REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA
ISSN 1519-5228
Volume 9 - Número 1 - 1º Semestre 2009
Utilização da PCR na detecção de Mycoplasma sp. em culturas de células contínuas e
de Trypanosoma cruzi
Gabriela Stephanie Peres Cristo1, Sara Lopes dos Santos1
RESUMO
A contaminação de Mycoplasma sp. em linhagens celulares é um evento comum, podendo trazer
grandes prejuízos para as culturas de células e parasitos, interferindo nos resultados dos
experimentos. A técnica de reação da cadeia da polimerase (PCR) tem se mostrado sensível, segura,
rápida e específica na detecção deste procarioto. Neste trabalho foi utilizada a PCR para a detecção
do contaminante em 100 amostras provenientes de 3 linhagens celulares e 2 populações de
Tripanosoma cruzi.. Foi feito uma triagem das amostras e todas as culturas estavam contaminadas,
demonstrando a necessidade do monitoramento da contaminação. Estas amostras foram tratadas, e
durante o tratamento sistemático das culturas o número de amostras PCR-positivas diminuiu
gradualmente até a eliminação da contaminação. Este trabalho descreve pela primeira vez a
detecção e o monitoramento da contaminação por Mycoplasma sp. através da técnica de PCR como
parte do controle de qualidade da pesquisa com parasitos protozoários, além do monitoramento das
linhagens celulares.
Palavras-chave: Mycoplasma, cultivo celular, PCR
Use of PCR in the detection of Mycoplasma sp. in cell lines and cultures
Trypanosoma cruzi
ABSTRACT
The presence of Mycoplasma sp. in cell lines is very common but the contamination monitoring it´s
rarely used in molecular and cellular research routine. The PCR technique has proven to be
sensitive, safe, rapid and specific in the detection of Mycoplasma sp. in cell lines. The detection of
Mycoplasma sp. was performed using the PCR in 100 samples from 3 cell lines and 2 T. cruzi
populations cultures. All the cultures, including the suspensions of T. cruzi trypomastigotes forms,
were contaminated demonstrating the need to maintain a quality control of the cultivation of cell
lines with regard to the presence of Mycoplasma sp., since this is a contaminant intracellular and
potentially harmful to the cell cultures. During its systematic treatment, the cell lines and parasite
cultures were monitored by PCR. The percentage of contaminated samples gradually reduced in till
the complete elimination of the contamination.
Keywords: Mycoplasma, cell cultures, PCR
1 INTRODUÇÃO
O gênero Mycoplasma sp. pertence a
classe Mollicutes, procariotos sem parede
celular, que pode trazer grandes prejuízos para o
cultivo de linhagens celulares e parasitos. Com
a introdução de antibióticos nos meios de
cultivo de células e parasitos, minimizando o
problema das contaminações bacterianas e
fúngicas, os Mycoplasmas sp. passaram a ser os
contaminantes detectados com maior freqüência
(Hakala et al., 1963). A presença de
72
Mycoplasma sp. em linhagens celulares é um
evento comum, que tem sido registrados por
diversos autores (Miyaki et al., 1989; Hu et al,
1995; Timenetsky et al., 2006). As cepas podem
ser carreadas por humanos, suínos ou bovinos
(Hayflick, 1965; Uphoff & Drexler, 2002;
Timenetsky et al., 2006). O tecido de origem
das células, os meios de cultura comercializados
usados em seu cultivo, a tripsina, os soros de
origem bovina, o pessoal técnico que as repica
assim como o aerosol que se forma por ocasião
da tripsinização de garrafas de culturas de
células contaminadas, podem ser fontes de
contaminação por Mycoplasma sp.(Hayflick and
Chanock, 1965; Stanbridge, 1971; Kihara et al.,
1981; Kaplan et al., 1984).
Resultados de vários experimentos
provenientes de cultivo celular e parasitos
quando contaminados com Mycoplasma sp.,
devem ser avaliados com cautela, uma vez que
carecem de confiabilidade. Portanto é
importante que as culturas celulares e de
parasitos ao serem utilizadas estejam livres
deste contaminante (Miyaki et al., 1989). A
infecção por Mycoplasma sp. pode provocar
alterações metabólicas, cromossômicas e
interferência na infecção de células hospedeiras
por outros microorganismos. Como este tipo de
contaminante não altera necessariamente, a
morfologia ou a cinética de multiplicação
celular, somente testes específicos possibilitam
sua detecção (Timenetsky et al., 1992; Hu et al.,
1995; Ossewaarde et al., 1996). Atualmente é
conhecida uma grande variedade de técnicas tais
como
coloração
histoquímica,
ELISA,
imunofluorescência, ensaios bioquímicos e
Reação em cadeia da polimerase (PCR) para
detecção de contaminação por Mycoplasma sp.
(Kong et al., 2001; Uphoff & Drexler, 2002;
Sung et al., 2006; Gopalkrishna et al., 2007).
Dentre todas essas técnicas, a PCR têm se
mostrado de grande valia devido a sua alta
sensibilidade
e
especificidade
quando
comparada com as outras utilizadas (Sung et al.,
2006, Uphoff & Drexler, 2002). Portanto o
presente trabalho tem como objetivo a utilização
da PCR no diagnóstico da infecção por
Mycoplasma sp. em culturas de células e
parasitos. Além disso, descreve pela primeira
vez a utilização da PCR para detecção de
Mycoplasma sp. como parte do controle de
qualidade da
protozoários.
pesquisa
com
parasitos
2 MATERIAIS E MÉTODOS
Para a realização deste estudo foram
utilizadas 100 amostras provenientes do
Laboratório de Parasitologia Celular e
Molecular, Instituto de Pesquisa René Rachou /
FIOCRUZ, tais como culturas de células: Vero
(originária do rim de macaco Cercopithecus
aethiops), LLC-MK2 (de rim de Rhesus Macaca mulatta) e L-929 (de fibroblastos de
camundongo Mus musculus); e formas
tripomastigotas de duas populações de T. cruzi:
resistente ao benzonidazol (BZR) e sensíveis ao
benzonidazol – BZS.
As linhagens celulares foram cultivadas em
DMEM ou RPMI 1640 suplementado com SBF
(Gibco®) a 2mM, contendo sulfato de
gentamicina 50µg/mL e mantidas a 37°C em
ambiente úmido contendo 5% de CO2. Para a
cultura in vitro do T. cruzi foram utilizadas
células vero como hospedeiras, cultivadas em
DMEM suplementado como descrito (Murta &
Romanha, 1998).
A PCR adaptada para as condições do
Laboratório de Parasitologia Celular e
Molecular utilizou iniciadores para amplificar
parte do gene da unidade 16s do rRNA de
qualquer espécie do gênero Mycoplasma sp.
(Timenetsky et al., 2006). Para extração do
DNA das culturas aproximadamente 100 µL da
suspensão de células foram coletados e
aquecidos a 70ºC por 10 min. Em seguida as
amostras foram centrifugadas a 13000 rpm por 5
min à temperatura ambiente e o sobrenadante
foi mantido a -20°C. Para a reação de PCR foi
utilizado 1µL do DNA das amostras extraídas,
200 µM de cada desoxinucleotídeo trifosfatado
(dTTP, dATP, dCTP, dGTP), 10 pmol dos
iniciadores MGSO [TGC ACC ATC TGT CAC
TCT GTT AAC CTC] e GPO3 [GGG AGC
AAA CAG GAT AGA TAC CCT] (Timenetsky
et al. 2006) em solução contendo Tris-HCL 10
mM pH 8,0, KCl 50 mM e MgCl2 1,5 mM para
um volume final de 10 µL. As condições de
reação foram: desnaturação inicial a 94°C por 5
min, 35 ciclos a 94°C por 30 seg, anelamento
dos iniciadores a 55°C por 30 seg e extensão a
72°C por 30 seg, e o último passo a 72°C por 5
73
min para extensão final. O produto de PCR
esperado de 270 pb foi visualizado através de
corrida eletroforética em gel de poliacrilamida a
6%, corado pela prata. A contaminação da PCR
foi monitorada através da utilização de controles
positivos e negativos da reação.
As
amostras
que
apresentaram
contaminação por Mycoplasma sp. foram
tratadas com os antibióticos Ciprofloxacin e
Enrofloxacin.
corresponde ao tamanho da banda esperada
utilizando-se o par de iniciadores MGSO/GPO3.
Os arrastes observados no gel correspondem às
proteínas carreadas das amostras para a reação
de PCR.
MM CP
1
2
3
4
5
6
CN
270 pb
3 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Desde a sua invenção, a PCR vem sendo
utilizada em um amplo espectro de reações
analíticas e diagnósticas, incluindo a
identificação da infecção por Mycoplasma sp.
em cultivos celulares (Sung et al., 2006;
Timenetsky et al., 2006; Uphoff & Drexler,
2002; Ossewaarde el al., 1996). Esta técnica
possui como principais vantagens a alta
sensibilidade, alta especificidade, rapidez na
execução e reprodutibilidade, requisitos
necessários para um bom método de detecção
(Kuppeveld et al., 1992; Sung et al., 2006;
Timenetsky et al., 2006).
Após a adaptação da PCR foi feito uma
triagem das amostras e todas apresentaram
contaminação
por
Mycoplasma
sp.
demonstrando a necessidade do monitoramento
destas culturas. Uma vez que a presença deste
microorganismo pode alterar os resultados
obtidos em experimentos que envolvem cultivo
celular e de parasitos (Copperman & Morton,
1966; Miyazaki et al., 1990; Ossewaarde et al.,
1996).
As 100 amostras foram tratadas com os
antibióticos Ciprofloxacin e Enrofloxacin, além
do uso de boas práticas na manipulação dessas
culturas. Durante o tratamento, a percentagem
de amostras PCR-positivas gradualmente foram
reduzindo até a completa descontaminação. O
monitoramento foi realizado através da técnica
de PCR.
As células da linhagem vero só foram
utilizadas como hospedeiras na cultura in vitro
de T. cruzi somente após a confirmação da
descontaminação pela PCR.
A figura 1 é um painel representativo de
amostras de culturas de células e parasitos
positivas e negativas na PCR para Mycoplasma
sp. A presença de um fragmento de 270pb
Figura 1- gel de poliacrilamida 6% corado pela prata com
o produto da PCR para Mycoplasma das amostras
testadas: MM: marcador de tamanho molecular φx; CP:
produto da PCR de cultura de células Vero infectadas
com Mycoplasma sp., controle positivo da reação; 1 a 6:
amostras de cultura de células testadas; CN: controle
negativo da reação.
4 CONSLUSÕES
A técnica de PCR se mostrou uma
ferramenta útil no monitoramento da
contaminação do Mycoplasma sp nas culturas
de células e parasitos provenientes do
Laboratório de Parasitologia Celular e
Molecular do Instituto René Rachou. Além
disso, se mostrou eficiente no monitoramento
desta contaminação em culturas de parasitos
protozoários (primeira vez descrito a detecção e
o monitoramento por PCR da contaminação por
Mycoplasma sp. como parte do controle de
qualidade da pesquisa com parasitos
protozoários).
Enfim, faz necessário a implantação de
um programa de controle de qualidade nos
cultivos celulares e de parasitos no que se refere
à presença de Mycoplasma sp.
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