ELETROFORESE
Técnica de separação de partículas através de
corrente elétrica
1-Identificação de substâncias
2-Homogeneidade de sistemas biológicos
3-Determinação de pontos isoelétricos
Pólo -
Pólo +
ELETROFORESE LIVRE
Arne Tiselus- Premio Nobel em 1948
Este método de solução livre, era bastante limitado
devido á perturbações:
-ondas mecânicas
-movimentos de convecção do líquido pelo
aquecimento da solução causado pela aplicação
da diferença de potencial
Perturbações fazem com que a eletroforese se
torne processo muito pouco reprodutível , com as
cargas de mesma natureza não migrando juntas,
mas sim, dispersas.
Métodos para minimizar estes
problemas:
1-MATRIZES RÍGIDAS- SUPORTES
papel de filtro, sílica gel, membranas de acetato
de celulose, gel de agarose, amido ou
poliacrilamida, entre outros.
A eletroforese que utiliza suporte é também conhecida
como eletroforese de zona:
Iniciada por König em 1937 na separação de
veneno de cobra recorrendo a papel de filtro
como meio-suporte, em 1946, Martin retomou
esta eletroforese.
.
Dependendo do suporte que utilizamos para a
eletroforese e da natureza das macromoléculas,
podemos separá-las:
1- com base na carga
2- com base em seu tamanho
Os suportes em gel apresentam grande
capacidade de separar as moléculas com base no
tamanho molar
Eletroforese em suporte de papel é muito
eficiente no que diz respeito a separação de
partículas com grande diferenças de cargas
Substâncias anfóteras indispensável manter
constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo
uso de soluções-tampão.
Os principais tipos de eletroforese são:
1- Eletroforese capilar
2- Eletroforese em gel
ELETROFORESE EM GEL
1.Separar partículas por diferença de
carga e massa
2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre
o gel
3.Isolar DNA RNA e proteínas
Eletroforese em gel de agarose
1-Gel gelitificado de agarose
2-Separa fragmentos longos de DNA
3-Corrente elétrica sobre gel
4-Partículas menores tem maior velocidade de
chegar ate o pólo positivo
Eletroforese em gel de
policrilamida
1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra
molecula
2-Recupera e purifica amostras
3-Em cubas de vidros
4-Aplicacao de corrente
O gel de policrilamida pode ser:
1-Desnaturante : com presenca de ureia,
separa e purifica fitas simples
2-Não desnaturante : separa e purifica fitas
duplas, sem presenca de ureia
ELETROFORESE CAPILAR EM
ZONA OU EM SOLUÇÂO LIVRE
1- A ELETROFORESE CAILAR DE ZONA OU SOLUÇÂO
LIVRE é o modo mais utilizado devido à simplicidade do
equipamento e maior facilidade na otimização das
condições experimentais.
2- o capilar e os reservatórios contendo os
eletrodos são cheios com um tampão (denominado
eletrólito carreador), o qual
conduz a corrente elétrica e fornece a capacidade
tamponante.
3-se introduz uma amostra contendo uma mistura iônica
no capilar como uma banda de pequena espessura
4-Quando o campo elétrico é aplicado, forças
elétricas atuam nas cargas da camada difusa.
5-os íons arrastam moléculas de água, formando
um fluxo que é direcionado para o catodo,
enquanto a parede do capilar permanecer
negativa.
Eletroforese Capilar no Seqüenciamento
Automático de DNA
1-Para decifrar o código genético humano, os cientistas do
Projeto Genoma tiveram de enfrentar a enorme tarefa de
localizar as dezenas de milhares de genes que se
encontram no DNA humano e em seguida fazer o
seqüenciamento dos cerca de 3 bilhões de pares de bases
contidas nos cromosomas
2-Com a tecnologia normalmente usada no
início dos anos 90, essa tarefa levaria bem
mais de10 anos, com o custo de alguns bilhões
de dólares. Foi o desenvolvimento da técnica
de eletroforese capilar, combinada ao uso de
radiação laser, que permitiu acelerar o
processo, uma vez que essa técnica
potencialmente é de 50 a 100 vezes mais
rápida que o método tradicional.
3-A técnica tradicional para
seqüenciamento de DNA é o método de
Sanger, desenvolvida por Frederick
Sanger, um dos ganhadores do prêmio
Nobel de Química de 1980. Esse método
utiliza enzimas especiais para sintetizar
fragmentos de DNA que terminam quando
uma determinada base (adenina, citosina,
guanina ou timina) aparece ao longo da
seqüência.
CURIOSIDADE:
Na análise STR, os examinadores devem:
1. extrair o DNA das células da amostra
quantificar o DNA
2. transformar o DNA utilizando a ténica de
PCR
3. utilizar eletroforese capilar para extrair
o DNA transformado
4-A análise via Reação em Cadeia da
Polimerase (PCR) é uma técnica mais
recente que pode transformar o DNA em
uma amostra bem menor.
5-O banco de dados CODIS do FBI utiliza
amostras que passaram pela análise STR
examinando 13 locais. A probabilidade de
duas pessoas possuírem perfis STR de
13-loci idênticos é de cerca de uma em um
bilhão.
Eletroforese Capilar em Gel
(ECG)
1- Utilizada exclusivamente para separação de
macromoléculas
2- Quando a razão carga/raio dos analitos é tão
próxima, que não é possível separá-los com o
uso da eletroforese de zona tradicional.
3- Íons menores migram mais rapidamente
enquanto que solutos maiores ficam mais tempo
retidos.
Princípio da Eletroforese
Capilar em Gel
4- Teve início com a utilização de colunas
preenchidas com géis químicos.
5- Esse método foi descartado dado o grande
número de problemas que surgiram,como:
- aparecimento de bolhas (perda de
condutividade),
- retenção de fragmentos com alto peso molecular,
- degradação do gel por hidrólise.
6- Tais problemas levaram à formulação de novos
sistemas, denominados géis físicos.
7- Géis físicos: matrizes poliméricas hidrofílicas,
dissolvidas em tampão apropriado
-eliminar o fluxo eletroosmótico através de uma
ligação covalente com os grupos da superfície
capilar
-evitar a extrusão do gel durante operação do
sistema, através da ligação covalente com o gel
8- Os géis são estruturas delicadas, sujeitas a
mudanças de morfologia pela ação da




temperatura
pH
força iônica
concentração do meio.
9- Uma das principais vantagens de realizar
separações por ECG é que o formato do capilar,
preenchido com gel possibilita a dissipação
eficiente do calor gerado pelo efeito Joule, em
razão da geometria do capilar e das
propriedades anti-convectivas do gel.
Seqüenciamento do DNA
Diferentes sistemas de revelação dos géis: a) brometo de etídio; b) nitrato de prata; c) raio –
X; d) quimiluminescência; e) coomasie blue e f) fast blue BB salt, a e ß naftil acetato.
Aplicações
1- Identificação de pessoas: em testes de
paternidade, comparando o DNA do suposto pai,
da mãe e do filho;
2- na identificação de criminosos.
3- Na Industria Farmacêutica (Vacinas, Reagentes
de diagnóstico);
4- Na Agropecuária (Animais e plantas
transgênicos).
Como é feito o exame de
paternidade?
3. Digestão do DNA
2. Extração do DNA 3. Amplificação do DNA
1. Coleta do sangue
4. Eletroforese
5a. Southern Blotting
5b. Hibridização da membrana de nylon
Figura Inclusão - Observe que um dos alelos
(banda) do filho é proveniente da mãe e o
outro alelo proveniente do suposto pai. Neste
caso, a paternidade fica comprovada.
6. Visualização
Figura Exclusão - Observe que um dos alelos
(banda) do filho é proveniente da mãe. O
outro alelo, no entanto, difere dos alelos do
suposto pai. Neste caso, ocorreu uma exclusão
de paternidade.