Suppression of gastric cancer growth by
baculovirus vector-mediated transfer of
normal epithelial cell specific-1 gene
Wei Huang, Xiang-Long Tian, Yun-Lin Wu, Jie Zhong, Li-Fen Yu,
Sheng-Ping Hu, Biao Li
World J Gastroenterol. 2008 Oct 14;14(38):5810-5.
Universidade de Brasília
Estudantes: Carolina Fumico 09/0004434
Inaê Aquino
09/0018516
Luana Lima
09/0028210
Paula Margotto 09/0011872 Brasília, 17 de janeiro de 2011
www.paulomargotto.com.br
ARTIGO INTEGRAL
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Suppression of gastric cancer growth by
baculovirus vector-mediated transfer of
normal epithelial cell specific-1 gene.
Huang W, Tian XL, Wu YL, Zhong J, Yu
LF, Hu SP, Li B.
World J Gastroenterol. 2008 Oct
14;14(38):5810-5.PMID: 18855978
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Câncer Gástrico
Câncer gástrico é a maior causa de
morte por doenças malignas (Nakamura,
1992cancer).
 Diagnostico tardio – biopsia.
 Desenvolvimento do câncer: - mucosa;
camadas seguintes ; ultrapassa as paredes
do estômago (atinge pâncreas e baço);
metástases
 Tratamento : ressecção (gastrectomia);
quimioterapia e radioterapia tem pouca
eficiência ; terapia gênica.
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Terapia gênica
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Consiste em adicionar
fatores genéticos que
possam suprir deficiências
ou até mesmo inibir a
expressão de certos genes
nas células-alvo, servindo
de tratamento para
diversas doenças.
O vetor, no caso,
baculovírus, é administrado
diretamente ao paciente,
permitindo, dessa forma,
uma interação in vivo entre
o fator genético e as
células-alvo.
Introdução
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Baculovírus - promissores na terapia
gênica, pois: entra mas não se
reproduzir
em
mamíferos,
transgenes grandes podem ser
acomodados,
altos
níveis
de
expressão de gene recombinante.
NES1 – gene supressor de tumor, é
provável que funcione como um
regulador
extracelularmente
do
crescimento celular.
GFP – proteína fluorescente verde,
permitindo a detecção da sua
expressão com microscopia de
fluorescência.
Objetivo do artigo
Estudar o efeito inibitório do
baculovírus mediado pelo gene de
células epiteliais normais específicas
(NES1) em câncer gástrico in vitro e
in vivo - terapia gênica.
Esquema
Construção do vetor recombinante
Infecção das células CG com Bac-GFP
Verificar a expressão de GFP
Infecção das células CG com Bac-NES1
Western blot
Nude mice com tumor de células CG
Bac-GFP e Bac-NES1
Estudos in vivo e imunohistoquímica
Ensaio de proliferação(in vitro)
Construção de vetores recombinantes
de baculovírus
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Método
Plasmídeo de baculovírus pFBGFPR –
Instituto de Biologia Molecular da
Universidade de Hong Kong
pCMV-NES1 – Divisão da Biologia do
Câncer do Departamento de Radioterapia,
New England Medical Center
Bac-to-Bac (Invitrogen)
Sistema Bac-to-Bac de acordo com o
manual padrão (Invitrogen).
Construção de vetores recombinantes
de baculovírus
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Resultados
Derivado do vetor baculovírus contendo o
gene de interesse NES1 com o promotor
CMV.
Propagação de Bac-NES1 e Bac-GFP em
células de inseto Spodoptera frugiperda
(Sf-9).
Cultura de linhagens de células e
incubação com o vetor
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Método
SGC-7901 foram preservadas e mantidas
em RPMI 1640 com 10% de FBS.
Sf-9 foram cultivadas a 27ºC em um
frasco de cultura contendo Sf900
II(Gibco), suplementado com 10% de
FBS.
SGC-7901 foram semeadas e depois de 1
dia a cultura foi infectada com diferentes
MOI de Bac-GFP.
Cultura foi examinada para expressão de
GFP por microscopia de fluorescência
Cultura de linhagens de células e
incubação com o vetor
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Resultados
As células transfectadas com Bac-GFP
(MOI=200) 24h após foram examinadas por
microscopia de fluorescência, mostrando que
as células SGC-7901 podem ser infectadas
com baculovírus.
Expressão de NES1 nas células
tumorais pela Bac-NES1
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A expressão de NES 1 foi comprovada com western
blot
Eletroforese em gel(separa as proteínas por
tamanho)
Transferência para membrana de nitrocelulose
membrana colocada face-a-face com o gelcorrente
elétrica então as proteínas carregadas se movem do
gel para a membrana enquanto mantém a mesma
disposição que continham no gel.
Bloqueio(ligações não específicas ) leite
Anticorpo primário (membrana incubada overnight )
Anticorpo secundário (1h)
Quimioluminescencia foi detectada e analisada
Consultem o artigo integral
Expressão de NES1 nas células
tumorais pela Bac-NES1
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Resultado
Comprovação de que o gene estava
sendo expresso nas células tumorais.
Análise de western blot, mostrando a
expressão de NES1 em celulas do tumor
Resultado: 1 proteína na banda 43 kDa
Ensaio de proliferação de SGC-7901
(in vitro)
Placas com células tumorais (SGC-7901)
Infectado
com
Infectado
com
Bac-NES1
Quantificado o
crescimento
celular por
absorbância
Tratado
com
Bac GFP
PBS
Estudos de enxerto de tumor in vivo
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Objetivo : Estudar o efeito inibitório do gene NES1
no crescimento do tumor nos nude mice
enxertados com GC
Nude mice: devido a uma modificação genética
o camundongo não tem o timo, apresentando
uma deficiência no sistema imunológico.
Estudos de enxerto de tumor in vivo
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Método: Foram usados nude mice com 5 semanas
obtidos da Shanghai Experimental Animals Centre of
Chinese Academy of Sciences
As células SGC-7901 foram injetadas
subcutanêamente no flanco dorsal de cada
camundongo
Conforme o tumor foi crescendo, ele foi cortado em
pequenos pedaços e re-implantados no flanco dorsal
de cada camundongo
Isso foi feito mais de três vezes e quando o tumor
estava palpável os camundongos foram divididos em
três grupos e foi injetado baculovírus contendo:
1. Bac-NES1
2. PBS
3. Bac-GFP
* foi aplicado diretamente no tumor durante 3 dias
Estudos de enxerto de tumor in vivo
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O peso e o volume do enxerto foi medido de
forma aleatória com um “ calliper” a cada três
dias durante 3 semanas de tratamento
Após a terapia, o camundongo foi sacrificado e o
tecido do tumor foi fixado com formol 10% para o
próximo teste
Estudos de enxerto de tumor in vivo
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Resultados
O crescimento do tumor
foi significativamente
inibido por BacNES1(42,3%)
comparando com os
outros grupos.
Foi observado diferença
significante no volume
do tumor a partir do 9˚
dia;
Os outros dois
grupos não obtiveram
diferença significativa
entre si
Expressão do GFP
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Objetivo: Verificar se baculovírus podem ser
infectados in vivo
Resultado: Só teve expressão das células com
GFP na letra A, então o enxerto com o tumor
podem ser infectados com o baculovírus
Imunohistoquímica
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Objetivo: Avaliar a expressão de NES1 em SGC-7901 xenografts
Método: Os tecidos fixados com formol foram desparafinizados,
rehidratados e lavados com PBS
Depois de incubados com 3% H2O2 por 10 minutos a temperatura
ambiente, o antigeno foi ativado
As secções foram cobertas com soro animal por 20 minutos e
incubadas com anticorpo policlonal NES1 de coelho a 4˚C durante a
noite
Então foram tratadas com EnVision kit por 30 minutos a temperatura
ambiente
As secções foram visualizadas por diaminobenzidina e contrastada
com hematoxilina
Controle negativo: anti-corpos primários TBS foram
substituidos por TBS
Os cortes foram observados no microscópio
Imunohistoquímica
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Resultados: O tumor tratado com Bac-NES1 exibiu uma
expressão de NES1
significativamente maior que os
outros tratados com Bac-GFP e PBS. Isso sugere que
redução do crescimento do tumor e tamanho deve estar
associado com o aumento da expressão do gene NES1.
Análise estatística
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Todos os experimentos foram
realizados em triplicata.
Os dados foram analisados utilizando
o sofware SPSS 10.0 (Chicago, EUA).
Conclusão
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O estudo da terapia gênica mediada por
gene NES1 no câncer gástrico, mostrouse eficiente para a inibição do
crescimento do tumor.
Maiores estudos são necessários para
avaliar reações sistêmicas, afeitos
adversos e possíveis problemas de
resposta imunológica.
Estratégia potente para tratamento de CG
Bibliografia
• http://www.ghente.org/ciencia/terapia/index.htm
• http://www.invitrogen.com.br/
• www.inca.gov.br