41
Material e Métodos
mantida em aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve agitação, 48 µL
dessa solução foi transferido para cada tubo de amplificação, contendo 2 µL do DNA
alvo. Na Tabela 3 estão descritos os iniciadores utilizados para detecção dos genes
blacmy, blamox, blamir, blaacc, blaact, blalat, blaFox e bladha.
Tabela 3. Iniciadores utilizados para amplificação dos genes codificadores de βlactamases AmpC pela PCR multiplex (149).
Iniciadores
Seqüência (5’-3’)
MPCMY-1F
GCTGCTCAAGGAGCACAGGAT
MPCMY-1R
MPCMY-2F
Gene Alvo
blaMOX1-2, blaCMY1,
CACATTGACATAGGTGTGGTGC
blaCMY8-11, blaCMY19
TGGCCAGAACTGACAGGCAAA
blaCMY2-7, blaCMY12-16,
Tamanho do
amplicon
520
blaCMY18, blaCMY21-24,
blaCMY26-33, blaCMY36-37,
MPCMY-2R
TTTCTCCTGAACGTGGCTGGC
MPDHA-1F
AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT
blaLAT1-4
blaDHA-1-3
MPDHA-1R
CCGTACGCATACTGGCTTTGC
MPACC-F
AACAGCCTCAGCAGCCGGTTA
MPACC-R
TTCGCCGCAATCATCCCTAGC
MPMAC-F
TCGGTAAAGCCGATGTTGCGG
MPMAC-R
CTTCCACTGCGGCTGCCAGTT
MPFOX-F
AACATGGGGTATCAGGGAGATG
MPFOX-R
CAAAGCGCGTAACCGGATTGG
462
blaACC1-2
405
346
blaMIR1-4, blaACT1-3
302
blaFOX1-7
190
42
Material e Métodos
As condições de termociclagem foram: denaturação inicial a 94ºC por 3
minutos, seguida por 25 ciclos de denaturação a 94ºC por 30 segundos, anelamento
a 64ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 1 minuto. Após o último ciclo, houve
uma extensão final a 72ºC por 7 minutos. Após a amplificação do DNA, a revelação
do produto amplificado foi feita com eletroforese em gel de agarose a 2% e
visualização sob luz ultravioleta.
Foram utilizadas cepas produtoras de β-lactamases plasmidiais como
controles positivos. Entre elas: E. coli transconjugante pBL23 blaLAT-1, E. coli
transconjugante 200 blaFOX-5, E. coli transconjugante C600 R96D blaMIR-1, Morganela
morganii blaDHA-1 e Hafnia Alvei A7.307 blaAAC. As cepas de E. coli ATCC 25922 e K.
pneumoniae ATCC 700603 foram utilizadas como controles negativos.
4.4.3.2 Identificação dos genes por reação da polimerase em cadeia (PCR)
A confirmação da presença do gene blaCMY-2 pela técnica de PCR foi realizada
na amostra detectada genotipicamente pelo PCR multiplex como produtora de
pAmpC.
A amostra bacteriana foi cultivada em ágar nutriente contendo 50 µg/mL de
ampicilina. Uma suspensão de colônias da amostra foi preparada em um tubo de
microcentrífuga contendo 200 µL de água deionizada. Essa suspensão foi utilizada
diretamente para reação de PCR. Em fluxo laminar, foi preparada uma solução mãe
contendo: H2O deionizada, solução tampão com MgCl2 1,5 mM, NH4 50 mM e Tris-
43
Material e Métodos
HCl 10 mM [pH 9,0], 2 µL de desoxinucleotídeo trifosfato (0,5 µl de cada um: dATP,
dTTP, dGTP e dCTP), iniciadores e 2,5 unidades/L de Taq DNApolimerase. A
solução mãe foi mantida a aproximadamente 4°C durante seu preparo e, após leve
agitação, 45 µL foi transferido para o tubo de amplificação, contendo 5 µL da
suspensão celular. Após amplificação do DNA, a revelação do produto amplificado
foi feita por eletroforese em gel de agarose a 1% e visualização sob luz ultravioleta.
Os iniciadores e as condições de termociclagem utilizados para detecção do
gene cmy-2 estão listados na Tabela 4.
Tabela 4. Iniciadores utilizados para reações de PCR e seqüenciamento neste
estudo.
Iniciadores
Seqüência (5’-3’)
CMY-2F
TCGTTATGCTGCGCTCTG
Condições de
termociclagem
Gene Alvo
blaCMY2-7,
CMY-2Fint
CMY-2R
ACTGGCAGCCGCAATGG
GGACAGGGTTAGGATAGC
Denaturação: 94ºC –
10’
Denaturação: 94ºC – 1’
Anelamento: 52ºC - 1’
Extensão: 72ºC - 1’
35 ciclos
Extensão final: 72ºC 10’
blaCMY12-16,
blaCMY18,
blaCMY21-24,
blaCMY26-33,
blaCMY36-37,
blaLAT1-4
Referências
X91840, Y15130,
Y17716, AJ011293,
AJ011291, Y16785,
AY339625, AJ555825,
AJ555823, AJ781421,
AY743434, DQ139328,
DQ256079, DQ438952,
EF415650, AB300358,
EF622224, EF561644,
EF685371, EF685372,
EF622224, EU496815,
EU496816, EU331426,
AB280919, X78117,
X97039, Y15411,
Y15412
44
Material e Métodos
Foi utilizada a cepa E. coli transconjugante pBL23 blaLAT-1 como controle
positivo. As cepas de E. coli ATCC 25922 e K. pneumoniae ATCC 700603 foram
utilizadas como controles negativos.
4.4.3.3 Reação de seqüenciamento e interpretação dos resultados
Os produtos de PCR foram purificados a partir do gel de agarose com o kit
QIAquick Gel Extraction, conforme as instruções do fabricante (Qiagen, Hilden,
Alemanha). O DNA obtido foi quantificado utilizando o espectrofotômetro Biomate 5
UV-Visible (Termo Spectronic, Cambridge, Inglaterra) e, então, quantidades
necessárias foram submetidas à reação preparatória para o seqüenciamento com o
kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Foster City, CA). Ao
término da reação de PCR, o produto foi precipitado para a eliminação dos d-dNTPs
marcados não incorporados à reação. Após a precipitação e lavagem com etanol, o
produto foi ressuspenso em polímero TSR e colocado no aparelho ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Perkin Elmer, CA).
As seqüências de DNA obtidas e as seqüências protéicas derivadas foram
analisadas utilizando o programa Lasergene Software Package (DNASTAR,
Madison, WI) e, então, submetidas à comparação com bases de dados de
nucleotídeos disponíveis na Internet FASTA e BLAST (http://www.ebi.ac.uk/fasta33/
e http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/).
45
Material e Métodos
4.5 Análise da transferência dos genes codificadores de pAmpC
As metodologias de transformação e conjugação foram utilizadas para avaliar
a capacidade de transferência da resistência bacteriana da célula doadora para
cepas receptoras de linhagens laboratoriais. As técnicas de conjugação e
transformação foram realizadas de acordo com metodologia descrita por Sambrook
e Russel (163). Linhagens receptoras de E. coli (derivados de K12 - resistentes à
estreptomicina - e DH5α) foram utilizadas para os experimentos de conjugação e
transformação, respectivamente. A seleção dos possíveis conjugantes foi realizada
em placas de ágar nutriente contendo 4 µg/mL de cefoxitina e 500 µg/mL de
estreptomicina e a seleção dos possíveis transformantes foi realizada em placas de
ágar nutriente contendo 4 µg/mL de cefoxitina. A confirmação da transferência dos
genes foi realizada através de amplificação pela técnica da PCR.
4.6 Avaliação da localização dos genes de pAmpC
Para determinação da localização dos genes cmy-2 seria utilizado o DNA total
e o DNA plasmidial. Essa conduta seria tomada devido a diversos relatos de
pAmpCs
que
passaram
a
ser
inseridas
no
cromossomo
bacteriano
(36;48;49;107;177).
O DNA plasmidial seria extraído com o kit QIAprep Spin Midi prep para
obtenção de material genético em quantidade e qualidade necessárias, segundo as
instruções do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). Enquanto que, o DNA total da
46
Material e Métodos
amostra seria extraído com a técnica de brometo de cetiltrimetilamônio - CTAB. Após
o isolamento, o microrganismo seria cultivado em ágar nutriente e incubado a 37°C.
O crescimento bacteriano seria coletado com auxílio de alça descartável e
ressuspenso em tubo cônico (50 mL) com 9,5 mL de tampão TE. Seria adicionado
500 µL de uma solução a 10% de dodecil-sulfato de sódio (SDS) e 100 µL de
Proteinase K (20 mg/mL). A solução seria homogeneizada e após ter sido incubada
por 1 hora a 37°C, 1,8 mL de cloreto de sódio (5M) seria foi adicionado. A amostra
seria incubada por 10 minutos em temperatura ambiente e após esse período de
incubação seriam adicionados 1,5 mL de solução de CTAB/NaCl previamente
aquecida a 65°C. A amostra seria incubada por 20 minutos a 65°C. Seria adicionado
um volume igual de uma solução de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) sendo o
tubo invertido para homogeneização. A amostra seria centrifugada por 10 minutos a
7000 rpm, em temperatura ambiente. O sobrenadante obtido seria, então, transferido
para um no tubo cônico e adicionado 0.6 volume de isopropanol. A solução seria
homogeneizada lentamente até a precipitação do DNA. O DNA seria transferido com
o auxílio de uma alça descartável para um tubo de microcentrífuga e, após secagem,
o DNA seria ressuspenso em água deionizada.
Alíquotas de DNA cromossomal e DNA plasmidial da amostra avaliada seriam
submetidas à eletroforese em gel de agarose 8%. Posteriormente, o material
genético seria transferido para uma membrana de nylon (Hybond-N+, Amershan
Biosciences, Uppsala, Suécia) pela técnica de Southern blot. Essa membrana seria
submetida a uma reação de hibridização com o Kit ECL Direct Nucleic Acid Labelling
and Detection Systems segundo as especificações do fabricante (Amershan
47
Material e Métodos
Biosciences, Uppsala, Suécia). O fragmento de DNA utilizado como sonda seria
obtido por amplificação de um fragmento interno dos genes blaCMY-2 presente em
amostras controles, da qual esses genes foram descritos. Para amplificação seria
utilizado os pares de iniciadores listados na Tabela 4. A sonda seria preparada com
o kit ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems segundo as
instruções do fabricante (Amershan Biosciences, Uppsala, Suécia).
48
Resultados
5 RESULTADOS
5.1 Amostras bacterianas
As amostras bacterianas estudadas foram recuperadas do banco de
microrganismos do LEMC. Sete amostras não foram viáveis e, assim, foram
excluídas do estudo. A nova distribuição dos isolados de acordo com a espécie
bacteriana encontra-se na Tabela 5.
Tabela 5. Distribuição dos isolados de acordo com a espécie.
Microrganismo
Total de amostras
K. pneumoniae
66
Total de amostras
recuperadas
65
K. oxytoca
5
5
E. coli
46
41
P. mirabilis
19
18
Salmonella spp.
4
4
5.2 Avaliação do perfil de sensibilidade in vitro aos antimicrobianos
A sensibilidade das amostras de enterobactérias aos diversos antimicrobianos
foi avaliada pela técnica de ágar diluição. Na Tabela 6, podemos observar o perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos testados de todas as amostras estudadas, assim
como, a menor concentração de cada antimicrobiano que inibiu o crescimento de
50% e 90% das amostras (CIM50 e CIM90), respectivamente.
49
Resultados
Tabela 6. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das amostras estudadas.
CIM (µg/mL)
Agentes
Antimicrobianos
Sensibilidade
Resistência
CIM50
CIM90
(%)
(%)
Aztreonam
≤1
128
61,7
33,9
Ceftazidima
≤1
64
66,2
26,4
0,25
>32
51,9
45,9
Ceftriaxona
2
>512
54,9
39,1
Cefepima
≤1
64
57,9
39,1
Cefoxitina
4
32
80,5
12,9
Imipenem
≤0,5
≤0,5
99,2
0
Ciprofloxacino
Entre os antimicrobianos testados, o imipenem foi o agente antimicrobiano
que exibiu maior potência in vitro (CIM50 ≤0,5) e a maior taxa de sensibilidade entre
os microrganismos testados (99,2%), seguido pela cefoxitina (80,5%). Somente um
isolado de K. pneumoniae apresentou redução da sensibilidade a imipenem (CIM, 8
µg/mL). Esta amostra foi isolada de um paciente internado na UTI geral do HSP.
Esta amostra não foi caracterizada fenotipicamente como produtora de ESβL ou
pAmpC.
As taxas de sensibilidade variaram conforme as espécies estudadas (Figura
7). Somente os isolados de Salmonella spp. apresentaram 100% de sensibilidade
para todos os antimicrobianos testados.