o ramo inteiro do eucalipto contendo a
folha, o caule jovem e o caule lignificado em diferentes proporções. A
proporção de pectina na parede celular de plantas varia de acordo com a parte
do vegetal, o crescimento e principalmente a idade da planta. Esse último fator
pode explicar a diferença de atividade da poligalacturonase obtida na cultura de
C. pteridis contendo o resíduo de viveiro antigo e o resíduo de viveiro novo,
uma vez que essas fontes de carbono foram recolhidas em épocas diferentes.
Além disso, pode-se citar a diferença na proporção de folhas e caules em cada
resíduo, o que consequentemente gera uma diferença na proporção de
substrato disponível para indução da enzima.
Tanto a folha de eucalipto quanto o resíduo de viveiro antigo se
destacaram como indutores da poligalacturonase em C. pteridis, tendo sido
detectado aproximadamente 38 U.mL-1 em 120 horas de cultivo. Porém, a
atividade para a folha de eucalipto aumentou, chegando a 42 U.mL -1 em 168
horas. Já para o resíduo antigo, a atividade permaneceu constante a partir de
120 horas de cultivo.
Uma vez que a folha de eucalipto foi a fonte que promoveu maior
atividade de poligalacturonase por C.pteridis, e sendo um material mais
homogêneo para utilização como fonte de carbono para o preparo do meio de
cultura, a folha de eucalipto foi selecionada como sendo o possível indutor para
os ensaios posteriores de produção da enzima por C.pteridis.
Quando a atividade da poligalacturonase de C.pteridis foi expressa em
função da concentração de proteínas, a atividade específica foi maior no
sobrenadante da cultura contendo o caule jovem de eucalipto e o caule
lignificado de eucalipto (Figura 11).
33
Figura 11. Atividade específica de poligalacturonase (U.mg-1) no sobrenadante
da cultura de C.pteridis LPF-59 nas diferentes fontes de carbono. (■) resíduo
de viveiro de eucalipto antigo, (■) resíduo de viveiro de eucalipto novo, (■) folha
de eucalipto, (■) caule jovem de eucalipto, (■) caule lignificado de eucalipto e
(□) farelo de trigo.
Caule jovem e caule lignificado de eucalipto promoveram a maior
atividade específica, próxima a 500 U.mg-1 com 96 horas de cultivo, enquanto a
atividade específica detectada no meio contendo folha de eucalipto, no mesmo
tempo de cultivo foi de aproximadamente 300 U.mg-1. Entretanto, pode ser
observado que a atividade específica nos meios contendo essas três fontes de
carbono se tornaram equivalentes com 168 horas de cultivo, apresentando
valores próximos a 370 U.mg-1.
A Tabela 1 contém os dados dos maiores valores de atividade de
poligalacturonase detectados nos meios contendo as diferentes fontes de
carbono e os respectivos tempos de cultivo.
34
Tabela 1. Atividade de poligalacturonase detectada nos meios de cultura de
C.pteridis contendo diferentes fontes de carbono.
Poligalacturonase
Fonte de carbono
-1
Atividade (U.mL )
-1
Atividade específica (U.mg )
Resíduo de viveiro antigo
39,54 ± 0,10
168*
387,06 ± 0,49
120
Resíduo de viveiro novo
32,53 ± 0,62
168
377,06 ± 0,31
96
Folha de eucalipto
42,28 ± 0,80
168
408,99 ± 0,29
144
Caule jovem de eucalipto
15,99 ± 0,72
96
532,94 ± 0,36
96
Caule lignificado de eucalipto
14,23 ± 0,71
96
506,09 ± 0,36
96
Farelo de trigo
14,00 ± 0,75
168
237,02 ± 0,38
168
(*) horas de cultivo apresentando maior atividade de poligalacturonase.
Visando a purificação da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 é
importante obter um extrato enzimático com alta atividade específica. Sendo
assim, partindo de uma amostra com alta atividade específica a purificação
tende a ser mais eficiente. Dentro dessa perspectiva, o caule jovem e o caule
lignificado seriam bons candidatos, pois induziram a maior atividade específica
em 96 horas de cultivo. Porém, a folha de eucalipto, apesar de induzir menor
atividade específica quando comparada ao caule jovem e lignificado,
apresentou com 120 horas de cultivo uma atividade específica considerável
(390 U.mg-1) e uma atividade em U.mL-1 aproximadamente 2,5 e 4 vezes maior
que o caule jovem e o caule lignificado, respectivamente.
Esse fator foi determinante para escolha da folha de eucalipto como a
melhor fonte de carbono para produção da enzima por C.pteridis, uma vez que
o fungo cultivado nessa fonte por 120 horas apresentou uma maior atividade
(U.mL-1) aliada a uma atividade específica também alta.
Assim, as etapas posteriores de produção enzimática por C.pteridis
foram realizadas em meio líquido contendo a folha de eucalipto como fonte de
carbono por um período de 120 horas.
A Figura 12 mostra as equações e as linhas de tendência (preto) obtidas
a partir dos dados de atividade de poligalacturonase de C.pteridis nos meios
com as diferentes fontes de carbono
35
Figura 12. Atividade de poligalacturonase real (colorido) e teórica (preto) de
acordo com as diferentes fontes de carbono ao longo do tempo de cultivo. (A)
Resíduo de viveiro de eucalipto antigo (B) Resíduo de viveiro de eucalipto novo
(C) Folha de eucalipto (D) Caule jovem de eucalipto (E) Caule lignificado de
eucalipto (F) Farelo de trigo.
36
5.2.
Purificação da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59
A poligalacturonase de C. pteridis LPF-59 foi produzida a partir da
inoculação do fungo em meio líquido contendo folha de eucalipto como fonte de
carbono. Após 120 h de cultivo, o extrato enzimático foi então submetido ao
processo de purificação (Tabela 2).
Tabela 2. Resumo das etapas de purificação da poligalacturonase de C.pteridis
LPF-59.
Etapa
Volume
Atividade total
Proteína total
Atividade específica
Rendimento
Fator de
-1
(mL)
(U)
(mg)
(U.mg )
(%)
purificação
Extrato bruto
40
1372,80
2,676
513,00
100
1
Troca Iônica
66
1055,34
0,390
2706,00
76,88
5,27
Ultrafiltração
11
477,40
0,072
6630,56
34,75
12,93
Gel Filtração
55
259,60
0,038
6831,58
18,91
13,32
Durante a cromatografia de troca iônica, DEAE-Sepharose, a eluição das
proteínas que aderiram à resina foi feita pela aplicação de um gradiente
crescente de NaCl, variando de 0 a 0,5 M. A eluição com o gradiente salino
permitiu a detecção de apenas um pico proteico contendo atividade de
poligalacturonase (Figura 13).
37
Figura 13. Perfil cromatográfico obtido após a aplicação do extrato bruto
centrifugado
em
coluna
de
troca
iônica
DEAE–Sepharose.
Atividade
poligalacturonase (●); Proteína Abs 280 nm (○); gradiente salino (−).
O perfil cromatográfico da troca iônica também revelou a eluição de
grande parte das proteínas contaminantes antes da passagem do gradiente, o
que justifica o aumento da atividade específica. Sendo assim, a cromatografia
de troca iônica foi uma etapa eficiente no processo de purificação da
poligalacturonase, pois a atividade específica aumentou aproximadamente 5
vezes em relação ao extrato bruto, com um rendimento de 76%.
As frações ativas reunidas provenientes da troca iônica foram
concentradas por ultrafiltração, utilizando uma membrana com limite de
exclusão de 3 KDa. Esta etapa promoveu um grande acréscimo nos valores de
atividade específica das preparações enzimáticas, próximo a 2,5 vezes (Tabela
2), principalmente por promover a exclusão de fragmentos proteicos e de
peptídeos de massa molecular menor que 3 KDa.
Posteriormente,
a
amostra
concentrada
foi
submetida
a
uma
cromatografia de filtração em gel, em uma coluna de Sepahcryl S-200. O perfil
cromatográfico da filtração em gel está representado na Figura 14.
38
Figura 14. Perfil cromatográfico obtido após a aplicação da fração ativa
concentrada, proveniente da troca iônica, em coluna de gel filtração Sephacryl
S-200. Atividade poligalacturonase (●); Proteína Abs 280 nm (○).
O perfil de eluição da cromatografia de filtração em gel também revelou
a
presença
de
apenas
um
pico
de
proteínas
com
atividade
de
poligalacturonase. As frações contendo atividade enzimática foram reunidas e
armazenadas.
A presença de apenas um pico proteico contendo atividade de
poligalacturonase ao longo das etapas do processo de purificação pode indicar
a expressão de uma única enzima pelo fungo C.pteridis LPF-59 nas condições
testadas.
Ao final do processo de purificação, a poligalacturonase de C.pteridis
LPF-59 apresentou um fator de purificação de 13,32 vezes, com rendimento de
18,91 % (Tabela 2).
Para confirmar a purificação da poligalacturonase as amostras com
atividade provenientes de cada etapa da purificação foram submetidas à
eletroforese em gel de poliacrilamida 12% em condições desnaturantes (SDSPAGE).
39
O perfil de migração das proteínas presentes nas amostras está
apresentado na figura 15.
Figura 15. Eletroforese desnaturante (SDS-PAGE 12 %) corado com prata das
amostras com atividade de poligalacturonase de C.pteridis LPF-59. (A) 1extrato bruto, 2 - fração enzimática proveniente da troca iônica, 3 - fração
enzimática proveniente da filtração em gel e 4 – marcadores de massa
molecular.
Confirmando os dados mostrados na Tabela 2, que indicam a eficiência
de cada etapa do processo de purificação, foi também mostrado que as etapas
de purificação renderam diminuição do número de bandas de proteínas, como
visto na Figura 15. A amostra proveniente da última etapa do processo de
purificação indicou a presença de uma única banda proteica. Esse resultado
mostra que o processo de purificação estabelecido foi eficiente.
Entretanto, para determinação deste protocolo de purificação, resinas
com diferentes princípios de fracionamento proteico foram utilizadas e
analisadas quanto à viabilidade de aplicação no processo de purificação da
poligalacturonase de C. pteridis. A recuperação da poligalacturonase em cada
40
etapa deveria ser a melhor possível, sem afetar drasticamente a atividade
enzimática e o seu rendimento.
5.3.
Determinação da massa molecular
A massa molecular da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59, estimada
a partir do gel SDS-PAGE, foi de aproximadamente 68 KDa.
Figura 16. Determinação da massa molecular da poligalacturonase purificada
de C.pteridis LPF-59, a partir de SDS-PAGE. Distâncias percorridas pelos
padrões proteicos do marcador (♦) e pela poligalacturonase (●).
Valores de massa molecular próximos ao obtido neste trabalho, foram
descritos na literatura para poligalacturonase fúngicas, como 68 KDa para a
enzima de Sclerotinia sclerotiorum (Riou et al.,1992) e 60 KDa para
poligalacturonase de Cochliobolus carbonum (Scott-Craig et al., 1998). Outras
estimativas
similares
foram
encontradas
para
duas
isoformas
da
poligalacturonase do fungo fitopatogênico Botrytis cinerea, uma com massa
molecular de 65 KDa e a outra com uma massa molecular de 52 KDa
(Cabanne et al. 2002). Duas isoformas da poligalacturonase de Penicillium
41
frequentans também foram identificadas nos estudos de Barense et al. (2001) e
as massas moleculares estimadas foram 63 KDa e 79 KDa.
5.4.
Caracterização enzimática
5.4.1. Efeito do pH
O efeito do pH sobre a atividade da poilgalacturonase de C.pteridis LPF59 contra o substrato ácido poligalacturônico foi avaliado conforme o item
4.11.1. De acordo com a figura 17, a atividade máxima para poligalacturonase
foi determinada em pH 4,0. No pH 3,6, a enzima manteve atividade acima de
90%. Em valores acima do pH ótimo, a atividade decresceu continuamente,
sendo que acima do pH 5,0 a enzima não manteve mais que 20% de atividade.
Esse resultado indica que a poilgalacturonase de C.pteridis é uma enzima
ácida e que em valores de pH acima de 6,0, provavelmente ocorre alteração na
carga dos aminoácidos catalíticos presentes no sítio ativo da enzima, reduzindo
drasticamente sua atividade.
Atividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
Figura 17. Efeito do pH na atividade da poligalacturonase purificada de
C.pteridis LPF-59 na temperatura de 50oC.
42
A poligalacturonase de Penicillium solitum apresenta máxima atividade
quando incubada em pH 4,0, sendo que esta enzima mantém atividade acima
de 70% em uma faixa de pH compreendida entre 4,0 e 5,5 (Jurick et al., 2009).
Quiroga et al.(2009) determinaram que a poligalacturonase de Pcynoporus
sanguineus apresenta taxa máxima de hidrólise em pH 4,8.
A estabilidade da enzima após 60 minutos de incubação a 25 oC em
diferentes valores de pH foi analisada conforme item 4.11.3. As atividades
residuais da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 são mostradas na figura
18.
Atividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
Figura 18. Efeito do pH na estabilidade da poligalacturonase purificada de
C.pteridis LPF-59 após 60 minutos de incubação a 25oC em diferentes valores
de pH . Efeito do pH na atividade da poligalacturonase (●) e efeito do pH na
estabilidade da poligalacturonase (○).
A enzima mostrou maior estabilidade quando incubada em pH 3,6 e 4,0.
Além disso, a enzima manteve mais de 70% de sua atividade máxima quando
incubada por 1h a 25oC em uma faixa de pH entre 3,6 e 6,0. Quando incubada
em pH 2,6 e 7,6 a enzima reteve ainda 40% de sua atividade máxima. Os
43
dados da estabilidade da enzima em diferentes valores de pH indicam que
mesmo após pré-incubação da enzima em valores de pH acima de 6,0, esta foi
capaz de renaturar e restabelecer parte da atividade. Entretanto a enzima
manteve apenas 20% de sua atividade máxima quando pré-incubada em pH
8,0, logo este valor de pH demonstrou ser mais drástico para a estabilidade da
enzima. Isso evidencia a habilidade da enzima para atuar em ambientes
ácidos, característica apreciada nas indústrias alimentícias.
Aminzadeh
et
al.
(2006)
analisaram
a
estabilidade
de
uma
poligalacturonase do fungo filamentoso Tetracoccosporium sp. em diferentes
valores de pH, concluindo que a enzima exibe mais de 80% de atividade
residual após 90 minutos de incubação a 25 oC em uma faixa de pH
compreendida entre 3,0 e 7,0.
Penicillium viridicatum RFC3 produziu uma
poligalacturonase que mantém mais de 70% de sua atividade máxima, após 24
horas de incubação a 25oC , em uma faixa de pH entre 4,0 e 6,0
Segel (1979) descreve que os efeitos do pH na estabilidade de uma
enzima devem ser levados em conta, uma vez que o pH interfere na ligação do
substrato e na catálise. Além disso, a curva para determinação do pH ótimo
não fornece informações suficientes a respeito do comportamento da atividade
enzimática acima e abaixo do pH ótimo. O declínio da atividade enzimática
abaixo ou acima do pH ótimo de atuação da enzima pode ser resultado da
inativação da enzima ou de uma forma iônica não adequada do substrato e da
enzima ou de um dos dois.
Logo, o declínio da atividade da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59
nas faixas de pH abaixo de 3,0 e entre 4,6 e 8,0 pode ser devido a uma
mudança conformacional não adequada da enzima, o que diminuiu sua
eficiência catalítica.
5.4.2. Efeito da temperatura
O efeito da temperatura sobre a atividade da poligalacturonase do fungo
C.pteridis LPF-59 contra o substrato ácido poligalacturônico foi avaliado
conforme o item 4.11.2 e está representado na figura 19.
44
Atividade relativa (%)
100
80
60
40
20
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Temperatura
Figura 19. Efeito da temperatura na atividade da poligalacturonase purificada
de C.pteridis LPF-59 em pH 4,0.
A enzima exibiu máxima atividade quando ensaiada a 60 oC, sendo que a
55 e 65 oC a atividade da enzima foi maior que 70%. Atividades próximas a
60% foram observadas em 45 e 50oC. Nas temperaturas 40, 70 e 75oC, a
enzima exibiu aproximadamente 50% de sua atividade máxima. No entanto, a
enzima incubada a 80oC não apresentou atividade maior que 35%. Esse
comportamento também foi observado para temperaturas abaixo de 35 oC.
Em temperaturas maiores que 60oC, a atividade da enzima diminui
continuamente, provavelmente devido às alterações estruturais na enzima
afetando a sua ligação com o substrato.
A poligalacturonase de Pyconoporus sanguineus estudada por Quiroga
et al. (2009) exibiu máxima atividade quando ensaiada em uma faixa de
temperatura entre 50 -60oC. O estudo de duas isoformas da poligalacturonase
do fungo Penicillium frequentans indicaram atividade máxima quando
incubadas a 50oC (Barense et al., 2001).
Algumas
poligalacturonases
apresentam
atividade
máxima
em
temperaturas mais brandas, como a poligalacturonase produzida pelo fungo
45
Penicillium solitum. Estudos com essa enzima determinaram atividade máxima
nos intervalos de temperatura entre 20 e 37 oC. Acredita-se que a máxima
atividade em baixas temperaturas possa facilitar a invasão e a colonização do
micro-organismo na planta hospedeira durante o período frio (Jurick et al.,
2009).
A máxima atividade da poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 a 60 oC é
uma propriedade importante do ponto de vista industrial, principalmente para
possíveis aplicações dessa enzima na indústria de sucos e bebidas. Na
maceração da uva para extração do suco, por exemplo, a incubação a 60-65
o
C promove o rompimento da membrana e rupturas na parede celular do fruto,
facilitando a liberação do líquido e das antocianinas responsáveis pela cor do
suco (Gomes et al., 2007).
5.4.3. Análise da termoestabilidade
A termoestabilidade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59
foi avaliada nas temperaturas de 50 e 60 oC como descrito no item 4.11.4.
100
90
Atividade relativa (%)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
200
400
600
800
Tempo (min)
Figura 20. Efeito da temperatura na estabilidade da poligalacturonase
purificada de C.pteridis LPF-59. As amostras enzimáticas foram pré-incubadas
46
nas temperaturas de 50oC (●) e 60oC (). As atividades relativas foram
calculadas considerando-se a atividade sem pré-incubação como 100 %.
A poligalacturonase permaneceu com aproximadamente 90% de sua
atividade inicial nos primeiros 30 minutos de incubação a 50oC, entretanto, a
60oC, a enzima manteve 90% de atividade nos primeiros 20 minutos de
incubação. Após 60 minutos de incubação, a enzima manteve 44% e 77% de
sua atividade a 60oC e a 50o C, respectivamente. Após 120 minutos a 60oC, a
poligalacturonase apresentou 38% de sua atividade inicial, sendo que após
esse mesmo tempo de pré-incubação a 50oC a enzima ainda mantinha 69 %
de atividade residual.
Gadre
et
al.
(2003)
descreveram
uma
poligalacturonase de Mucor flavus que foi completamente inativada com 30
minutos de incubação a 55oC, entretanto a 45oC, a enzima retinha 80% da sua
atividade inicial após 4 horas de incubação. Já a poligalacturonase de Mucor
circinelloides apresentou 71% de atividade inicial após 2 horas de incubação a
42oC e após 7 horas ainda manteve 42% da sua atividade inicial. Porém,
quando incubada a 50oC sua atividade foi de apenas 22 % com 5 horas de
incubação
(Thakur
et
al.,
2010).
Muitas
poligalacturonases
perdem
rapidamente a atividade em temperaturas acima de 50 oC, devido à
desnaturação da enzima e consequente perda da eficiência de catálise.
A poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 se mostrou bastante
termoestável a 50oC. Essa característica a torna interessante para aplicação
industrial, visto que muitos processos biotecnológicos são conduzidos em
elevadas temperaturas. Para isso, essas enzimas necessitam manter a
estabilidade ao longo de todo processo. Sabe-se que altas temperaturas
favorecem a solubilidade dos substratos e dos produtos, aumentam as taxas de
reação devido à redução da viscosidade e ao aumento do coeficiente de
difusão dos substratos (Gomes et al., 2007). Além de aumentar a
produtividade, as reações conduzidas em temperaturas elevadas reduzem a
contaminação microbiana. Logo, poligalacturonases termoestáveis têm sido
objeto de inúmeros estudos envolvendo a elucidação de mecanismos de
desnaturação térmica e o desenvolvimento de estratégias para aumento da
estabilidade (Aminzadeh et al., 2006).
47
5.4.3.1.
Meia-vida da poligalacturonase
Os valores de meia-vida da poligalacturonase purificada de C.pteridis
LPF-59 a 50oC e a 60oC foram de 260 e 66 minutos, respectivamente (Figura
21).
100
A
Y = 95,8660*e
2
r = 0,9846
Atividade relativa (%)
80
(-0,0025x)
60
40
20
0
0
200
400
600
800
Tempo (min)
100
B
Y = 102,8204*e
2
r = 0,9036
Atividade relativa (%)
80
(-0,0108x)
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Tempo (min)
Figura 21. Valores de meia-vida estimados para poligalacturonase purificada
de C.pteridis LPF-59 em temperaturas de (A) 50 °C, (B) 60 °C.
48
Estudos realizados por Thakur et al. (2010) determinaram a meia-vida
para poligalacturonase de Mucor circinelloides de 2 horas a 50oC. Aminzadeh
et al. (2006) indicaram em seus estudos que a poligalacturonase do fungo
Tetracoccosporium sp. exibiu meia-vida de 63 minutos a 60oC, valor bem
próximo ao encontrado para a poligalacturonase identificada neste trabalho.
5.4.4. Determinação dos parâmetros cinéticos
O efeito da concentração dos substratos ácido poligalacturônico e
pectina cítrica sobre a atividade da enzima poligalacturonase do fungo
C.pteridis LPF-59 foi avaliado conforme item 4.11.5.
Os valores das constantes cinéticas KM, bem como os valores Vmax e da
relação Vmax.KM-1 obtidos para a enzima contra os dois diferentes substratos
testados pode ser observado na tabela 3.
Tabela 3. Valores de KM, Vmax e Vmax.KM-1 obtidos para poligalacturonase
purificada de C.pteridis LPF-59, determinados pela curva de Michaelis-Menten
para os substratos ácido poligalacturônico e pectina cítrica.
Poligalacturonase
-1
-1
-1
-1
Substrato
KM (mg.mL )
Vmax (U.mL )
Vmax.KM (U.mg )
Ácido poligalacturônico
0,525
5,862
11,174
Pectina cítrica
6,770
16,167
2,388
Todos os parâmetros cinéticos apresentados neste trabalho foram
obtidos por ajuste da equação de Michaelis-Menten (V=(Vmax . [S]) . (KM + [S])-1)
a um conjunto de dados que relacionava velocidade de hidrólise vs
concentração de substrato.
Segel
(1979),
afirma
que
a
constante
cinética
KM
indica
a
“adequacidade” relativa de diferentes substratos para uma determinada
enzima, ou seja, o substrato que apresenta o menor valor de KM possui uma
maior afinidade aparente para a enzima. Da mesma maneira, o valor da
relação Vmax.KM-1, pode ser utilizado como um parâmetro de comparação para
49
medir a eficiência catalítica de uma enzima para diferentes substratos , sendo
que, valores maiores da relação Vmax.KM-1 indicam uma maior eficiência
catalítica.
Sendo assim, a poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 apresentou
maior afinidade pelo substrato ácido poligalacturônico, comparada ao substrato
pectina cítrica. Esse comportamento é confirmado também pela relação
Vmax.KM-1, que indica uma maior eficiência catalítica da enzima sobre o ácido
poligalacturônico.
É frequentemente observado na literatura, que as poligalacturonases
apresentam maior afinidade pelo ácido poligalacturônico. Quiroga et al. (2009),
avaliando uma poligalacturonase produzida por Pyconopporus sanguineus,
determinaram um KM de 0,55 mg.mL-1 para ácido poligalacturônico, sendo que
o KM para pectina cítrica foi de 0,72 mg.mL-1. Além disso, a eficiência catalítica
(Vmax.KM-1) da enzima do P.sanguinueus demonstrou ser maior para ácido
poligalacturônico do que para pectina cítrica.
Análises dos parâmetros cinéticos da poligalacturonase de Mucor
circinelloides na hidrólise do ácido poligalacturôncio indicaram 2,2 mM e 4,81
U.mL-1 para KM e
Vmax,
respectivamente
(Thakur
et
al., 2010). A
poligalacturonase de Penicillium viridicatum exibiu valor de KM para pectina
cítrica de 1,30 mg.mL-1 (Gomes et al., 2009).Para poligalacturonase produzida
pelo fungo Tetracoccosporium sp., Aminzadeh et al. (2006) determinaram
valores de 3,23 mg.mL-1 para KM e 0,15 U para Vmax quando o substrato
estudado foi o ácido poligalacturônico.
5.4.5. Especificidade de substrato
A enzima poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 foi avaliada quanto à
habilidade de hidrolisar o ácido poligalacturônico, a pectina cítrica e PDA
(potato dextrose agar). Os ensaios foram conduzidos de acordo com o item
4.11.6 e os resultados obtidos podem ser observados na tabela 4.
50
Tabela 4. Especificidade da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF-59
para os diferentes substratos na concentração final de 0,2% (p/v).
Substrato
Atividade (U.mL-1) ± DP
Atividade relativa (%)
Ácido poligalacturônico
4,14 ± 0,29
100
Pectina cítrica
2,12 ± 0,17
51,21
PDA
2,71 ± 0,09
65,46
A poligalacturonase estudada neste trabalho foi mais específica para a
hidrólise do ácido poligalacturônico do que para os demais substratos testados.
Poligalacturonase de Mucor flavus demonstrou maior especificidade
para o ácido poligalacturônico quando comparada a pectina cítrica. Acredita-se
que a extensão da hidrólise decresce com o aumento do grau de esterificação
da molécula. (Gadre et al., 2003). Logo, a menor taxa de hidrólise da pectina
cítrica pela poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 em relação ao substrato
ácido poligalacturônico pode ser explicada pela maior taxa de esterificação
presente na pectina.
Estudos de especificidade para poligalacturonase produzida pelo fungo
Mucor circinelloides indicaram uma maior habilidade de hidrólise do ácido
poligalacturônico, sendo que para a pectina cítrica e para o PDA, a enzima
manteve apenas 11 e 3,7 % da atividade relativa, respectivamente (Thakur et
al., 2010).
O PDA é um reagente composto de infusão de batata, dextrose e agar.
Por ser uma fonte nutritiva, incentiva a esporulação de micro-organismos sendo
muito utilizado como meio de crescimento de fungos e leveduras. A infusão de
batatas está presente na concentração de 4 g.L-1 e a batata apresenta pectina
como um polímero importante da sua parede celular. Assim, o fungo C.pteridis
LPF-59 foi capaz de hidrolisar esse substrato, com atividade de hidrólise
próxima a da pectina cítrica. Este resultado é bastante interessante do ponto de
vista industrial, uma vez que mostra a capacidade da poligalacturonase de
C.pteridis de atuar sobre diferentes substratos.
51
5.4.6. Efeito de íons, açúcares e agentes redutores
O efeito dos íons, açúcares e agentes redutores foi avaliado conforme
descrito no item 4.11.7. A concentração final dos efetores foi de 2 mM e a
atividade relativa foi calculada considerando a atividade da enzima sem efetor
como 100%.Os resultados obtidos podem ser observados na tabela 5.
Tabela 5. Atividade relativa da poligalacturonase purificada de C.pteridis LPF59 submetida aos diferentes efetores na concentração final de 2 mM.
Efetor
Atividade relativa (%) ± DP
Controle
100 ± 0,17
KI
72,30 ± 0,26
AgNO3
54,17 ± 0,31
NaCl
65,40 ± 0,35
NaF
95,33 ± 0,83
KCl
94,22 ± 0,92
NaNO3
73,35 ± 0,02
MnCl2
35,39 ± 0,05
CuSO4
39,33 ± 0,08
ZnCl2
83,54 ± 0,17
HgCl2
3,88 ± 0,05
MgSO4
73,06 ± 0,12
CaCl2.H2O
57,87 ± 0,05
FeSO4
52,21 ± 0,13
CoCl2.
60,02 ± 0,08
Glicose
93,77 ± 0,29
Galactose
102,60 ± 0,09
Lactose
51,85 ± 0,05
Sacarose
87,35 ± 0,08
Xilose
101,98 ± 0,15
52
Uréia
98,49 ± 0,02
β-mercaptoetanol
88,71 ± 0,06
EDTA
58,46 ± 0,03
SDS
14,35 ± 0,04
A atividade da poligalacturonase não sofreu alterações significativas na
presença de NaF, KCl, Glicose, Galactose, Xilose, e Uréia. Dentre os açúcares
estudados, a lactose foi aquele com maior potencial de inibição, observando-se
uma atividade residual de aproximadamente 51%.
A atividade da enzima foi parcialmente inibida na presença de KI,
NaNO3, ZnCl2, MgSO4, sacarose e β-mercaptoetanol. Os íons Mn+2, Cu+2, Hg+
inibiram fortemente a atividade da poligalacturonase do fungo C.pteridis LPF59. O íon Hg+ é descrito como um forte inibidor de grupos tióis e apresenta alta
afinidade por grupos carboxil e imidazólico de histidina (Sundd et al., 1998).
Isso sugere que a inibição destes grupos pelos íons Hg+ pode causar a perda
da atividade enzimática quando estes se encontram no sítio ativo destas
enzimas.
Gomes et al. (2009) mostraram que uma poligaturonase de Penicillium
viridicatum RFC3 foi fortemente inibida por K+, Zn+2, Mg+2, Cu+2 e Hg+, porém
para os íons Na+ e Mn+2 os autores observaram o aumento da atividade da
enzima. Um estudo com poligalacturonase de Aspergillus niger MTC3323
indicou que Mn+2, K+, Zn+2, Fe+2 e Al+3 inibiam a atividade enquanto Mg+2 e
Cu+2 aumentavam a atividade (Kant et al., 2013).
A poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 na presença de SDS também
foi fortemente inibida apresentando apenas 14% de atividade residual. O
detergente aniônico SDS é um agente desnaturante de proteínas, logo na
presença desse composto muitas proteínas perdem completa ou parcialmente
suas funções devido á mudança de suas estruturas terciária e quaternária
(Lantz e Ciborowski, 1994).
Na presença do íon Ag+ a atividade residual da enzima foi de 54%. A
inibição de aproximadamente metade da atividade da poligalacturonase pode
ser atribuída a interações com grupos carboxil e/ou resíduos de histidina que
possam estar presentes no sítio ativo da enzima. A atividade residual da
53
poligalacturonase de C.pteridis na presença do agente quelante EDTA foi de
58%. O EDTA na concentração de 2 mM provavelmente foi capaz de atuar
diretamente na ação da enzima e/ou quelar íons importantes para a atuação da
enzima sobre o seu substrato.
Neste trabalho, a atividade da poligalacturonase foi inibida pelos íons
cálcio. Cabanne et al. (2002) indicaram que a poligalacturonase de Botrytis
cinerea perde 90% de sua atividade inicial na presença de Ca +2 . As atividades
das poligalacturonases de Penicillium solitum e de Aspergillus niger também
foram inibidas na presença desse íon (Jurick et al., 2009, Kant et al., 2013). Os
mecanismos pelos quais o cálcio reduz a taxa de hidrólise do ácido
poligalacturônico ainda não foram elucidados, porém acredita-se que este íon
dificulta a acessibilidade da poligalacturonase ao polímero interferindo no sítio
ativo da molécula.
54
6. CONCLUSÕES
- O fungo fitopatogênico Cylindrocladium pteridis LFP-59 foi capaz de secretar
uma poligalacturonase quando cultivado em meios contendo diferentes fontes
de carbono.
- A folha de eucalipto foi a fonte de carbono que mais se destacou na indução
da enzima, promovendo com 168 horas de cultivo uma atividade de
aproximadamente 42 U.mL-1.
- O protocolo de purificação desenvolvido apresentou rendimento final de
18,91% e um fator de purificação para enzima de 13,32 vezes.
- A poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 apresentou massa molecular de 68
KDa quando estimada por SDS-PAGE.
- A enzima apresentou máxima atividade em pH 4,0 e se manteve estável com
mais de 70% de sua atividade nos valores de pH compreendidos entre 3,6 e
6,0.
- A enzima apresentou máxima atividade a 60oC. A enzima foi bastante
termoestável, com meia-vida de 260 minutos a 50oC e de 66 minutos a 60oC.
- A poligalacturonase demonstrou maior afinidade pelo ácido poligalacturônico,
apresentando valor de KM menor quando comparado ao da pectina cítrica.
- Poligalacturonase de C. pteridis LPF-59 apresentou maior habilidade de
hidrólise do ácido poligalacturônico do que para a pectina cítrica e para o PDA.
55
- Os íons Hg+, Mn+2, Cu+2 e o detergente aniônico SDS inibiram fortemente a
atividade da enzima. O cálcio também influenciou negativamente a ação da
enzima.
56
7. PERSPECTIVAS
A enzima poligalacturonase de C.pteridis LPF-59 identificada e
purificada neste trabalho apresentou propriedades funcionais interessantes
para
sua
possível
aplicação
industrial
e
biotecnológica.
Dentre
as
características mais atrativas podemos destacar a máxima atividade em pH
ácido, em torno de 4,0 e razoável estabilidade térmica.
Esse comportamento ácido é bastante visado na indústria de sucos de
frutas e de fabricação de vinho. Além disso, os processos industriais deste
setor
geralmente
ocorrem
em
temperaturas
elevadas.
Assim,
outra
particularidade importante para aplicação dessas enzimas na indústria é a sua
termoestabilidade.
A
poligalacturonase
de
C.pteridis,
apresentou
termoestabilidade superior a várias outras poligalacturonases fúngicas. Sendo
assim, pretendemos testar a aplicação dessa enzima na extração e clarificação
de sucos.
57
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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