GeneXpert MTB/RIF
GeneXpert MTB/RIF
• teste que utiliza a plataforma GeneXpert (Cepheid)
• permite a detecção de resistência a rifampicina (mutações no gene rpoB)
•
baseado na técnica de PCR em tempo real
Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR)
• Um das principais ferramentas de
biologia molecular
• Desenvolvida por Kary Mullis em
1983, resultando no prêmio Nobel em
Química
Importância dos oligonucleotídeos iniciadores (primers)
na síntese de DNA
Temperatura
100
Melting
94 oC
PCR
50
0
T e m p o
3’
5’
5’
3’
Temperatura
100
Melting
94 oC
PCR
50
0
T e m p o
3’
5’
94ºC
5’
3’
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
PCR
Melting
94 oC
Extensão
Anelamento
72 oC
50 oC
0
T e m p o
3’
5’
5’
5’
5’
3’
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
PCR
Melting
94 oC
Extensão
Anelamento
72 oC
50 oC
0
T e m p o
3’
5’
94ºC
5’
5’
94ºC
5’
3’
30x
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
PCR
Melting
94 oC
Extensão
Anelamento
72 oC
50 oC
0
T e m p o
3’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
3’
30x
Temperatura
100
50
0
Melting
94 oC
PCR
Melting
94 oC
Extensão
Anelamento
72 oC
50 oC
T e m p o
5’
94ºC
5’
5’
94ºC
5’
30x
Temperatura
100
50
0
Melting
94 oC
PCR
Melting
94 oC
Extensão
Anelamento
72 oC
50 oC
T e m p o
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
30x
Temperatura
100
Melting
94 oC
50
0
PCR
Melting
94 oC
Extensão
Anelamento
72 oC
50 oC
T e m p o
5’
Fragmentos de
tamanho
definido
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
30x
Mais Ciclos = Mais DNA
Número de ciclos
0 10 15 20 25 30
Amplificação
30 ciclos geram aproximadamente 109 moléculas
Permite aumentar a quantidade
de uma determinada amostra
Pode aumentar a quantidade
de um contaminante
DNA polimerase de E. coli
 Klenow (derivada da DNA Pol.I de E.coli)
anelamento
extensão
desnaturação
DESVANTAGENS: Temperatura ótima baixa e não é termoestável
Breve Histórico
• O primeiro termociclador foi desenvolvido
na Cetus Corp. – Mr Cycle
• Projetado para que a DNA polimerase
pudesse ser adicionada a cada ciclo
Yellowstone National Park
DNA Polimerase Termoestável
• 1969 – T. Brock e H. Freeze
relataram a descoberta de uma
nova espécie de bactéria –
Thermus aquaticus – sobrevive
na água a temperatura média de
75ºC
• Várias enzimas isoladas desse microorganismo
incluindo a primeira DNA polimerase termoestável
Taq DNA polimerase (1976)
Taq DNA polimerase – temperatura ótima de 72ºC e é estável até
temperaturas superiores a 94ºC
Kary Mullis
Prêmio Nobel de Química em 1993
Componentes de uma reação de PCR
1. Template (molde) (1–500 ng).
2. Primers (0.05–1.0 μM).
3. Mg2+ (0.5–5 mM).
4. dNTP (20–200 μM cada).
5. 1× PCR buffer
6. DNA polimerase (0.5–2.5 U para cada 50 μL de reação).
PCR “padrão”
Permite amplificar uma determinada seqüência de DNA
- Clonagem gênica
- Sonda (northern blot, southern blot, hibridização in situ,...)
- Seqüênciamento (identificação de amostra, análise filogenética,
confirmação de transfecção)
CURVA DE PCR
GeneXpert
(Cepheid)
GeneXpert
(Cepheid)
GeneXpert MTB/RIF
GeneXpert MTB/RIF
Avaliação dos módulos
Avaliação dos módulos
Preparação da amostra
Preparação da amostra
Cartucho GeneXpert MTB/RIF
Cartucho GeneXpert MTB/RIF
Identificação do Cartucho GeneXpert MTB/RIF
 Manual
 Automática
OPÇÕES DE UTILZAÇÃO
Cancelamento de teste(s)
Resultado – Amostra 1
Resultado – Amostra 1
Resultado – Amostra 2
Resultado – Amostra 2
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose
• Métodos bacteriológicos
-Baciloscopia -24hs
. Métodos Moleculares
- Fita Hain 3 dias ou mais
(baciloscopia positiva +)
-Cultivo – MGIT – 10 dias
- Genexpert -2hrs
- Sólido – 30 dias
- Teste de Sensibilidade
- MGIT -15 dias
- Método das Proporções 28 a 42 dias
Diagnóstico Laboratorial da Tuberculose
Vantagens e Desvantagens
-Bacteriológico
- Mais barato
(baciloscopia)
- TSA Mais demorado (MGIT)
- Outras drogas (INH, etc.)
- Bacilos vivos
- Moleculares(Genexpert)
- Mais caro
- Mais rápido Rif resit
- Só para Rif
- Bacilos Vivos e “mortos”
- Cultivar para TSA confirmatório
e outras drogas (quantidade de
escarro)
- Triagem
- Três códons relacionados a resistência a RIF
- Não detecta em amostras extra-pulmonares
- Não detecata MNT