COMPARABILIDADE ENTRE O TESTE DA FALCIZAÇÃO E TESTE DA
MANCHA.
KUL, A. D. C. P. ; MELO, L. D. G. S. ; CUNHA.NETO, J. G. C.
LABORATÓRIO SABIN DE ANÁLISES CLÍNICAS - DF
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INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
A anemia falciforme é a doença hemolítica crônica, de caráter hereditário. A doença é causada por uma mutação pontual decorrente da troca
da base nitrogenada adenina (A) por timina (T) no sexto códon do gene da beta-globina da hemoglobina, gerando uma hemoglobina anormal, a
hemoglobina S, no lugar da hemoglobina A (normal). Esta mutação promove a substituição do resíduo normal de ácido glutâmico pelo
aminoácido valina na sexta posição das cadeias polipeptídicas da proteína beta-globina. Isso gera uma alteração bioquímica nas moléculas de
hemoglobina S que, quando desoxigenadas, se polimerizam no interior do eritrócito e a transformam em célula falciforme. A hemácia falciforme
tem o formato de foice e menor capacidade de fixar o oxigênio.
O fenômeno da falcização pode ser induzido por agentes que provocam uma desoxigenação química, como o metabissulfito de sódio, sendo
assim, quando uma solução de metabissulfito é adicionada ao sangue total, e esta mistura é lacrada entre lâmina e lamínula, os eritrócitos
contendo HbS se deformam. Por outro lado, o teste de solubilidade (Teste da Mancha), baseia-se no decréscimo da solubilidade da forma deoxi
HbS. A hemoglobina S é insolúvel e precipita-se em solução, tornando turva a solução contendo ditionito de sódio (SCHNEIDER,1967;
SERJEANT,1974; VERAS,1998)
Diante do exposto, o presente estudo buscou avaliar duas metodologias propostas para a identificação da doença falciforme, através de um
painel inter-observador, traçando um perfil comparativo das duas técnicas com o objetivo de validar o teste in house para adotar uma
metodologia mais rápida, eficiente, de baixo custo e com boa especificidade e sensibilidade para elucidar a presença de hemácias falciformes no
hemograma.
CASUÍSTICA E MÉTODOS
Foram selecionadas 500 amostras de pacientes que usam o Laboratório Sabin de Brasília no Estado do Distrito Federal, previamente diagnosticadas como
portadores de Anemia Falciforme pelo Teste de Falcização no período de 27/11/ 2012 a 01/02/ 2014 para detectar a prevalência da Hemoglobina S, através do
Teste da Mancha e confirmação com o teste de Eletroforese de Hemoglobina em algumas amostras.
Todas estas amostras foram submetidas ao Teste de Aglutinação ou Teste da Mancha para comparação das metodologias. Para a pesquisa da HbS de cada
paciente, foram analisados amostras de sangue total colhido com EDTA K3 como anticoagulante,utilizando-se o sistema de coleta a vácuo. As amostras
que foram utilizadas, foram colhidas no mesmo dia , sendo o teste feito diariamente.
A metodologia do teste de solubilidade baseia-se na insolubilidade da HbS quando em estado reduzido. Em soluções de alta molaridade, a HbS é desoxigenada e
forma polímeros insolúveis que impossibilitam sua absorção, sendo retido no papel filtro.
Para a realização desta técnica, foi preparado um tampão com 16,5g Fosfato de Potássio Monobásico, P.A (KH2PO4 –(anidro), 29,7g de Fosfato de Potássio
Dibásico Anidro, P.A ( K2HPO4 (anidro); 1,25g de saponina P.A. e 125 mL de H2O destilada. No momento da realização dos testes foi adicionado 0,1g de ditionito
de sódio(Na2S2O4) em 10 mL da solução tampão. Foram transferidos 200 μL da solução de trabalho em um tubo de ensaio estéril e, em seguida, foram
adicionados 5μL de sangue total.
Depois de passados cinco minutos, fez-se a dispensação de 10 μL do conteúdo de cada amostra em papel filtro e foi observada uma precipitação em forma de
botão central com halos mais claros nos bordos nos testes positivos, enquanto nos testes negativos percebeu-se uma distribuição homogênea do sangue no papel
filtro. O ditionito de sódio acidifica o meio e permite a redução da Hemoglobina S, a qual forma cristais insolúveis.
O Teste de Falcização foi realizado a partir da preparação de uma lâmina com 50μL de sangue total e 100 μL de solução de metabissulfito de sódio a 2%. Após
colocar a lamínula, suas margens foram seladas com esmalte e a lâmina foi colocada em uma placa de Petri úmida durante 24h. Este teste foi submetido a um
painel inter-observador. O Teste de Falcização foi realizado por três observadores, todos farmacêuticos e bioquímicos no mínimo com dois anos de experiência em
hematologia, que atuam no setor.
RESULTADOS E CONCLUSÃO
O teste de solubilidade (Teste da Mancha, figura 1) foi avaliado como teste de triagem para a doença falciforme. A sensibilidade da técnica
encontrada foi de: Num total de 500 pacientes foram observados que a Falcização e o Teste da Mancha apresentaram em igualdade de 100%. 477
amostras negativas e 23 amostras positivas. Dentre elas estão 195 homens e 305 mulheres, entre eles 170 eram crianças (85 meninas e 85
meninos). Foram analisadas 268 amostras incluindo os três testes – Falcização, Eletroforese de Hemoglobina e Teste da Mancha. Observou-se que
a sensibilidade de Teste da Mancha apresentou em igualdade de 100% com os outros dois testes. Dentre as 268 amostras, 103 eram homens e 165
mulheres dos quais 46 eram crianças (27 meninas e 19 meninos). Analisando então o resultado do teste, foi obtido 23 amostras positivas e 245
negativas. Das positivas 22 são pacientes heterozigotos e 1 homozigota pelo teste de Eletroforese de hemoglobina, sendo 5 crianças e 18 adultos,
demonstrando ser um teste muito confiável para a detecção dos estados homozigotos e heterozigotos da doença falciforme. É um teste fácil que não
requer experiência, tendo a possibilidade de realizar um grande número de testes de uma única vez em tempo rápido.
Fig.1
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Penteado, Flora Cristina Lobo; Leite, Amauri Antiquera - Padronizaçäo do método de solubilidade de hemoglobina S em microplaca / Solubility micromethod for hemoglobin S standardization
in microplate – LILACS 314686