UFP
HGSA
Desafios da
Biologia Molecular
em Análises Clínicas
José Manuel Cabeda
Genefadi Farmacêutica, Lda
Universidade Fernando Pessoa
Centro Hospitalar do Porto
Áreas de Aplicação
UFP
HGSA
• Situações Congénitas
– Genéticas
• Diagnóstico
• Diagnóstico pré-natal
– Epigenéticas
• Farmacocinética
– CYP450
• Doenças adquiridas
– Microbiologia
•
•
•
•
•
•
Diagnóstico
Diagnóstico pré-natal
Resistência Fármacos
Genotipagem agente
Genotipagem hospedeiro
epidemiológico
– Oncologia
• Diagnóstico
• Prognóstico
• Follow-up
Aplicações
Identificação agentes Infecciosos
UFP
Vírus
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
HSV1/2
EBV
CMV
VZV
HHV-6
Enterovirus
HIV
HBV
HCV
HTLV-1
HPV
Poliomavirus (JCV e BKV)
•
•
•
•
•
Resistências
Meticilina
Glicopeptídeos
Rifampicina
Isoniazida
Antiretrovirais
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
Bactérias
Micobacterium
tuberculosis
Leptospira spp
Pneumonias atípicas
• Legionella
pneumophila
• Micoplasma
pneumoniae
• Chlamydia
pneumoniae
Staphylococcus spp.
Enterococcus spp.
Helicobacter pylori
Clostridium difficile
(tcdA,tcdB)
Bordetella pertussis
Borrelia burgdorferi
16S rDNA
HGSA
Aplicações
Identificação Agentes Infecciosos(II)
UFP
HGSA
Leptospiras
M.pneumoniae
HSV
B.burgdorferi
H.pylori
M.tuberculosis
C.Pneumoniae
Positivas
13%
Negativas
87%
Negativas
56%
Enterovírus
Positivas
44%
Leptospira
C.Difficile tcdA/tcdB
Bordetella pertussis
Micobactérias
Aplicações
Identificação Resistências a drogas
UFP
HGSA
Claritromicina (23S rDNA)
Estirpe
Tmelting (ºC)
BACTÉRIA
RESISTÊNCIA
MUTAÇÕES
Wild - type
61.5
Mycobacterium
tuberculosis
Rifampicina
rpoB 526(CACGAC)
531 (TCGTTG)
533 (CTGCCG)
Mut (A2142C)
58.0
Mut (A2142G)
53.0
Isoniazida
katG 315 (AGCACC)
315 (AGCAAC)
Mut (A2143G)
53.6
Claritromicina
23S rDNA
Helicobacter
pylori
Aplicações
Oncologia
UFP
• Quantificação Transcritos
–
bcr/abl
• Detecção Translocações
–
–
–
–
–
–
bcr/abl
pml/rar
aml/eto
Inv16
Bcl1/IgH
Bcl2/IgH
• Detecção Mutações oncológicas
–
–
–
BRCA1/BRCA2
P53
etc
• Resistência Drogas
–
Mutações bcr/abl
• Clonalidade
–
–
Linf. T (a/b ou g/d)
Linf. B
HGSA
Alterações genéticas associadas a
patologias onco-hematológicas
UFP
HGSA
• Translocações envolvendo os genes do TCR e
Ig
• Genes hibridos resultantes de translocções
• Delecções
• Inversões
• Mutações pontuais
• Alterações do padrão de metilação
Translocações envolvendo
os genes TCR e Ig
UFP
HGSA
Translocações envolvendo os genes do TCR e das Ig
IgH
IgK
Ig
TCR-ad
TCR-ß
Translocação
Doença
Gene afectado
t(8;14)(q24;q32)
t(11;14)(q13;q32)
t(14;18)(q32;q21)
t(14;19)(q32;q13)
t(3;14)(p27;q32)
t(5;14)(q31;q32)
t(2;8)(p12;q24)
t(2;3)(p12;q27)
t(8;22)(q24;q11)
t(3;22)(q27;q11)
t(1;14)(p32;q11)
t(10;14)(q24;q11)
t(11;14)(p14;q11)
t(11;14)(p13;q11)
t(8;14)(q24;q11)
t(1;7)(p32;q35)
t(7;9)(p34;q32)
t(7;11)(p35;p13)
t(7;9)(q34;q34.3)
t(;7)(q34;q34)
t(7;19)(q34;p13)
Burkitt
LNH-manto
LNH-foliculares
LLC-B
C-Myc
bcl-1 (CCND1/PRAD1)
bcl-2 (apoptose)
bcl-3 (ciclina?)
LLA-pre B
Burkitt
LNH-célula grande
Burkitt
IL-3 (citocina)
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T & LNH
LLA-T
LLA-T
bcl-6 (zinc-finger)
Tal-1
TCL-3 (Hox11)
Rhombotin 1
Rhombotin 2 (TCL-2)
C-Myc
Tal-2
dominio LIM
TAN-1
lck
LYL1
Genes hibridos resultantes de
translocções
Translocação
Doença
Genes afectados
t(9;22)(q34;q11) LMC;LLA adulto/LMA
abl
bcra
UFP
t(15;17)
(q22;q21) LMA-M3
PMLb RARad
t(11;17)(q35;q21) LMA-M3
PLZFc RARad
t(5;17)(q35;q21)
NPMe RARad
t(8;21)(q22;q22) LMA-M2
ETOc AML1
Inv(16)(p13;q22) LMA-M4Eo
MYHf CBFBg
t(6;9)(p23;q34) LMA,LMA-TdT+
DEK CAN
inv(3)(q21;q26) LMA-M1
EVI1c
t(3;3)(q21;q26)
t(1;9)(q23;q13) LLA-pre B
PBX1h E2A
t(12;21)(p13;q22) LLA-prec.B infantis
TEL
AML1
a
t(2;5)(p23;q35) LNH-anaplásico
ALK NPMe
t(4;11)(q21;q23) LLA-pre B
ALLc AF4i
t(1;11)(q32;q23) LAM
AF1Pe
t(6;11)(q27)(q23) LAM
AF6i
t(9;11)(p21;q23) LAM-M5,prec.B
AF9i
t(11;17)(q23;q21) LAM
AF19
t(11;19)(q23;p13) LAM,LLA-prec. B
ENLi
t(8;13)(p11;q12) sindrome mieloproliferativo ZNF198 FGFR-1
a) tirosina cinase
b) guanosina trifosfatase
c) zinc finger
d) receptor acido retinoico
e) fosfoproteina
f) gene da miosina
g) factor de transcrição
h) gene homeótico
i) transdução de sinal
HGSA
Bcr/abl
UFP
Os genes BCR e ABL normais, e as
translocações que originam as
proteínas p190 e p210 do gene quimera
BCR-ABL.
A proteína p210 é característica da
CML, sendo a p190 a proteína BCRABL encontrada na maioria dos casos
de ALL
HGSA
pml/rar
UFP
HGSA
A localização cromossómica e estrutura
normal dos genes PML e RARa, e a
translocação t(15;17)(q22;21) que origina
o gene quimera PML-RARA.
Doenças Monogénicas
UFP
•
•
•
•
•
•
•
Hemocromatose (HFE)
b-Talassémia (HBB)
a-Talassémia (HBA)
Anemia falciforme (HBB)
Doenças raras (IGM)
Paramiloidose
etc
HGSA
Doenças multifactoriais
UFP
• Trombose Venosa
– FV-leiden
– Protrombina
• Trombose Arterial
– MTHFR
– PAI-1
HGSA
Breve História
UFP
• Anos 70-80
– Métodos Hibridização
– Sequenciação
• Anos 90
– Automat. Extracção
– Boom PCR
HGSA
• Sec XXI
– Real-Time-PCR
– Pirosequenciação
– Lab-on-a-chip
Desafios e Soluções
UFP
Preparação de Ácidos Nucleicos
Rápida, sensível, automática, fluxo contínuo
HGSA
Desafios e Soluções
HGSA
Amplificação de Ácidos Nucleicos
Rápida, sensível, automática, fluxo contínuo
K.Mullis
Number PCR related publications
Prémio Nobel Química
1993
25,000
20,000
Number of publications
UFP
15,000
10,000
5,000
0
1986
1988
1990
1992
1994
1996
1998
2000
2002
2004
Year of publication
PCR (Research)
PCR (Diagnostics)
Real-Time-PCR (Research)
Real-Time-PCR (Diagnostics)
Desafios e Soluções
UFP
Amplificação e detecção simultâneas:
Real-Time
HGSA
Desafios e Soluções
UFP
Quantificação e Genotipagem:
Real-Time
HGSA
Desafios e Soluções
UFP
Sequenciação:
HGSA
Desafios e Soluções
UFP
Estudos Epidemiológicos estirpes
(Caracterização global de genomas)
HGSA
UFP
HGSA
“Novos” Desafios
Desafio #1
Near Patient testing
UFP
HGSA
Desafio # 2
Aplicação Generalista
UFP
HGSA
Desafio # 2
Aplicação Generalista
UFP
HGSA
Microchips
Desafio # 2
Aplicação Generalista
UFP
HGSA
Multiplexing
ID-Tag
Mass-Tag
In-chip PCR
Desafio # 2
Volume da amostra
UFP
HGSA
Miniaturização
Menor custo
Maior rapidez
Menor Volume
Menos Amostra utilizada
Mais testes
exequíveis
Resultado com
Menor
significado clínico
Desafio # 2
Aplicação Generalista
UFP
HGSA
Septifast
16S rDNA + Sequenciação
Agradecimentos:
UFP
•
•
•
•
•
•
•
•
José Manuel Cabeda
Ana Constança Mendes
Sandra Fernandes
Mónica Pereira
Cristina Correia
Paulo Brochado
João Rodrigues
Maria Luís Amorim
a equipa da UBM-HGSA
HGSA
Equipa sempre
renovada
UFP
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•
Alexandra Estevinho (HUC)
Anabela Silva (INSA)
André Fernandes (UCP)
Angela Santos (IPO)
Angélica Ramos (UA/IPATIMUP)
António Amorim (ICBAS)
Carla Cardoso (Bioportugal)
Carla Simões (IBMC)
Dora Bastos(UCP)
Elsa Lima (UCP)
Fernando Branca (Iberlab)
Filipa Ferreira (Est.TSS)
Francisco Dias (HGSA)
João Paulo (UCP)
Sónia Esteves(Lab. Pes. Moreira)
Patricia Trabulo (ESTS Bragança)
Luisa Boaventura (HUC)
Bruno Costa (ESTS Bragança)
Cristina (Estag. TSS)
José Miguel Oliveira (Hol.)
Margarida Monteiro (HPH)
Maria João Pinho (UM)
•
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•
Mariana Moreira(Genefadi)
Paula Carneiro (HGSA)
Paula Santos (UCP)
Pedro Mendonça (Açores)
Ruben (UCP)
Lara (UCP)
Helena Sofia Domingues (ICBAS)
Susana Moreira (ICBAS)
Susana Rocha (U.Minho)
Tânia Simões (U.Aveiro)
Vitória (UCP)
Pedro (UCP)
Bruno Roma (U.Pernambuco)
Renata Arruda (U.Pernambuco)
Maria Claudia Vicalvi (U.Pern.)
Claudia Carvalho (ICBAS)
Teresa (UMinho)
Nuno Canhoto (H.Évora)
Luisa Cavaleiro (H.Pedro Hisp.)
Carina Valente (ESTS Porto)
Fernando Alves (UFP)
Agostinho Pedro (UFP)
David Nunes (UFP)
HGSA
UFP
HGSA
Aplicações