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PCR ASSOCIADO A HIBRIDIZAÇÃO COM SONDAS RADIOATIVAS DE DNA PARA A IDENTIFICAÇÃO DE
INFECÇÃO SUBCLINICA CAUSADA POR LEISHMANIA CHAGASI
Antero Silva Ribeiro de Andrade1, Elizabeth Castro Moreno2, Rosângela Fátima Gomes3, Octávio Fernandes4, Maria Norma de
Melo3 & Mariângela Carneiro3
1- Comissão Nacional de Energia Nuclear – Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear - CDTN/CNEN
Rua Professor Mário Werneck, s/n – Campus da UFMG
Caixa postal: 941, CEP: 30123-970
Belo Horizonte- MG - Brasil
2- Fundação Nacional de Saúde – Coordenação Regional de Minas Gerais
Departamento de Parasitologia – Universidade Federal de Minas Gerais -UFMG
Av. Antônio Carlos 6627 – Pampulha
Caixa Postal: 486 – Belo Horizonte – MG – Brasil
3- Departamento de Parasitologia – Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG
Av. Antônio Carlos 6627 – Pampulha
Caixa Postal: 486 – Belo Horizonte – MG – Brasil
4- Departamento de Medicina Tropical – Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ
Caixa Postal: 926 – CEP: 21045-900
Rio de Janeiro, Brasil
RESUMO
Sistemas de diagnóstico baseados na técnica de PCR são muito promissores devido a sua
sensibilidade. A hibridização dos produtos de PCR com sondas radioativas de DNA, capazes de
identifica-los, aumenta a especificidade e a sensibilidade da análise. O objetivo deste trabalho foi
avaliar a técnica de PCR, associada a hibridização, como ferramenta para a identificação de
indivíduos assintomáticos infectados com Leishmania (Leishmania) chagasi (espécie causadora da
leishmaniose visceral), residentes em uma área endêmica. Um grupo de 226 moradores do município
de General Carneiro (MG), foi selecionado ao acaso. Amostras de sangue foram coletadas e o DNA
dos macrófagos extraído. O PCR foi realizado utilizando iniciadores endereçados para os minicírculos de kDNA. Este protocolo produz uma reação positiva para todas as espécie de Leishmania.
A tipagem do produto amplificado foi realizada através da hibridização com mini-círculos clonados
de L. (L.) chagasi marcados com 32P. Foram identificados 111 amostras com PCR positivo, duas
entre elas com hibridização negativa, e 133 amostras com hibridização positiva, sendo 24 destas com
PCR negativo. Amostras com hibridização positiva e PCR negativo eram esperadas porque a
hibridização com sondas radioativas aumenta a sensibilidade da técnica. As amostras com PCR
positivo e hibridização negativa provavelmente são devidas a outras espécies de Leishmania.
Podemos concluir que este procedimento é uma ferramenta valiosa para estudos epidemiológicos.
Keywords: Leishmania chagasi, PCR, DNA hybridization and diagnosis
I. INTRODUÇÃO
As leishmanioses são um conjunto de síndromes
clínicas provocadas por parasitas do gênero leishmania. No
Novo Mundo a doença ocorre do sul dos Estados Unidos ao
norte da Argentina. As espécies de Leishmania podem ser
agrupadas em três complexos, Leishmania (Viannia)
braziliensis, Leishmania mexicana e Leishmania donovani.
As espécies do complexo L. braziliensis provocam lesões
cutâneas ou mucocutâneas, aquelas do complexo
L. mexicana causam lesões cutâneas e difusas, e as do
complexo L. donovani provocam a doença visceral [1].
A leishmaniose visceral conhecida também como
calazar é uma causa importante de morbidade e mortalidade
no Brasil.. O número de casos notificados de calazar tem
aumentado nos últimos anos, atingindo 4.492 casos no ano
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de 2000 [2]. Provavelmente este número é bem maior
devido aos erros de diagnóstico, classificação e
subnotificações. Além disso o número de infectados,
seguramente, é bem maior do que os casos clinicamente
aparentes. As alterações no meio ambiente natural e
movimentos migratórios de populações rurais para a
periferia das grandes cidades, têm contribuído para a sua
prevalência.
Leishmania (Leishmania) chagasi é a espécie
causadora da enfermidade na América Latina. O parasita
inicialmente se multiplica no local da derme onde foi
inoculado pelo inseto transmissor. A maioria das infecções
são assintomáticas e os parasitas são eliminados pelo
sistema imunológico. Em indivíduos em que a infecção
progride, a forma amastigota do parasita se dissemina
através do sistema reticuloendotelial. Alguns indivíduos
apresentam sintomas brandos ou desenvolvem uma forma
subclínica, podendo permanecer assintomáticos [3]. Uma
parte dos indivíduos infectados desenvolve o calazar, que é
caracterizado por febre, anorexia, perda de peso
hepatomegalia e esplenomegalia, sendo fatal em 95% dos
casos não tratados [4]. Outros podem evoluir para a cura
espontânea após uma forma subclínica prolongada.
A forma subclínica tem sido pouco estudada devido à
sintomatologia inespecífica e as dificuldades de
diagnóstico. Este tem sido um dos principais obstáculos ao
desenvolvimento de estudos epidemiológicos sobre o tema.
Estudos epidemiológicos são necessários para melhorar a
estimativa da prevalência da infecção, identificar os fatores
de risco e avaliar as estratégias de controle.
Atualmente os diagnósticos de rotina para a
leishmaniose visceral são feitos através de exame
microscópico direto, de material do paciente, através de
cultura ou testes sorológicos A visualização da forma
amastigota de Leishmania, pela coloração com Giemsa, em
material aspirado de baço, medula óssea e linfonodos, é
simples e barato, mas pouco sensível, inconveniente para o
paciente e perigoso em condições de campo [5]. Isolamento
dos parasitas através de cultura é um processo caro,
demorado, difícil, e ainda existe possibilidade de
contaminação por fungos e bactérias [6]. Os métodos
sorológicos geralmente não discriminam entre infecção
passada e presente e apresentam problemas de sensibilidade
[7]. Devido a estes problemas existe a necessidade de
desenvolvimento de métodos mais sensíveis e apropriados.
Nos últimos anos, a técnica de PCR (Polimerase
Chain Reaction) tem demostrado ser um método rápido,
sensível e específico para a detecção de uma variedade de
parasitas em diferentes tipos de amostras clínicas [8]. Uma
detecção secundária dos produtos de PCR, através da
hibridização com sondas de DNA marcadas com 32P,
oferece um grande aumento de sensibilidade, permite a
tipagem e a confirmação do resultado [9].
O objetivo deste trabalho foi utilizar a técnica de
PCR, associada a hibridização com sondas radioativas de
DNA, como uma ferramenta para estimar a infecção por
L. (L.) chagasi, em indivíduos assintomáticos. Na reação de
PCR foram utilizados iniciadores endereçados para os
minicírculos do DNA do cinetoplasto (kDNA). O kDNA é
um DNA mitocondrial presente nos protozoários da ordem
Kinetoplatida.
Apresenta
dois
componentes:
os
maxicírculos e os minicírculos. Os maxicírculos, presentes
em número de 10 a 20 cópias por célula, correspondem ao
genoma mitocondrial convencional. Os minicírculos,
representam o principal componente do kDNA e estão
presentes em grande número, aproximadamente 10000
cópias por parasita, o que os torna alvos moleculares ideais
para a reação de PCR.
II. MATERIAL E MÉTODOS
Área de estudo e seleção dos pacientes. O estudo foi
realizado no distrito de General Carneiro (com 19500
habitantes), município de Sabará, localizado a 19 Km de
Belo Horizonte, Minas Gerais. Nos últimos 10 anos foram
registrados seis casos de leishmaniose visceral e três óbitos
na região. Inquéritos sorológicos caninos realizados
rotineiramente, neste mesmo período, indicaram uma
prevalência canina em torno de 5%.
Um grupo de 226 indivíduos residentes no local
foram sorteados. Os objetivos do trabalho foram
comunicados e a participação dos voluntários condicionada
a autorização por escrito. O trabalho foi aprovado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da UFMG.
Coleta de sangue e extração de DNA. Utilizando-se tubos
à vácuo, contendo EDTA, foram colhidos 8 ml de sangue.
Estes foram utilizados para a obtenção das células
mononucleares e extração do DNA. Através de um
gradiente Ficoll-Paque a camada de célula monoclucleares
foi removida. As células foram ressuspendidas em solução
de lise (NaCl 50 mM, Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM,
triton X-100 1% [vol/vol], pH 7,4) e armazenadas a –20oC.
Para a extração do DNA foram adicionados 200 µg de
proteinase K por ml do tampão de lise e o material incubado
por 12 horas a 60oC. O DNA foi extraído pelo método de
fenol-clorofórmio: álcool isoamílico, precipitado com
etanol, ressuspendido em tampão low TE (Tris-HCl 10mM,
EDTA 1 mM, pH 7,5), e estocado a 4oC.
Reação de PCR e detecção do produto amplificado. Os
oligonucleotídeos
iniciadores
5’-GGG(G/T)AGGGGCGTTCT
(G/C)CGAA-3’
e
5’-(G/C)(G/C)(g/C)(A/C)CTAT(A/T)TTACACCAACCC-3
’ direcionados para a região conservada dos minicírculos de
kDNA foram utilizados. Um produto de 120 bp é produzido
[9]. A mistura de reação continha 100 ng de cada
oligonucleotídeo, 200 µM de cada nucleotídeo trifosfato,
2,5 U de Taq Gold Polimerase, no tampão recomendado
pelo fabricante (1,5 mM MgCl2), e 2 µl da amostra de
DNA. As condições do Hot-start PCR foram: 30 ciclos de
94oC por 30 s, 50oC por 30 s, 72oC por 30 s e um ciclo final
de extensão a 72oC por 10 min. Os produtos de PCR foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, corados
com brometo de etídio e visualizados sobre luz ultravioleta
ou em gel de poliacrilamida 8%, corado pela prata. Em
todas as reações foram utilizados controles positivos e
negativos.
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Marcação da sonda de DNA e hibridização dos produtos
de PCR. A 10 µl do produto amplificado de cada reação
(mesma quantidade aplicada no gel) foram adicionados
90 µl de água destilada e a solução foi fervida por 3 min.
Em seguida
foram adicionados 11 µl de solução
desnaturante (NaOH 4M, 25 mM EDTA, pH 8,0). Cem µl
desta solução foram transferidos para membrana de nylon
(Biodyne A Gibco BRL), utilizando um sistema bio-dot
(Hybri-dot manifold-BRL). O DNA foi fixado a membrana
utilizando-se luz ultravioleta com a exposição de 0,120
J/cm2 em câmara ultravioleta.
Foi utilizado como sonda minicírculos clonados de
L. (L.) chagasi. [9]. A sonda foi marcada com 32P [α]dCTP
através do sistema Random Primer DNA Labelling Systen
(Gibco BRL). A membrana foi pré-hibridizada por 30 min,
à 58oC, na solução de hibridização (SDS 1%, leite em pó
desnatado 0,5% e 2 x SSC [NaCl 0,3 M, citrato de sódio 0,3
mM]). Em seguida, após fervura por 3 min em banho maria,
a sonda marcada foi adicionada. A membrana foi então
incubada por 14 h nas mesmas condições, com agitação.
Após este período a membrana foi colocada em solução 2 x
SSC por 20 min, a temperatura ambiente, e lavada em
solução 0,5 x SSC (NaCl 75 mM, citrato de sódio 0,075
mM), 0,5 SDS, a 65oC por 30 min, para remoção da sonda
ligada inespecificamente. Finalmente a membrana foi seca e
exposta à autoradiografia na temperatura de –70oC,
utilizando-se cassete com placas intensificadoras.
PCR
HIBRIDIZAÇÃO
Positivo
Negativo
Total
Positivo
109
24
133
Negativo
2
91
93
Total
111
115
226
A Figura 1 mostra uma imagem típica de uma
membrana com produtos de PCR, submetida a hibridização
e revelada por autoradiografia.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cm
C-
C+
Cc
Cb
III. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Entre as 226 amostras analisadas, 111 foram PCR
positivas sendo que duas entre elas apresentaram
hibridização negativa. Um total de 133 amostras foram
positivas para a reação de hibridização, sendo que destas
24 foram PCR negativas. Estes resultados são apresentados
na tabela 1.
As análises apresentando reação de hibridização
positiva e PCR negativa (totalizando 24) eram esperadas,
tendo em vista que a hibridização com sondas marcada com
o 32P aumentam, em aproximadamente 10 vezes, a
sensibilidade de detecção [10]. As duas amostras que
apresentaram reação de PCR positiva e hibridização
negativa provavelmente são devidas a presença de outras
espécies de Leishmania, como L. (V.) braziliensis que
também é prevalente na região. Os oligonucleotídeos
utilizados amplificam a região conservada dos minicírculos
de todas as espécies de Leishmania, produzindo um
fragmento de 120 bp. Portanto, no protocolo utilizado a
reação positiva na reação de PCR indica a presença de
Leishmania, sem discriminar o complexo a que pertence. A
etapa subsequente de hibridização do produto amplificado,
com sondas especificas para cada complexo, permite a
identificação e tipagem. Como utilizamos minicírculos
clonados de L. (L.) chagasi como sonda de hibridização, L.
(V.) braziliensis não seria detectada neste procedimento,
fato que pode explicar este resultado.
TABELA 1 - Concordância Entre os Resultados Obtidos
por PCR e Hibridização
Figura 1. Autoradiograma
A membrana possui produtos amplificados de PCR
e foi hibridizada com minicírculos clonados de L. (L.)
chagasi marcados com 32P. Os resultado de 10 análises são
mostrados. As amostras 1,4,5,6,7, e 9 apresentaram
hibridização positiva. Os seguintes controles foram
utilizados: Cb – L.(V.) braziliensis, Cm – L.(L.)
amazonenis, C- - indivíduo negativo, C+ - indivíduo
positivo, Cc – L.(L.) chagasi
Podemos observar pelos controles utilizados na
figura-1 que a sonda de minicírculos de L.(L.) chagasi não
apresenta hibridização cruzada com L.(V.) braziliensis (Cb).
A sonda hibridizou com o controle de L.(L.) chagasi (Cc),
com amostra de paciente contaminado com L.(L.) chagas
(C+) e não hibridizou com a amostra controle de indíviduo
saudável, não contaminado (C-). Uma fraca hibridização
cruzada foi verificada entretanto com L. (L.) amazonensis
(Cm), espécie representante do complexo L mexicana.
Porém como na região estudada a ocorrência de espécies do
complexo L. mexicana é desprezível, a sonda pode ser
utilizada com segurança para a identificação de L.(L.)
chagasi.
Index
IV. CONCLUSÕES
Neste trabalho conseguimos
demostrar a
existência da infecção assintomática por L.(L.) chagasi no
população de General Carneiro. A prevalência de cães
infectados e a captura de Lutzomya longipalpis (inseto
transmissor) nos inquéritos realizados pela Prefeitura
Municipal, além da existência de casos humanos,
confirmam a existência de transmissão ativa na área. A
ocorrência de indivíduos clinicamente sadios e com PCR e
hibridização positivos demostram a grande sensibilidade da
técnica, capaz de detectar baixas cargas parasitárias.
Nenhum dos participantes do estudo desenvolveu a doença
após um ano de avaliação, sugerindo que a infecção foi
eliminada pelo sistema imunológico ou permaneceu em um
patamar assintomático, não detectável com o exame clínico
realizado. Com base nestes resultados podemos concluir
que a associação PCR – hibridização é sensível o suficiente
para a identificação da infecção subclínica causada por
L.(L.) chagasi, sendo uma ferramenta valiosa para estudos
epidemiólogicos.
[6] Weigle, K.A., de Dávalos, M., Heredia, P., Molineros,
R. and Saraiva, N.G., Diagnosis of Cutaneous and
Mucosal Leishmaniasis in Colombia: a Comparison of
Seven Methods. American Journal of Tropical Medicine
and Hygiene, vol. 36, p. 489-496, 1987.
[7] Kar, K., Serodiagnosis of Leishmaniasis, Critical
Reviews in Microbiology, vol. 21 (2), p-123-152.1995
[8] Smits, H.L. & Hartskeerl, R.A., PCR Amplifications
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Methods, vol. 23, p-41-54, 1995.
[9] Degrave, W., Fernandes, O., Campbell, D., Bozza, M.
and Lopes, U., Use of Molecular Probes and PCR for
Detection and Typing of Leishmania – a Mini-review.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, vol. 89 (3), p-463469, 1994.
AGRADECIMENTOS
[10] Fernandes, O., Bozza, M., Pascale, J.M., de Miranda,
A.B., Lopes U.G. Degrave, W.M. An Oligonucleotide
Probe Derived from kDNA Minirepeats is Specific for
Leishmania (Viannia). Memórias do Instituto Oswaldo
Cruz, vol. 91, p-279-284, 1996.
Este trabalho contou com financiamento dos
seguintes órgãos: FAPEMIG, AIEA, CENEPI-MS e CNPq
ABSTRACT
REFERÊNCIAS
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World: Current Concepts and Implications for Future
Research. Clinic Microbiology Review., vol. 6, p. 230-250,
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Endêmicas no Brasil. Http://www.funasa.gov.br.guia_epi,
2001.
[3] Badaró, R.; Jones, T. C., Carvalho, E. M.; Sampaio, D.,
Reed, S.G.; Barral, A., Teixeira, R. and Johnson, W.D.,
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p. 1003-1011, 1986b.
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de Jesus,
American
Journal of
t, Reis, M.F.F.E., de Alencar, J.E.; Naidu, T.G.,
J. A., Mc Auliffe, J.F. and Pearson, R.D.,
Visceral Leishmaniais (Kala-azar). Western
Medicine, vol. 142, p. 777-781, 1985
[5] Zijlstra, E.E., Siddig, A.M., El-Hassan, L.A., El-Toum,
M., Satti, H.W., Ghalib, H.W. and Kager, P.A., Kala-azar:
a Comparative Study of Parasitological Methods and
the Direct Agglutination Test in Diagnosis. Transactions
of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene,
vol. 86, p.505-507, 1992
Detection systems for diagnosis of leishmaniasis
based on PCR are very promising due to their sensitivity
and specificity. Secondary detection by specific radioactive
DNA probes, able to type the PCR amplified products,
increase the specificity and raise the sensitivity of the assay.
The aim of this work was evaluate PCR and hybridization
as a tool to identify Leishmania (Leishmania) chagasi (the
specie that cause the visceral leishmaniasis in Brazil)
infection in asymptomatic persons living in a endemic area.
A group of 226 individuals, living in General Carneiro
(MG), was selected. Blood samples were harvested and the
DNA extracted from the mononucleate cells. PCR was
performed using primers addressed to the kinetoplast DNA
minicircles. This protocol gives a positive reaction for all
Leishmania species. The amplified products were further
hybridized with cloned L. chagasi minicircles labeled with
32
P. Were identified 111 samples PCR positive, 2 of them
hybridization negative and 133 samples hybridization
positive, 24 of them PCR negative. The occurrence of
samples with hybridization positive and PCR negative was
expected since hybridization, with DNA probes, labeled
with 32P, increase the sensitivity of the assay. The samples
that presented positive PCR and negative hybridization
were probably due the presence of other Leishmania
species. We conclude that this procedure is a valuable tool
to access subclinical L. (L.) chagasi infections in
epidemiological studies.