IV Curso de Verão em Biologia Molecular e Genômica
05/02/2013
Eletroforese
de DNA
Elisa Beatriz Prestes
Arne Tiselius
Prêmio Nobel de Química – 1948
Eletroforese de DNA
A partir de 1970, após advento da eletroforese de
proteínas
Estrutura de um nucleotídeo
Qual a carga elétrica dos ácidos nucléicos?
Base
nitrogenada
Grupo
fosfato
Pentose
Em pH neutro, DNA tem carga elétrica negativa.
–
Cátodo
+
Ânodo
Eletroforese de ácidos nucléicos
Agarose
Poliacrilamida
Eletroforese de ácidos nucléicos
Agarose
Poliacrilamida
Eletroforese de ácidos nucléicos
Tipo de gel
Poliacrilamida
Moléculas
pequenas
Moléculas
médias
Moléculas
grandes
10 pb – 3 Kb
Agarose
100 pb – 60 Kb
PFGE*
50 Kb – 10 Mb
Fragmentos
de DNA
Fragmentos
de DNA
Cromossomos
Plasmídeos
*Eletroforese de Campo Pulsado (do inglês Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Eletroforese em Agarose
Agarose
Polissacarídeo composto por subunidades
de galactose
Obtida a partir do ágar
Compõe a parede celular
de algas
Gel horizontal
Eletroforese em Agarose
Tamanho dos poros na matriz é determinado
por % de agarose
Concentração do gel
(%)
Faixa de separação
(Kb)
0,3
5 – 60
0,6
1 – 20
0,7
0,8 – 10
0,9
0,5 – 7
1,2
0,4 – 6
1,5
0,2 – 3
2,0
0,1 – 2
Eletroforese em Poliacrilamida
Poliacrilamida
Acrilamida é monômero  neurotoxina
absorvida pela pele, com efeitos cumulativos
29 monômeros acrilamida: 1 Bis-acrilamida
Gel vertical
Eletroforese em Poliacrilamida
Polimerização da poliacrilamida depende de
radicais livres (persulfato – APS), estabilizados
por TEMED.
Reação rápida de polimerização.
Fatores que influenciam a migração
Tamanho do DNA
Migração de forma end-on
Fragmentos pequenos
percorrem maiores distâncias
que fragmentos grandes
Fatores que influenciam a migração
Conformação do DNA
Migração mais rápida de moléculas mais
condensadas: supercoiled > linear > circular
Observação de 3 bandas
no gel:
Fatores que influenciam a migração
Voltagem
Taxa de migração do DNA linear é
proporcional à voltagem baixa aplicada
Faixa de
separação diminui
com o aumento
da voltagem
Fatores que influenciam a migração
Direção do campo elétrico
Direção única em géis de agarose e poliacrilamida
Mas moléculas > 50-100 Kb tendem a migrar na
mesma taxa se direção do campo for igual...
Pulsed Field Gel Electrophoresis
(PFGE)
Direção do campo elétrico muda, forçando
moléculas a mudar de curso  moléculas maiores
demoram mais para serem realinhadas
Separação de
moléculas de
até 10 Mb!
Fatores que influenciam a migração
Composição de bases e temperatura
Mais importante para géis de poliacrilamida,
em agarose estes fatores influenciam pouco
Presença de corantes intercalantes
Brometo de etídio (grupo planar que se
intercala entre as bases nitrogenadas)
 reduz a mobilidade do DNA em 5%
É vantajoso realizar a coloração após a corrida!
Corantes de ácidos nucléicos
Brometo de Etídio
Agente que se intercala ao DNA  luz UV
(laranja)
Carcinogênico, mutagênico e teratogênico
Corantes de ácidos nucléicos
SYBR Green
Agente que se intercala ao DNA  luz UV
(verde)
Potencialmente carcinogênico
Aplicação em PCR em tempo real (qPCR)
Fatores que influenciam a migração
Composição do tampão
Força iônica. Resistência ~ igual ao gel
Poucos íons: DNA migra pouco ou nada
Íons demais: condutância gera muito calor (gel
derrete e DNA desnatura)
Aplicações da eletroforese
Separação de DNA por tamanho:
Análise de resultado (PCR, diagnóstico)
Purificação de fragmentos de interesse
Blotting
Obrigada!