UM MODEL0 ESTATfSTICO
PARA << QUENCHING >> IONIC0
EM SOLUCaES MICELARES
Par
MARIA FRANCISCA S. WHEELEX *
e
FREDERICK P. WHEXLER
Universidade dos &ores
Quando se solubiliza pireno no centro de micelas de SDS
o tempo de vida da sua fluorescBncia 6 altamente dependente
da mobilidade dos i6es de equencher, que se encontrem na
soluc?io. V6-se, neste trabalho, que a l i n e mobilidade dos
i5es de equencher >> diminui desde que se reduza a disancia
entre as micelas. Este facto leva a que o decaimento da
fluoresc6ncia se apresente como urna sobreposi~iiode exponenciais. Propge-se um modelo estatistico para explicar o process
de <quenching> em causa. As curvas observadas para o
decairnento da flumesc6ncia est5o em concordhcia com o
modelo apresentado.
* A parte experimental deste trabalho foi realizada na Victoria
University of Manchester -England.
MARIA FRANCISCA
S.
WHEEILER e FREDERICK P. WHEELER
ABSTRACT
When pyrene is so1uk:lized within W 6 micelles the lifetime
of its fluorescent state is very dependent upon the mobility
of the ion <quenchers~added to the solution. It is shown that
the free motion of quencher ions is impeded when micellar
surfaces are relatively close. This, in turn, leads to a fhorescence decay which exhibits multiple rate-constants. A statistical
model is presented to explain the quenching process involved
in the experiment. The observed decay traces support this model.
A semelhanea entre as propriedades de bioagregados e de
micelas leva a que nos dtimos anos se tenha dado grande
interesse a estudos das diferentes propriedades das micelas
CWNEELEX, 1976). Micelas s l o agregados multimoleculares
formados por molkculas anfifilicas em soluci4o aquosa. A fluorescencia das molCculas usadas como sonda e solubilizadas no
centro das micelas, d8-nos a informacZio acerca do seu pr6prio microambiente. a40 dissolver-se um sal em tal soluc5o
micelar, alguns dos ices, a quenchers 2, tern o efeito de reduzir,
<c quenching 2, a fluorescencia das mol6culas sonda que se
encontram excitadas.
Apresenta-se neste trabalho, feito corn concentrac6es de
micelas relativarnente altas e e. quenchers a eficientes, fluorescgncia com mtiltiplos decaimentos exponenciais. Atribuimos
este fen6meno As variac6es locais da concentracbo dos ices
aquencher 2 e propornos urn modelo estatistico que explica
as observacbes.
TJM MODEL0 ESTATfSTICO PARA aQUENCHING, IdNICO
Micelas s l o agregados formados aquando da dissolucio
de moleculas anfifilicas em ggua. As molkculas anfifilicas contern uma parte hidrof6bica (uma cadeia longa de hidrocarbonetos) e uma parte hidrofilica (um grupo polar) como se vC
na Figura l(a). Estas mol6culas quando dissolvidas em iigua
formam agregados de modo a proteger as cadeias de hidrocarbonetos do contact0 direct0 com a irgua, ficando entlo
apenas as cabecas imersas na soluglo aquosa (Figura l(b)).
cadeia de
4
hidrocarbonetos
FIGURA 1 -Representap50 esquern5tica de :
a) urn mon6mero
b) uma micela esfbrica
Aumentando a concentraclo das mol&ulas na irgua, para
um determinado valor da concentraclo verifica-se uma descontinuidade drirstica nas propriedades fisicas da solu~io.Este
valor da concentraclo, chamado cmc (critical micelle concentration), varia com o n h e r o de Atornos de carbono, N, na
cadeia de hidrocarbonetos da seguinte maneira :
cmc = exp(
- pN)
MARIA FRANCISCA
S.
WHEELER e FREDERICK P. WHEELER
onde (Y. e sZio constantes. No caso particular desk trabaIho
em que as micelas sZio de Sulfato Duodecil de Sbdio (SDS) o
valor de N 6 12 e cmc 6 7,5 x 103M. Or n h e r o de monbmeros numa micela de SlDS em kgua 6 62.
0 facto de se formarem agregados revela-nos a presenca
de duas f o r ~ a s ,uma de atraccZio exercida pelas cadeias de
hidrocarbonetos e que aproxima as molt5culas, e a outra, uma
f o r ~ arepulsiva, exercida pelas cabecas polares. Esta idtima
f o r ~ a6 responsdvel pelo nizmero limitado de molkculas em
cada micela.
A aparhcia de diferentes micelas B discutivel mas an6lises
de raio-X revelam que micelas de SIX apresentam-se aproximadamente esfkricas desde que a concentra@io nZio exceda 1 M
( 8 U L 1 3 ( ~ C K I et
, al., 1970). A concentracZio do detergente usado neste trabalho foi de 0,l M, 0 que nos permitiu
ter uma ideia precisa da forma dos agregados presentes nas
experigncias. As micelas nZio sHo entidades rigidas com uma
estrutura permanente, antes pel0 contrhio, comportam-se como
gotas liquidas. A evidgncia para este facto vem da possibilidade que as micelas t&m de dissolver no seu centro hidrocarbonetos e outros sistemas hidrofbbicos.
3. A 'ISXXICA DAS SONDAS FLUORESCENTES
A metodologia das sondas fluorescentes consiste em difundir atravhs da membrana uma molCcula orgbica que fluoresca (AZZI, 1975). As propriedades fluorescentes da sonda
tem que ser previamente bem conhecidas e devem ser sensiveis ao ambiente. 2 tambCm necesskrio assegurar que sb as
mol6culas usadas como sonda, isto 4, s6 as que se encontram
no interior das micelas vHo afectar significativarnente o sinal
de fluorlesc6ncia (WAGGONER & STRYER,1970). A introducZio
de mol4culas (sondas) dentro das micelas poderia alterar
UM MODEL0 ESTATfSTICO PARA aQUENCHING% IdNICO
a estrutura das micelas. No entanto, resultados de raio-X
mostram que para baixas concentra~ijes,a entrada da sonda
na estrutura da micela, nHo perturba a arquitectura da mesma
(LE=m
et al., 1971).
Este tip0 de molbcula-sonda 6 apropriadamente usado no
estudo de diferentes aspectos d i n f i c o s do comportamento
micelar (MDGERS & WHEELER, 1976). A sonda psada neste
trabalho foi a molkcula de pireno.
0 meio micelar foi obtido por 0,l *Mde SIX dissolvido em
Agua destilada. Esta concentra~go C muito superior a cmc
(7,5 x lo3 M) e assumindo o ntimero de agregacHo 62, a concentraciio de micelas era entiio de 1,6 x lo3 M.
Juntou-se A solu~2iouma concentra~50de 2,5 x lo5 M de
pireno. Esta concentra@o de pireno era suficientemente baixa
de mod0 a irnpedir a forma~Hode excimeres. As propriedades
do pireno sHo tais que asseguram que a fluoresc6ncia venha de
mol6culas localizadas no interior das micelas.
Todas as observa~ijesforam feitas em solur$es frescas,
desgazificadas e B temperatura ambiente. Usou-se como fonte
de excitacHo um laser de nitroghio de 1h'IW de pot6ncia.
A luz emitida pelo laser, em impulsos de 2 x lV9s, tinha um
comprimento de onda de 337 x -9m. A fluoresc8ncia emitida
foi observada perpendicularmente A luz estimulante e com uso
de um sistema de detec~iiocom tempo de subida de 2 x
s.
Todo este sistema estsi detalhadamente descrito em WHEELER
(1976).
MARIA FRANCISCA S. WHEELER e FRBDERICK P. WKEELER
5. << QUENCHING >> DA FLUORESC&NCIA DO PIRENO
POR DIMETILVIOLOG&NIO
Viologhio 6 o composto herbicida que correntemente se
conhece como <Paraquat w e o dimetilviologhio 6 um iiio orgC
nico de carga dupla e positiva com a seguinte f6rmula :
+
4-
(CH, - N 0
N -0
CH,) ZlEste foi o cquencher >> usado numa solugiio de 2,5 x
M
de pireno solubilizado em 0,l M de SDS em solugiio aquosa.
0 tempo de vida do pireno excitado na ausiincia de cquenc h e r ~ ,foi visto ser de 390 ns. Ao juntar-se diferentes concentrac8es de < quencher >> verificou-se que a fluoresciincia
niio apresentava um decaimento h i c o mas que para cada
concentra~iiode dimetilviolog6nio se obtinha um decaimento
que era uma sobreposi~iiode exponenciais como se vb na
Figura 2. 0 s decairnentos apresentados foram obtidos para
duas escalas de tempo diferentes. Na Figura 2 a) pode observar-se todo o perfil da fluoresciincia enquanto que a Figura 2 b)
permite a mediggo do decaimento ripido.
.FIGURA 2 - Fotografias do decaimento do estado excitado de 2.5 X 10 M
de pireno em 0,l M de solu@o aquosa de SDS na presenca de
0,5 X lP3M de dirnetilviolog6nio. (Observado ao cornprimento
de onda de 400 nm).
a) escala vertical, 20 mV por divido b) escala vertical, 20 m V por divisb
escalca horizontal. 10 ns por diescala horizontal, 100 ns por diVi.550
VM0
UM MODEL0 ESTATfSTICO PARA aQUENCHINO, IdNICO
0 t r a ~ a d osemilogaritimco da fluoresc&ncia como fun@o
do tempo, Figura 3, mostra que o decaimento nZo 6 uma
exponencial Gnica. Por anidise dos dados foi possivel obter
duas constantes diferentes para o decaimento da fluorescibcia
do pireno; cada uma corresponde a uma parte da curva da
FIGURA 3-Tracados semilogaritmicos das curvas de fluoresc6ncia de
2,5 X 105M de pireno em 0,l M de solufio aquosa de SDS
na presenw de dimetilviolog6nio. (Observado no cornprimento
de onda de 400 nm).
1) a concentrafio de dimetilviolog6nio = 0 ;
2) a concentrafio de dimetilviolog6nio = 0,5 X 103 M ;
3) a concentra@io de dimetilviologCnio = 1 X 10-3 M.
YARIA FRANCISCA S. WHEELER e FREDERICK P. WHEELER
No Quadro I mostram-se as constantes de <quenching w
para diferentes concentracBes de gquencherw.
QUADRO I
<QUENCHING>>DE 2,5 x 104 M DE PIRENO EM SOLU~AO
DE 0,l M SDS POR DIR/IETJLVIOLOGENIO
Constantes da taza 'a deuoresc&cia (nd-1
vida longa
vida curta
As esphcies de vida longa mostram urn comportamento
mais ou menos constante. Por outro lado, para os decaimentos
rgpidos, 6 6bvio que h6 uma relac80 linear entre a constante
de decaimento e a concentrac80 do cquencherw, como se pode
constatar pela Figura 4.
FIGURA 4 -Representac50 griifica da constante de taxa do decaimento
rhpido de 2,5 X lo5 M de pireno em 0,lM de solu6o aquosa
de SDS como uma fun60 da concentracZio de dimetilviolog6nio.
6. ANALISE D m RESULTADOS
As curvas de decaimento foram obtidas em fotografia com
uma miiquina Tektronix directamente do oscilosc6pio. Estas
fotografias foram depois amplificadas cinco vezes e passadas
a papel milimCtrico para facilitar a digitaciio manual.
Para os casos em que a fluoresci2ncia do pireno apresentava apenas m a exponencial, fizeram-se os c&lculos da recta
de regress50 do conjunto total dos dados (In (I,), ti) e tambkm
para o coeficiente de correla@io.
Para os sistemas onde se oibtiveram duas taxas de decaimento, a leitura dos dados tornou-se mais complicada. Primeiro, as curvas foram amplificadas, digitadas e postas em
papel semilogaritmico. Isto permitiu que o ponto de descontinuidade entre o decaimento riipido e o longo fosse encon-
MARIA FRANCISCA
S.
WHXZLER e FREDERICK P. WREELER
trado. Assim se conseguiu separar os dois tipos de decaimento.
SC, ent5o os dados correspondentes ao decaimento rhpido
(ln (I,), t) puderam ser analisados pel0 m6todo de regress50
linear.
A ocorr6ncia mais vulgar para o decaimento da fluoresc h c i a do pireno, 6 uma h i c a exponencial. Sem diivida, quanto
maior for a concentra@io dos iSes de gquencherw nas vizinhan~asda molkcula excitada de pireno, menor serh o tempo
de vida desse estado excitado. 0 tempo necessitrio para a difus5o dum i5o entre as micelas 6 muito curto cornparado com
o tempo de vida do pireno excitado dentro da micela. Se os
iSes se podem difundir livremente no meio aquoso, todas as
mo16culas sonda ficam sujeitas it mesma concentra~50 de
<tquencher >>.
;A fluoresc6ncia resultante seria uma exponencial
decrescente 6nica corn uma constante de decaimento que
aumenta devido ao aumento do valor mddio da concentraS50
de << quencher w.
O facto de que nesta experiencia se observaram v M a s
constantes de decaimento indica que para estas circunsthncias
as rnicelas n5o estavam sujeitas a uma concentra~50mkdia,
mas sim a uma concentra@o local a qual varia de micela
para micela. Isto mostra que os i8es de <<quencher>nHo estavam livres para difundir rapidamente no meio aquoso. N6s
propomos o seguinte modelo para explicar este comportamento
e as vhrias exponenciais.
Micelas s5o corpos carregados e encontram-se rodeadas
por uma camada i6nica a qual se estende a uma disancia da
ordem do comprimento de Debye dado pela express50:
onde a 6 a constante dielkctrica do meio envolvente, a, a
permitividade do espaco livre, k a constante de Boltzmann, T
a temperatura absoluta, no a concentra&io idnica e q a
carga i6nica. Para a temperatura de 20"C e as concentrac6es
UM MODEL0 ESTATISTICO PaRa <QUENCHING> IdNICO
M, o comprimento
de c quencher >> usadas neste trabalho,
de Debye C de 50A.
As micelas sdo entidades relativamente grandes ; o raio
de urna micela de SDS 6 de 20 A. Para urna concentra~80
micelar de 1,6 x lo3 M, o n6mero de micelas pox litro 6 de
9,7 x 1020. Pode calcular-se a disancia entre os centros das
micelas, pelo inverso da raiz c6bica deste n6mero. Assim se
ve que os centros das micelas se encontram a urna separacdo
de aproximadamente 100 A, donde se conclui que as superficies
das micelas se encontram separadas de 60 A, ou seja urna
distbcia aproximada ao comprirnento de Debye. A maioria
dos ides de cquenchers encontram-se portanto na camada
idnica micelar e ndo no meio aquoso livre.
Se os e quencherss forem suficientemente eficientes na
redu~50do tempo de vida da fluoresc$ncia do pireno e se
se mantiverem na regido da camada idnica de certas micelas
por um tempo semelhante ao da fluorescCncia, entdo podemos
assumir que os <<quencherssestdo associados a determinadas
micelas durante o tempo de fluoresct3ncia.
No momento de excitacdo das mol6culas de pireno pel0
laser haverh urna certa distribuicdo de < quenchers s dentro
da camada idnica das micelas. Na altura da excitac5o algumas
micelas ndo terdo qualquer cquenchers, algumas terdo um
<< quencher B, outras dois c quenchers s, etc. Essa distribui~do
ser6 a de Poisson (KENDALL e STUART, 1958) visto que as
condic;Ges fisicas satisfazem aos requisitos desta distribui~do;
a probabilidade de urn ido estar associado a urna certa micela
6 muito pequena mas ao mesmo tempo o ntimero de ides
disponiveis para c quenching >> C muito grande.
O n6mero de mol6culas de pireno excitadas para um tempo t,
depois da excitacdo C :
i) dentro das micelas sem equencher~
zo 6 a vida natural do pireno em meio micelar
MARIA El2ANCISCA
S. WHEELER e
FREDERICK P. WHEELER
ii) dentro das micelas corn r <<quenchers,
= nr e - tlz
onde z 15 dado por
l / z = l/zo
+ l/e,
,
e l/ .t 6 a taxa de 4quenching devido B presenGa
de r c quenchers >>.
Assumindo que
onde 1/z, b a taxa de <quenching>>no caso de haver urn
i8o de ~ q u e n c h e rpor
~ micela, deste rnodo o ntirnero de
mol&ulas de pireno excitadas presentes em micelas corn r
<< quenchers >> 6
Mas nr = No P (r) onde No b o n b e r o total de mol6culas
excitadas de pireno para t = 0,e
distribui~80de Poisson onde A 6 o nhnero rn6dio de cquenchers 2 associado a cada micela,
e r 6 o niunero de cquenchersa associados a cada micela.
Por isso :
nr =(Ar 'r!) e - h No
UM MODEL0 ESTATfSTICO PARA <QUENCHING, IdNICO
e o n h e r o total de moldculas de pireno excitadas para o
tempo t 6 :
r=m
N(t) =No
2
e-'(??/r!)
exp{-t(l/
z o+r/ z
r=O
r=cQ
mas (A e
-*'
l)'/r!
4 o termo geral da s&ie exponential
Portanto
=No exp {A e -*GI
log
- t j z o - A)
N(~)/N,= - t/z - A (1 - e - t/'ll)
Desta expressiio poderemos concluir :
1) a presenGa de urn termo de longa vida (-t/ z correspondente ao decairnento natural do pireno em micelas.
Pelos valores apresentados no Quadro I v&se que a
este decairnento corresponde um valor m6dio da constante de decaimento igual a 0,0030(ns)-I & O,O004(n~)-~
;
2) a presenca duma componente de vida curta a qua1
depente da concentrac80 de << quencher ;
,
Da equa@io (1) pode ver-se a presenca de um termo
No exp(-t/zo - A) com uma constante de vida correspon-
MARIA FaANCISCA
S.
WHEELER e FREDERICK P. WHEELER
dente 24 das mol6culas do pireno dentro de micelas sem < quenchers,. Isto explica o facto de que, nos graicos dos tracados
semilogaritmicos das intensidades de fluoresc6ncia como funclo do tempo, a segunda parte das curvas todas tenham a
mesma inclinacZio. Da express50 para N(t), vemos como a
constante da fluoresc8ncia do pireno varia corn a concentrac50
do <c quencher B. Expandindo a exponencial
e tomando os dois primeiros termos da expanslo obtemos:
Esta expansiio 6 vsilida somente para valores de t/ z, pequenos, por exemplo para t/ T. = 0,3 o err0 6 de 6 I%.
e por isso devemos esperar uma relac50 linear entre a constante
rhpida da fluoresc&xia ,k e a concentrac50 de <quencher>>.
Isto 6, sem dfivida, o que se observa na Figura 4. A constante
da taxa de <quenching 6 ent5o expressa por
,
U M MODEL0 ESTATfSTICO PARA aQUENCHJ.NGa IONIC0
SolucSes micelares t$m sido usadas em investigacSes de
natureza biofisica uma vez que tais agregados simulam as condicSes complexas de ambiente de, por exemplo, as membranas.
As membranas bioldgicas s5o formadas por grupos organizados de mol4culas os quais exercem funcSes em processes
importantes tais como transducgo de energia, conduego do impulse nervoso, etc. Tentou-se com este trabalho compreender
o process0 de <quenching, da fluoresci3ncia em pireno usado
como sonda numa solus50 de micelas. Observaram-se mhltiplas
constantes da taxa de fluoresc6ncia de pireno. As condi~Ses
fisicas presentes nestas solucSes eram tais que a maioria dos
ices de cquencher > se encontravam localizados dentro da camada i6nica e niio na fase aquosa livre. Sugere-se que como
resultado do efeito do potencial el4ctrico existente na interface
rnicela-Agua sobre o movimento dos iijes de < quencher D, estes
iSes permanecem associados a certas micelas durante um period0
de tempo da ordem da durac5o da fluoresc6ncia. Urn modelo
estatistico de <quenching, baseado nesta hipdtese mostrou
explicar com sucesso as observacijes.
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