A técnica da Eletroforese para a
análise de DNA e proteínas
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Histórico
•
1952, Markham and Smith
–
•
1955, Smithies
–
•
Géis de acrilamida com maior resolução e permitem
separar ainda moléculas grandes de DNA
1980, Schwartz and Cantor
–
•
Géis de amido funcionam bem para separar
proteínas do soro humano
1967, Loening
–
•
Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que
moléculas de diferentes estruturas têm sua
mobilidade diferenciada quando aplicadas num
papel e submetidas a um campo elétrico
Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos
enormes
É hoje impossível imaginar um laboratório de
biomol sem eletroforese acontecendo a todo
instante...
Vou ali correr
um gelzinho e
já volto
Tenho que ir senão
vou perder meu gel
Eletroforese
• Movimento de partículas dispersas
num fluído sob influência de um
campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa
– Tem tendência a se dirigir ao polo
positivo quando sujeito a um campo
elétrico
• Serve para separar moléculas por
tamanho/carga elétrica
– Proteína deve ser desnaturada com
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em
trabalhos de biologia molecular
Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Aplicação das amostras
Definição do mapa das
amostras por canaleta
Corrida do gel
• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de
íons através da solução
tampão
• Terminais positivo e
negativo
• Tempo adequado, senão o
DNA sai do gel
Coloração das moléculas
• Brometo de etídio
– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV
– Gel de agarose
• Prata
– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc
Eletroforese em campo pulsado
Grandes
fragmentos
de DNA
PCR
a reação em cadeia da polimerase
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
http://dotsub.com/view/538a719f
-927b-4192-8e95-18a92a9e95a5
Reação em cadeia
Amplificação do DNA
Síntese de DNA in vitro
• Polimerase Chain Reaction
– Reação em cadeia da Polimerase
• Amplificação in vitro de
moléculas de DNA
– In vivo X In vitro X In silico
• Procedimento análogo à replicação do DNA
– Amostra de DNA; 2 primers; DNA polimerase; Tampão; dNTP
Etapas da PCR
• Ciclos da PCR
– Separação das fitas → 96°C
– Anelamento dos primers → 60°C
– Síntese do DNA → 37°C
• Problema inicial da técnica
– Durante a etapa de quebra das
pontes de H e separação das fitas
(DNA melting) a 96°C, a enzima
polimerase era desnaturada e
precisava ser acrescentada ciclo a
ciclo...
– Não permitia automação
História da PCR
•
Químico, 1966
–
–
Doutor em bioquímica, 1972
2 anos de pós-doutorado numa industria farmacêutica
•
Deixou a academia para escrever ficção científica, foi dono de
padaria por dois anos; voltou à indústria
•
1983 → Teve a idéia de utilizar um par de primers para amplificação enquanto
voltava para a casa à noite ao lado da namorada
•
Avisou na empresa e deixou-se que ele ficasse trabalhando na PCR, demorou um
ano para padronizar a técnica
•
Perdeu a namorada logo depois, mas ganhou o Nobel de química (1993)
•
1986 → utilização da enzima polimerase de Thermus aquaticus
–
•
Permitiu finalmente a automação da técnica
Controvérsias: Surfista, já foi divorciado 3 vezes, é um dos que
acredita que o HIV não causa a AIDS, e diz ter tomado bastante LSD
na década de 60/70 e que isso o ajudou a descobrir a afamada técnica!
Taq polimerase
Kary Mullis, 1944
PCR
Sistema de reação:
DNA molde (100 ng)
Iniciadores (5 mM)
dNTPs
Tampão com MgCL2
Taq polimerase
Protocolo de amplificação:
Desnaturação: 95º C
Anelamento: 45-60º C
Extensão: 72º C
Filmes como técnica didática
• http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/
• http://www.maxanim.com/genetics/PCR/PCR.htm
• http://www.youtube.com/watch?v=_YgXcJ4n-kQ
Interlúdio explicativo
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
Bioquímica + Biomol
•
Enzimas são proteínas, portanto:
1.
São formadas por sequências de
aminoácidos
2.
Derivam de informações
dispostas por genes no DNA,
que deve ser transcrito e,
posteriormente, traduzido
3.
Podemos saber a sequência
delas, tanto de aminoácidos
quanto de nucleotídeos
>gi|188497753|ref|NM_000188.2| Homo sapiens hexokinase 1 (HK1), nuclear
gene encoding mitochondrial protein, transcript variant 1, mRNA
GAGGAGGAGCCGCCGAGCAGCCGCCGGAGGACCACGGCTCGCCAGGGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCA
CGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCAGCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAG
CTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTCTATGCCATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCA
TAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCTCCCGGGATTTTAATCCAACAGCCAC
AGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTCTGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTG
GATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAATCATGAGAAAAACCAGAATGTTCACA
TGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCAGTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGT
TGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGACAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACG
TTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTGATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAG
CGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAGCCATCAAAAAGCGAGGGGACTATGA
TGCCAACATCGTAGCTGTGGTGAATGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGGCTATGACGACCAGCAC
TGTGAAGTCGGCCTGATCATCGGCACTGGCACCAATGCTTGCTACATGGAGGAACTGAGGCACATTGATC
TGGTGGAAGGAGACGAGGGGAGGATGTGTATCAATACAGAATGGGGAGCCTTTGGAGACGATGGATCATT
AGAAGACATCCGGACAGAGTTTGACAGGGAGATAGACCGGGGATCCCTCAACCCTGGAAAACAGCTGTTT
GAGAAGATGGTCAGTGGCATGTACTTGGGAGAGCTGGTTCGACTGATCCTAGTCAAGATGGCCAAGGAGG
GCCTCTTATTTGAAGGGCGGATCACCCCGGAGCTGCTCACCCGAGGGAAGTTTAACACCAGTGATGTGTC
AGCCATCGAAAAGAATAAGGAAGGCCTCCACAATGCCAAAGAAATCCTGACCCGCCTGGGAGTGGAGCCG
TCCGATGATGACTGTGTCTCAGTCCAGCACGTTTGCACCATTGTCTCATTTCGCTCAGCCAACTTGGTGG
CTGCCACACTGGGCGCCATCTTGAACCGCCTGCGTGATAACAAGGGCACACCCAGGCTGCGGACCACGGT
TGGTGTCGACGGATCTCTTTACAAGACGCACCCACAGTATTCCCGGCGTTTCCACAAGACTCTAAGGCGC
TTGGTGCCAGACTCCGATGTGCGCTTCCTCCTCTCGGAGAGTGGCAGCGGCAAGGGGGCTGCCATGGTGA
CGGCGGTGGCCTACCGCTTGGCCGAGCAGCACCGGCAGATAGAGGAGACCCTGGCTCATTTCCACCTCAC
CAAGGACATGCTGCTGGAGGTGAAGAAGAGGATGCGGGCCGAGATGGAGCTGGGGCTGAGGAAGCAGACG
CACAACAATGCCGTGGTTAAGATGCTGCCCTCCTTCGTCCGGAGAACTCCCGACGGGACCGAGAATGGTG
ACTTCTTGGCCCTGGATCTTGGAGGAACCAATTTCCGTGTGCTGCTGGTGAAAATCCGTAGTGGGAAAAA
GAGAACGGTGGAAATGCACAACAAGATCTACGCCATTCCTATTGAAATCATGCAGGGCACTGGGGAAGAG
CTGTTTGATCACATTGTCTCCTGCATCTCTGACTTCTTGGACTACATGGGGATCAAAGGCCCCAGGATGC
CTCTGGGCTTCACGTTCTCATTTCCCTGCCAGCAGACGAGTCTGGACGCGGGAATCTTGATCACGTGGAC
AAAGGGTTTTAAGGCAACAGACTGCGTGGGCCACGATGTAGTCACCTTACTAAGGGATGCGATAAAAAGG
AGAGAGGAATTTGACCTGGACGTGGTGGCTGTGGTCAACGACACAGTGGGCACCATGATGACCTGTGCTT
ATGAGGAGCCCACCTGTGAGGTTGGACTCATTGTTGGGACCGGCAGCAATGCCTGCTACATGGAGGAGAT
GAAGAACGTGGAGATGGTGGAGGGGGACCAGGGGCAGATGTGCATCAACATGGAGTGGGGGGCCTTTGGG
GACAACGGGTGTCTGGATGATATCAGGACACACTACGACAGACTGGTGGACGAATATTCCCTAAATGCTG
GGAAACAAAGGTATGAGAAGATGATCAGTGGTATGTACCTGGGTGAAATCGTCCGCAACATCTTAATCGA
CTTCACCAAGAAGGGATTCCTCTTCCGAGGGCAGATCTCTGAGACGCTGAAGACCCGGGGCATCTTTGAG
ACCAAGTTTCTCTCTCAGATCGAGAGTGACCGATTAGCACTGCTCCAGGTCCGGGCTATCCTCCAGCAGC
TAGGTCTGAATAGCACCTGCGATGACAGTATCCTCGTCAAGACAGTGTGCGGGGTGGTGTCCAGGAGGGC
CGCACAGCTGTGTGGCGCAGGCATGGCTGCGGTTGTGGATAAGATCCGCGAGAACAGAGGACTGGACCGT
CTGAATGTGACTGTGGGAGTGGACGGGACACTCTACAAGCTTCATCCACACTTCTCCAGAATCATGCACC
AGACGGTGAAGGAACTGTCACCAAAATGTAACGTGTCCTTCCTCCTGTCTGAGGATGGCAGCGGCAAGGG
GGCCGCCCTCATCACGGCCGTGGGCGTGCGGTTACGCACAGAGGCAAGCAGCTAAGAGTCCGGGATCCCC
AGCCTACTGCCTCTCCAGCACTTCTCTCTTCAAGCGGCGACCCCCTACCCTCCCAGCGAGTTGCGCTGGG
AGACGCTGGCGCCAGGGCCTGCCGGCGCGGGGAGGAAAGCAAAATCCAACTAATGGTATATATTGTAGGG
TACAGAATAGAGCGTGTGCTGTTGATAATATCTCTCACCCGGATCCCTCCTCACTTGCCCTGCCACTTTG
CATGGTTTGATTTTGACCTGGTCCCCCACGTGTGAAGTGTAGTGGCATCCATTTCTAATGTATGCATTCA
TCCAACAGAGTTATTTATTGGCTGGAGATGGAAAATCACACCACCTGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAG
CCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACCAGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCC
CGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCTTCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTG
GCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGTCCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTG
TGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGTCCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCA
TTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAATTTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTC
GTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
>gi|188497754|ref|NP_000179.2| hexokinase 1 isoform HKI [Homo sapiens]
MIAAQLLAYYFTELKDDQVKKIDKYLYAMRLSDETLIDIMTRFRKEMKNGLSRDFNPTATVKMLPTFVRS
IPDGSEKGDFIALDLGGSSFRILRVQVNHEKNQNVHMESEVYDTPENIVHGSGSQLFDHVAECLGDFMEK
RKIKDKKLPVGFTFSFPCQQSKIDEAILITWTKRFKASGVEGADVVKLLNKAIKKRGDYDANIVAVVNDT
VGTMMTCGYDDQHCEVGLIIGTGTNACYMEELRHIDLVEGDEGRMCINTEWGAFGDDGSLEDIRTEFDRE
IDRGSLNPGKQLFEKMVSGMYLGELVRLILVKMAKEGLLFEGRITPELLTRGKFNTSDVSAIEKNKEGLH
NAKEILTRLGVEPSDDDCVSVQHVCTIVSFRSANLVAATLGAILNRLRDNKGTPRLRTTVGVDGSLYKTH
PQYSRRFHKTLRRLVPDSDVRFLLSESGSGKGAAMVTAVAYRLAEQHRQIEETLAHFHLTKDMLLEVKKR
MRAEMELGLRKQTHNNAVVKMLPSFVRRTPDGTENGDFLALDLGGTNFRVLLVKIRSGKKRTVEMHNKIY
AIPIEIMQGTGEELFDHIVSCISDFLDYMGIKGPRMPLGFTFSFPCQQTSLDAGILITWTKGFKATDCVG
HDVVTLLRDAIKRREEFDLDVVAVVNDTVGTMMTCAYEEPTCEVGLIVGTGSNACYMEEMKNVEMVEGDQ
GQMCINMEWGAFGDNGCLDDIRTHYDRLVDEYSLNAGKQRYEKMISGMYLGEIVRNILIDFTKKGFLFRG
QISETLKTRGIFETKFLSQIESDRLALLQVRAILQQLGLNSTCDDSILVKTVCGVVSRRAAQLCGAGMAA
VVDKIRENRGLDRLNVTVGVDGTLYKLHPHFSRIMHQTVKELSPKCNVSFLLSEDGSGKGAALITAVGVR
LRTEASS
917
aminoácidos
917 x 3 = 2751
3617-2751 = 866
3617 bp
3,6 kb
Sequenciamento de proteínas
•
Degradação de Edman
– Quebra-se o aminoácido N-terminal
– Identifica-se o aminoácido quebrado
– Sequenciamento de 50 a 70 aa’s
•
Espectometria de massa
– Quebra-se a proteína em diversos
pontos e verifica-se a massa dos
fragmentos
– Comparações com massas conhecidas
dos aa’s identifica a sequência dos
mesmos
•
Técnicas com limite de automação
– Não permitem produzir dados em largaescala
– Para saber-se a sequência de um
proteína, muitas vezes sequencia-se o
DNA do organismo de interesse
O Sequenciamento
de moléculas de DNA
Prof. Dr. Francisco Prosdocimi
>gi|33869444|gb|BC008730.2| Homo sapiens hexokinase 1, mRNA (cDNA clone MGC:1724
IMAGE:3163058), complete cds
GGCTGCGGAGGACCGACCGTCCCCACGCCTGCCGCCCCGCGACCCCGACCGCCAGCATGATCGCCGCGCA
GCTCCTGGCCTATTACTTCACGGAGCTGAAGGATGACCAGGTCAAAAAGATTGACAAGTATCTGTATGCC
ATGCGGCTCTCCGATGAAACTCTCATAGATATCATGACTCGCTTCAGGAAGGAGATGAAGAATGGCCTCT
CCCGGGATTTTAATCCAACAGCCACAGTCAAGATGTTGCCAACATTCGTAAGGTCCATTCCTGATGGCTC
TGAAAAGGGAGATTTCATTGCCCTGGATCTTGGTGGGTCTTCCTTTCGAATTCTGCGGGTGCAAGTGAAT
CATGAGAAAAACCAGAATGTTCACATGGAGTCCGAGGTTTATGACACCCCAGAGAACATCGTGCACGGCA
GTGGAAGCCAGCTTTTTGATCATGTTGCTGAGTGCCTGGGAGATTTCATGGAGAAAAGGAAGATCAAGGA
CAAGAAGTTACCTGTGGGATTCACGTTTTCTTTTCCTTGCCAACAATCCAAAATAGATGAGGCCATCCTG
ATCACCTGGACAAAGCGATTTAAAGCGAGCGGAGTGGAAGGAGCAGATGTGGTCAAACTGCTTAACAAAG(...)
TGACAGGCCTTCTGGGCCTCCAAAGCCCATCCTTGGGGTTCCCCCTCCCTGTGTGAAATGTATTATCACC
AGCAGACACTGCCGGGCCTCCCTCCCGGGGGCACTGCCTGAAGGCGAGTGTGGGCATAGCATTAGCTGCT
TCCTCCCCTCCTGGCACCCACTGTGGCCTGGCATCGCATCGTGGTGTGTCAATGCCACAAAATCGTGTGT
CCGTGGAACCAGTCCTAGCCGCGTGTGACAGTCTTGCATTCTGTTTGTCTCGTGGGGGGAGGTGGACAGT
CCTGCGGAAATGTGTCTTGTCTCCATTTGGATAAAAGGAACCAACCAACAAACAATGCCATCACTGGAAT
TTCCCACCGCTTTGTGAGCCGTGTCGTATGACCTAGTAAACTTTGTACCAATTCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Frederick Sanger
• Único vivo dentre os 4 indivíduos que já
venceram dois prêmios Nobel
• ~1955: publicou a primeira sequência de
aminoácidos da insulina
– Ganhou o Nobel de química em 1958
• 1964: descobriu que as proteínas de bactéria iniciavam-se com o
aminoácido formil-metionina
• 1967: desvendou a sequência do RNA ribossomal 5S
• 1975: inventou o método dideóxi para o sequenciamento do DNA
• 1977: sequencia, pela primeira vez, o genoma inteiro
de um organismo, o bacteriófago phi X 174
– 11 genes in 5386 bases sequenciadas “à mão“
– Ganha o segundo Nobel de química em 1980
O método de Sanger, 1975
Polimerização do DNA a ser sequenciado (molde)
na presença de:
DNA polimerase
primer
tampão
dNTPs (desóxinucleotídeo)
ddNTPs (didesóxinucleotídeo)
O que faria um nucleotídeo que,
ao invés da extremidade 3’OH,
tem uma extremidade 3’H?
http://www.youtube.com/watch?v=Mz4LSfecM4&feature=related (dideóxi)
Como acontece a síntese de
moléculas de DNA?
Amplificação interrompida
com didesoxinucleotídeos
Desoxinucleotídeos
dNTP
O didesóxinucleotídeo não tem a
extremidade 3’OH livre
(...)
e, portanto, não permite a
incorporação de novas bases
a 3’ quando é adicionado,
(...)
interrompendo a formação da
nova cadeia definitivamente
ddNTP
Didesoxinucleotídeos
T
C
C
T
C
T
G
T
A
G
A G T
T
C A
A
C
AC T
T
C A
G
G
G T
T
A
G
C
A C C
C A
G
T
5’
3’
G
A
ATGCTTC
|||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
T
T
C
T T
G
C
A
C A
T
A
G T
A
AC T
T
C A
G
G
G T
G
T
C C
AG
A C C
TC A G
5’
3’
G
A
ATGCTTC
|||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
C
5’
C
T
T
G
A
A GA T T
C
C CA
AC T
T
G
G T
A
G
T
G C
A
G
A C C
C A
G
T
5’
3’
G
A
ATGCTTCTG
||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
T
C
T C
C
T
AT G C T C
T
A T TT C A
T G
CA
C
G
A GC
T
G
G T
A
C A
G
T A G
A
C
C
A
GC
5’
3’
ATGCTTCTGGCAGATCT
|||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
A
T GAA
G
A
T
T
G
T
T
T
GA G C
C
T
A
T
T C A
GT G
C C
A
GC A T
C
G
C
AC
CC
5’
3’
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
CC
T T
A
T GAA
G
A
G
C
T
A
C
T
T C AA G G
GT G
T
A
G
T
CA
C G C
C C
AC
5’
3’
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
T
3’
T
5’
A
5’
3’
T
T GAA CC
T
G
A
T
G
T
T
C A
G
C
T
G G
T AA
T
C
T
C G
G
T C
GC A
C
CA
AC
ATGCTTCTGGCAGAT
|||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
5’
5’
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGAT
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3’
3’
População de
moléculas
Incorporação
aleatória do
didesóxi
Quantidade
precisa entre
didesóxi e
desóxi
5’
ATGCTTCT
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
• molde
• polimerase
• dNTPs
•ddGTPs
G
•ddATPs
A
•ddTTPs
T
•ddCTPs
C
ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
G A T C
ATGCTTCT
ATGCTTCTG
ATGCTTCTGG
ATGCTTCTGGC
ATGCTTCTGGCA
ATGCTTCTGGCAG
ATGCTTCTGGCAGA
ATGCTTCTGGCAGAT
ATGCTTCTGGCAGATC
ATGCTTCTGGCAGATCT
ATGCTTCTGGCAGATCTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT
Modelo original
Etapa 1
Amplificação
Tipo-PCr
Etapa 2
Marcação do primer
4 reações necessárias,
uma para cada base
Eletroforese separa
fragmentos de
diferentes tamanhos
Eletroforese
Leitura manual da
sequência de baixo pra
cima
Sanger e o fago Phi 174
De fato, esse tipo de
sequenciamento
manual continuou
acontecendo por
décadas...
Modelo moderno
Applied Byosystems, 1986
Marcação fluorescente do ddNTP
Leroy Hood, 1938-
1 reação necessária, todas as bases
lidas ao mesmo tempo
Eletroforese separa fragmentos de
diferentes tamanhos
Leitura da automática sequência, de
baixo pra cima, por um laser
http://www.youtube.com/watch
?v=ezAefHhvecM
Cromatograma
As máquinas necessárias
para o sequenciamento
• Primeira etapa: junta-se os
reagentes em poços de
placas e coloca-se na
máquina de PCR para a reação
de amplificação interrompida
• Diferenças com relação ao PCR
– Utilização de um só primer
– Utilização dos ddNTPs
• Uma vez prontas, as sequências de diferentes tamanhos
contendo os didesóxi amplificados devem ser enviadas
ao sequenciador de DNA mais próximo
O que faz um sequenciador de
DNA?
• Segunda etapa: realiza a eletroforese capilar
– O sequenciador executa a eletroforese em géis capilares ultra-finos
– Um sensor é responsável por emitir um laser e verificar qual o comprimento
de onda emitido pelo didesóxi
Exercício
Dê a sequência de DNA da canaleta apontada
azul = Guanina
amarelo = Timina
vermelha = Adenina
verde = Citosina
http://www.youtube.com/watch?v=dUjMf2ZezIw&fe
ature=related