DETERMINAÇÃO DA
ESTRUTURA
TRIDIMENSIONAL DE
PROTEÍNAS POR DIFRAÇÃO
DE RAIOS-X
Disciplina: Engenharia de Proteínas
Ma. Flávia Campos Freitas Vieira
NÍVEIS ESTRUTURAIS DAS
PROTEÍNAS
Fonte: Lehninger, 2010. 5ªed.
ESTRUTURA PROTEICA
• A conformação tridimensional (3D) depende da
sequência de aminoácidos
• A função depende da estrutura
• Cada proteína existe em um ou em pequeno número
de formas estruturalmente estáveis
• As principais forças para a estabilização de
estruturas são forças não-covalentes
ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL
• Arranjo espacial de todos os átomos de uma
proteína  conformação
• As conformações possíveis de uma proteína
incluem qualquer estado estrutural que ela
possa assumir sem a quebra das ligações
covalentes.
• Porém, poucas são as conformações nativas.
• Algumas proteínas são formadas por mais de
um complexo polipeptídico (quaternária)
DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA
TRIDIMENSIONAL PROTEICA
• O primeiro passo para o estudo sobre as
propriedades de um composto orgânico é a
determinação de suas estruturas cristalinas.
• Diversas propriedades estão intimamente
ligadas à maneira como os átomos estão
dispostos pela molécula.
MAS...O QUE SÃO CRISTAIS?
• Cristais são arranjos atômicos ou moleculares cuja
estrutura se repete numa forma periódica
tridimensional.
• Exemplo: NaCl, cuja estrutura consiste em átomos de
Sódio e Cloro dispostos de forma que um átomo de
sódio terá sempre átomos de cloro como vizinhos e
vice-versa.
SÓLIDOS CRISTALINOS
• Formas regulares e simétricas assim como a
ordenação das partículas que os formam.
COMO OBSERVAR OS CRISTAIS?
• O estudo da estrutura cristalina não é possível
através da microscopia óptica.
• Os microscópios ópticos possuem uma limitação
física, ditada pelo comprimento de onda da luz
visível.
COMO OBSERVAR OS CRISTAIS?
• Para resolver objetos tão pequenos quanto
proteínas, precisamos usar raios X, que
possuem comprimentos de onda na faixa de
0,7 a 1,5 Å (0,07 a 0,15 nm).
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
• Uma das técnicas mais conhecidas para a
determinação dos padrões de uma estrutura é
cristalografia por difração de raios-X.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
Fonte: Paula Kuser Falcão.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
• Não há lentes que reagrupem os raios X para
formar a imagem.
• Ao invés disso, o padrão de difração dos
raios X é coletado diretamente e a imagem é
reconstruída por técnicas matemáticas.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
• Raio X incide no cristal, onde parte de sua
energia é absorvida e reemitida em todas as
direções (cada átomo se torna uma fonte
secundária de raios X);
PADRÃO DE DIFRAÇÃO DOS
RAIOS X
Fonte: Paula Kuser Falcão.
PADRÃO DE DIFRAÇÃO DOS
RAIOS X
• Na Cristalografia o padrão de difração é usado para
determinar o arranjo e os espaçamentos entre os
átomos que funcionam como fendas nos cristais.
• A observação das franjas de difração (ou franjas de
interferência) permite calcular a separação entre as
fendas.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
• A quantidade de informação obtida em uma
cristalografia por raios X depende do grau de
organização estrutural da amostra.
• Informações da estrutura 3D detalhadas
precisam de cristais proteicos altamente
ordenados.
• Dificuldade em cristalizar várias proteínas.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
• O ambiente físico em um cristal não é
idêntico ao em solução ou na célula viva.
• Poucas informações são fornecidas em termos
de movimentos moleculares no interior da
proteína.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
• Comparação da estrutura de cristais com
informações estruturais de outras fontes (como
RMN).
• Estrutura de cristais podem representar a
conformação funcional da proteína.
• Utilizada para proteínas grandes demais para
análises de RMN.
CRISTALOGRAFIA DE RAIOS-X
• A difração de raios-X aplicada à
análise de cristais de
macromoléculas biológicas tem
influenciado a bioquímica
estrutural, tendo contribuído
para o conhecimento da
estrutura 3D de proteínas,
ácidos nucleicos, vírus e outras
macromoléculas.
A PARTIR DA CRISTALOGRAFIA
DE RAIOS-X, É POSSÍVEL...
• Compreender melhor os princípios básicos da
arquitetura proteica;
• Estudar em nível atômico os centros
catalíticos de enzimas;
• Compreender a especificidade das reações
que as enzimas catalisam;
• Compreender a relação existente entre
sequencia primária, estrutura e função.
ESQUEMA DA DETERMINAÇÃO DA
ESTRUTURA 3D DE PROTEÍNAS
EXEMPLO DE PROTEÍNAS
CRISTALIZADAS
Fonte: Paula Kuser Falcão.
RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR
• Análise com macromoléculas em solução.
• Pode esclarecer o lado dinâmico da estrutura
• Mudanças conformacionais;
• Dobramento proteico;
• Interação com outras moléculas.
DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA
TRIDIMENSIONAL PROTEICA
• Estruturas determinas por cristalografia de
raios-X ou por RMN são, em geral,
coincidentes.
• Essas duas técnicas são responsáveis pelo
rápido aumento da disponibilidade de
informações estruturais sobre as
macromoléculas das células vivas.
REFERÊNCIAS
• FALCÃO, P. K. Determinação da estrutura tridimensional de
proteínas utilizando difração de raios-X.
• FIGUEIREDO, M. O. R. Cristalografia e Difração de Raios-X.
• NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger, Princípios de Bioquímica.
São Paulo: Câmara Brasileira do Livro, 5ªed. 2010.
• ROMÃO. M. J. Cristalografia de Proteínas: metodologias e
aplicações em bioquímica. Boletim de Biotecnologia.
• SILVA, R. da. Cristalografia por difração de Raios-X e a Ciência
dos Materiais. Fenômenos Ondulatórios.