SISTEMAS MICELARES DE
DUAS FASES AQUOSAS
TENSOATIVOS E MICELAS
Moléculas anfifílicas:
grupo liofóbico grupo liofílico
cauda
apolar
cabeça
polar
 IÔNICOS:
Catiônicos 
brometo de dodeciltrimetilamônio
CH3
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-N-CH3+ BrCH3
Aniônicos 
dodecil sulfato de sódio
CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-OSO3- Na+
TENSOATIVOS E MICELAS
 NÃO-IÔNICOS:
CH3-(CH2)9-OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OCH2CH2 -OH
óxido de n-deciltetraetileno (C10E4)
 ZWITERIÔNICOS:
CH3-(CH2)6-COOCH
CH3-(CH2)6-COOCH
CH-CH2-PO4--(CH2)2-N(CH3)3+
dioctanoil fosfatidil colina (C8-lecitina)
QUANTO À CAUDA:
 Saturada/insaturada
 halogenadas (fluorcarbonetos)
 Cadeias duplas
 cadeia de polióxido de propileno
 Cadeia ramificada
Lisina (zweterion)
SURFACTANT = Surface Active Agent
Líquidos  contração da superfície (< energia livre)
força de atração para dentro exercida pelas moléculas presentes na
solução sobre as moléculas na superfície
TENSÃO SUPERFICIAL - g (mN/m)
Moléculas anfifílicas – procuram
orientar-se na superfície (< energia livre)
Interação H2O-Tens. < interação H2O-H2O
tensão superficial
MICELAS = agregados de tensoativos
Micelização = mecanismo alternativo à adsorção
na superfície/interface para a remoção do grupo
hidrofóbico do contato com a água.
Formação de micelas  balanço complexo de forças intermoleculares:
eletrostáticas
van der Waals
ligações de hidrogênio
hidrofóbicas
estéricas
Razão principal para a formação de micelas = obtenção de estado
mínimo de energia livre
pressão osmótica
detergência
condutividade
tensão superficial
CMC
As micelas são
colóides de
associação
Concentração
de tensoativo
Tempo de reação: milissegundos a minutos
Dinâmicas, reversíveis, distribuição
estatística de tamanhos (polidispersão)
TIPOS DE AGREGADOS FORMADOS
(MICELAS)
micela
esférica
bicamada
micela
cilíndrica
vesícula
(lipossoma)
- turvação  “cloud point” - “ponto de névoa”
- aumento da temperatura  redução na
solubilidade da micela
temperatura
SEPARAÇÃO DE FASES
Fase rica
em micelas
Fase pobre
em micelas
“Solução” micelar
homogênea
Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar
de Duas Fases Aquosas
PROCESSO DE SEPARAÇÃO DE FASES
>> TºC
Fase
Pobre
em
micelas
tempo
Fase
Rica em
micelas
Sistema Monofásico
Sistema Bifásico
SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS
CURVA BINODAL (C10E4)
T (oC)
Temperatura
Região Bifásica
Linha de amarração
“Tie-Line”
V´
V’cT
V´
V’dB
Ponto Crítico
T´
CdB
C
Ci
Cc e Vc
Cd e Vd
Região Monofásica
(ou vice-versa)
CCcT
Concentração
de tensoativo
Extração Líquido-Líquido em Sistema Micelar de Duas Fases
Aquosas - SMDFA
DIAGRAMA DE FASES
Yagui, C. O. R., Pessoa A., Blankschtein, d. Two- phase aqueous micellar systems - an alternative method
for protein purification. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 21(4):531- 544, 2004
Influência de alguns sais sobre o ponto crítico
T (oC)
C10E4 + 0,1 M KI
C10E4
23,6
0
C10E4 + 0,5 M NaCl
19,0
0
13,0
5
4,75
C10E4 + 0,5 M
Li2SO4
SMDFA – aplicações:
 Purificar e concentrar compostos como: BSA, bacteriófagos, antibióticos,
colesterol oxidase, lisozima e outras enzimas, vitaminas lipossolúveis e
compostos orgânicos.
 Separar contaminantes com características hidrofóbicas presentes em
soluções biológicas.
 Primeiro trabalho - BORDIER (1981) - agente tensoativo não-iônico Triton X114 - proteínas hidrofílicas X proteínas hidrofóbicas.
 Pode ser aplicado a sistemas envolvendo células intactas.
 Alternativa na purificação de proteínas de plantas - compostos presentes
em plantas que interferem nas técnicas convencionais de extração, como
fenóis e clorofila, podem ser facilmente removidos por SMDFA.
 Pode separar: íons metálicos, estriol, progesterona, -estradiol, estrona,
clorofila, bacteriófagos, células, fenóis e outras moléculas orgânicas de
baixa massa molar.
SISTEMA MICELAR DE DUAS FASES AQUOSAS
(SMDFA) APLICADO À PURIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS
 Ambiente ameno para materiais biológicos;
 Método seguro, não utiliza compostos inflamáveis ou explosivos;
 Fácil ampliação de escala;
 Baixo custo (em princípio requer somente um tensoativo e em
baixas concentrações);
 Gera resíduos de fácil manuseio (baixa toxicidade, fácil
acondicionamento, etc.);
 Micelas fornecem ambientes hidrofílicos e hidrofóbicos;
 Controle e otimização da partição através do ajuste das
características micelares (tamanho e forma);
 Fácil separação do material desejado das moléculas de
tensoativo após a purificação;
 A seletividade da partição pode ser melhorada com a utilização
de micelas contendo ligantes de afinidade ou misturas de
tensoativos;
 Técnica não interfere em metodologias como cromatografia
líquida, eletroforese, ELISA, etc.
SISTEMA MICELAR NÃO-IÔNICO DE DUAS FASES
AQUOSAS PARA PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
Altos valores de Kp
proteína
hidrofílica
proteína
hidrofóbica
 BORDIER (1981)  apresentou a possibilidade de separação de
proteínas em SMDFA – tensoativo Triton X-114.
 Purificação de proteínas hidrofóbicas: colesterol oxidase, lipase,
proteínas de membrana.
PARTIÇÃO DA ENZIMA GLICOSE-6-FOSFATO
DESIDROGENASE (G6PD) EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO
EXPERIMENTO
1
[C10E4]
(% p/p)
2,50
T
(oC)
19,5
R
(Vt/Vb)
0,76
0,53  0,04
BMG6PD
(%)
97  9
2
3,60
20,0
1,00
0,36  0,00
104  4
3
3,25
20,4
0,60
0,33  0,01
108  7
4
3,00
21,5
0,35
0,20  0,04
101  6
5
5,00
22,0
0,60
0,10  0,01
101  2
KG6PD
SISTEMA MICELAR MISTO (NÃO-IÔNICO/IÔNICO)
DE DUAS FASES AQUOSAS
- G6PD negativamente carregada
- C10E4
+
- CnTAB (n = 8, 10,ou
or 12) – carga positiva
 Micelas mistas são formadas in situ, sem necessidade de síntese como os
polímeros + eletrólitos
 Condições da solução (pH, FI) podem ser variadas
melhorar a partição alterando as
interações eletrostáticas e de
volume de exclusão
Reverter as interações e separar as
proteínas das micelas
TENSOATIVOS CATIÔNICOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA
100
Recuperação
Recovery G6PD (%)
80
60
C8TAB
C10TAB
40
C12TAB
20
0
0
100
200
300
400
Tempo
Time (min)
2.5 mM CnTAB + 0.068 mg/mL G6PD
TENSOATIVOS X DESNATURAÇÃO PROTÉICA
 Tensoativos não-iônicos – apresentam apenas interações hidrofóbicas
não-específicas em concentrações ~ CMC (exceção: BSA e Tritons)
 Tensoativos iônicos:
1- interações eletrostáticas com resíduos de aminoácidos de carga oposta
na superfície da proteína (ligação sítio-específica)
2- interações hidrofóbicas das caudas apolares com o interior apolar da
proteína (ligação cooperativa, não-específica).
 maior a tendência a formar micelas - maior a afinidade pelas proteínas
 em geral, tensoativos aniônicos interagem mais fortemente que os
catiônicos
cadeias laterais da arginina e lisina (ligação com aniônico) são mais
“projetadas” que as do ác. glutâmico e aspartato (ligação com catiônicos)
PURIFICAÇÃO DE G6PD EM HOMOGENEIZADO DE S. Cerevisiae
FONTE DE G6PD
PROCESSO UTILIZADO
KG6PD
YG6PD (%)
Enzima pura
sistema C10E4/C10TAB/tampão
7,7
71
Homogeneizado
de S.cerevisiae
sistema C10E4/C10TAB/tampão
1,91
48
purificação em dois estágios:
I - C10E4/tampão
II -C10E4/C10TAB/tampão
I – 0,35
II – 3,82
59
Homogeneizado
de S.cerevisiae
coleta da
fase Inferior
separação
de fases
SISTEMA I
C10E4/Tampão
separação
de fases
SISTEMA II
C10E4/C10TAB/Tampão
EXTRAÇÃO DA PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE
GFPuv
UTILIZANDO LIGANTE DE AFINIDADE
GFP
+
CBM9
liga à celulose, di- e monossacarídeos
GFP
Surfactant - C10G1
(Decyl -D-glucopyranoside)
CBM9
C10G1
Micela +
ligante + GFP
29oC, após 6h
Fase Pobre
em Micelas
Fase Rica
em Micelas
(GFPuv)
C10G1 (5%) Lisado Celular + CBM9-GFP Tampão pH 7,2
UTILIZAÇÃO DE INIBIDORES ENZIMÁTICOS COMO
LIGANTES DE AFINIDADE
Procion red
Cibacron blue
Inibidores de G6PD - Mimetizam a coenzima NAD(P)+
H
O
NH2
+
N
O
-
O
P
O P
NH2
O H
O
-
O
CH2
H
OH
OH
O
O
N
N
O
CH2
H H
OH
N
N
H
H
OR
NADP+
PARTIÇÃO DOS LIGANTES CIBACRON BLUE E
PROCION RED EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO
35
Kligante
30
25
20
15
10
5
0
Procion red
Cibacron blue
PARTIÇÃO DA G6PD EM SISTEMA C10E4/TAMPÃO
CONTENDO CIBACRON BLUE E PROCION RED
KG6PD
0,40
0,30
0,20
sem ligante
Interações de afinidade não são
suficientemente
fortes
para
influenciar significantemente o
perfil de partição da G6PD.
cibacron blue
procion red
Ocorrência de interação do
ligante
com
as
micelas,
diminuindo a probabilidade de
formação de complexo enzima
inibidor.
4-(C8H17)-C6H4-(OCH2CH2)n-OH,n~8
porção
hidrofílica
porção
hidrofóbica
Estrutura da Endotoxina:
LipoPoliSsacarídeo (LPS)
TRITON X-114
polioxietileno p-t-octil fenol
Remoção de Endotoxina (pirogênio) por Extração Líquido-Líquido
Comportamento da GFPuv ( ) e do LPS ( )
na Extração em SMDFA Utilizando Triton X-114 (
)
Tubo
visto a
olho nu
Tubo em
câmara de
luz UV