GLÁUCIA EMY OKIDA MIDORIKAWA
DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO DE PCR ESPECÍFICO PARA DETECÇÃO
DE ASPERGILLUS FLAVUS AFLATOXIGÊNICO EM GRÃOS BRASILEIROS.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
“Stricto
Sensu”
em
Ciências Genômicas e Biotecnologia da
Universidade Católica de Brasília, como
requisito para obtenção do Título de Mestre
em Ciências Genômicas e Biotecnologia.
Orientador: Prof. Dr. Robert Neil Gerard
Miller
Brasília
2009
I
M629d
Midorikawa, Glaucia Emy Okida.
Desenvolvimento de um método de PCR específico para detecção de
Aspergillus Flavus aflatoxigênico em grãos brasileiros / Glaucia Emy
Okida Midorikawa. – 2009.
146 f. : il. ; 30 cm
Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de Brasília, 2009.
Orientação: Robert Neil Gerard Miller
1. Grãos – contaminação - Brasil. 2. Aspergilus flavus. 3.
Aflatoxinas. 4. Micotoxinas. I. Miller, Robert Neil Gerard, orientador.
II. Título.
CDU 602
Ficha elaborada pela Coordenação de Processamento do Acervo do SIBI – UCB.
TERMO DE APROVAÇÃO
Dissertação de autoria de Gláucia Emy Okida Midorikawa, intitulada
“DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO DE PCR ESPECÍFICO PARA DETECÇÃO DE
ASPERGILLUS FLAVUS AFLATOXIGÊNICO EM GRÃOS BRASILEIROS”, apresentada
como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Genômicas e
Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, em 06 de março de 2009, defendida e
aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
Prof. Dr. Robert Neil Gerard Miller
Orientador - UnB
Prof. Dr. Octávio Luiz Franco
Membro Interno - UCB
Profa. Dra. Eliane Ferreira Noronha
Membro Externo - UnB
Prof. Dr. Lúcio Flávio de Alencar Figueredo
Membro Externo
Brasília
2009
II
III
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Dr. Robert Neil Gerard Miller, por seu otimismo, dedicação, paciência e
empenho em transmitir seus conhecimentos.
Ao Professor Dr. Lúcio Flávio de Alencar Figueiredo pela participação no desempenho do
projeto, dedicação e paciência.
À Professora Dra. Eliane Ferreira Noronha que pacientemente leu e apontou os problemas
do projeto.
Ao Dr. Francisco Freire da Embrapa-CNPAT por nos fornecer grupos de isolados de
Aspergillus flavus.
Aos demais professores e funcionários que integram o Curso de Pós-Graduação em
Ciências Genômicas e Biotecnologia da UCB.
Aos amigos que ao longo do Curso, me incentivaram e foram companheiros. Meus sinceros
agradecimentos à Camila, Su, Flavinha, Ciro, Aline, Marco, Gi e Cris, pelo carinho e
amizade.
Às estagiárias, Annanda e Ísis que tanto me ajudaram.
Aos meus familiares, em especial à minha mãe Silvia Fumie Okida, as tias Elisa Yoshie
Okida e Mary Nozu, pelo incentivo, apoio, motivação e paciência de todas as horas.
IV
RESUMO
MIDORIKAWA, G.E.O. Desenvolvimento de um método de PCR específico para detecção
de Aspergillus flavus aflatoxigênico em grãos brasileiros. 146 páginas. Programa de PósGraduação “Stricto Sensu” em Ciências Genômicas e Biotecnologia – Universidade Católica
de Brasília, Brasília, 2009.
Alimentos em geral são extremamente suscetíveis a contaminação por fungos
produtores de micotoxinas que prejudicam a saúde humana e animal, além de causar
grandes prejuízos na produção agrícola brasileira. O grupo mais importante de micotoxinas
são as aflatoxinas, devido a sua alta toxicidade, propriedades hepatocarcinogênicas e sua
ocorrência comum em diferentes alimentos. Grãos brasileiros como o amendoim (Arachis
hypogaea), a castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa) e a castanha-de-caju (Anacardium
occidentale L.), são extensivamente afetados pela contaminação por fungos aflatoxigênicos,
como o Aspergillus flavus. A contaminação por A. flavus, prejudica de sobremaneira a
exportação desses grãos, levando países como o Brasil a grandes perdas econômicas. A
detecção de contaminação microbiana e por toxinas envolve sistemas de controle como o
HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), que é um sistema preventivo que
busca a produção de alimentos inócuos, utilizando ferramentas de diagnose, quer sejam
morfológicas, moleculares ou cromatográficas. Para a realização de um sistema robusto de
diagnose molecular de A. flavus aflatoxigênico, a ser incorporado em sistemas de controle
como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), o presente trabalho utilizando
a técnica de cromatografia de camada delgada (CCD), caracterizou 63 amostras de A.
flavus, isoladas de castanha do Brasil e castanha de caju para a produção de aflatoxinas.
Análises de CCD mostraram que 49 isolados são produtores de aflatoxinas e para 14
isolados estas não foram detectadas. Amostras isoladas de A. occidentale foram
caracterizadas como produtoras de aflatoxina B1, antes descrito como produtor de aflatoxina
G. Análises desses isolados por meio de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
mostraram diversidade genética considerável entre isolados, porém nenhuma correlação
com a aflatoxigenicidade. Entretanto, análises com outros primers de RAPD não excluem a
possibilidade de utilização de RAPD SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) em
um método de diagnose molecular para isolados de A. flavus aflatoxigênicos Regiões
espaçadoras intergênicas do DNA ribossomal (rDNA) nuclear (ITS 1 e 2) (Internal
Transcribed Spacer) e um região da subunidade pequena do DNA ribossomal do DNA
mitocondrial) (mtDNA SSU rDNA), foram utilizadas como regiões candidatas para a
detecção específica de A. flavus em um sistema robusto de PCR (Polymerase Chain
Reaction) múltipla, por serem conservadas e abundantes no DNA alvo. Além de
desenvolvimento e comprovação de especificidade de primers para a espécie A. flavus e
gênero Aspergillus, o presente trabalho apresenta dois sistemas de IAC (Internal
Amplification Control) para verificar a confiabilidade do sistema de PCR. Os dois sistemas
mostraram limites de detectabilidade em picogramas de DNA alvo de A. flavus. Análises da
diversidade genética entre as três espécies de Aspergillus: A. flavus, A. parasiticus e A.
oryzae, comparadas com seqüências do Genbank dos genes aflR, aflP e aflQ da via
biossintética de aflatoxinas, mostraram que A. flavus possui maior similaridade com A.
oryzae do que A. parasiticus, com a maior divergência observada entre os genes aflR e aflP.
Treze conjuntos de primers foram desenhados com cobertura completa para os três genes e
produtos de PCR dos 63 isolados foram seqüenciados para os genes aflP e aflQ. A análise
parcial desses genes em 14 isolados representativos de aflatoxigênicos e não
V
aflatoxigênicos revelou 6 haplótipos de 11 SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), onde o
haplótipo 6 é o mais freqüente.
PALAVRAS-CHAVE: Aspergillus flavus. Aflatoxina. Micotoxinas. PCR, RAPD. rDNA ITS.
mtDNA SSU rDNA. Diversidade.
VI
ABSTRACT
In general, foods are extremely susceptible to contamination by mycotoxin-producing
fungi that affect human and animal health, with major losses common in agricultural
production in Brazil. Aflatoxins are considered the most important group of mycotoxins,
because of their high toxicity, hepatic-cancer-inducing properties, and common occurrence in
various grain foods. Brazilian grains such as peanut (Arachis hypogaea), Brazil nut
(Bertholletia excelsa) and cashew nut (Anacardium occidentale L.) are extensively affected
by contamination with aflatoxigenic fungi such as Aspergillus flavus. Contamination by A.
flavus affects exportation, leading to large economic losses in countries such as Brazil.
Detection of toxins and microbial contamination involves control systems such as HACCP
(Hazard Analysis and Critical Control Points) which is a preventive system that aims to
produce safe food by using diagnostic tools, whether morphological, molecular or
chromatographic. In order to develop a robust molecular diagnosis system for incorporation
in control systems such as HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points), the present
work was conducted. Thin layer chromatography (TLC) was used to characterize 63 isolates
of A. flavus, isolated from Brazil nut and cashew nut in seven Brazilian localities. Whilst most
isolates were aflatoxigenic, aflatoxins were absent in 14 isolates. Aflatoxin B1 was reported
for the first time in isolates from A. occidentale. RAPD analysis of genetic diversity, based
upon coded data generated with 32 RAPD primers, revealed considerable genetic diversity
between isolates. No correlation was observed with aflatoxigenicy, such that primers tested
were concluded as inappropriate for application in RAPD SCAR-derived methods for
diagnosis for aflatoxin-producing strains. Nuclear ribosomal DNA (rDNA) intergenic spacer
regions ITS 1 and 2 (Internal Transcribed Spacer) and a region of the small subunit (SSU)
mitochondrial DNA rRNA gene cluster (mtDNA SSU rDNA) were used as candidates for
specific detection of A. flavus in a robust multiple PCR (Polymerase Chain Reaction) system,
because of conservation and abundance in target DNA. In addition to the design of specific
primers and confirmation of specificity for the species A. flavus and genus Aspergillus, this
paper presents two internal amplification control systems (IACs) for verification of the
reliability of the PCR detection systems. Both detection methods showed detectability limits
for purified DNA from A. flavus in the region of picogram quantities. Analysis of genetic
diversity between the three species of A. flavus, A. parasiticus and A. oryzae, based upon
comparison of GenBank sequences for the biosynthetic pathway genes aflR, aflP and aflQ,
revealed that A. flavus shows greater similarity to A. oryzae than A. parasiticus, with greater
divergence between the genes aflR and aflP. Thirteen primers were designed for complete
coverage for the three genes, and PCR products were sequenced in 63 aflatoxigenic and
non-aflatoxigenic isolates of A. flavus. Partial analysis of these genes in representative
aflatoxin-producing and non-producing isolates showed six haplotypes of 11 SNPs (Single
Nucleotide Polymorphism), where one among them is the most common.
KEYWORDS: Aspergillus flavus. Aflatoxin. Mycotoxins. PCR. RAPD. rDNA ITS. mtDNA
SSU rDNA. Diversity.
VII
Índice de Figuras
Figura 1: Ciclo de vida de Aspergillus spp. (figura a esquerda), e Penicillium spp.
(figura a direita) (Adaptado de Dube, 1990 in FAO, Barley Post-Harvest Operation:
Chapter 4 (http://www.fao.org/inpho/content/compend/text/ch31/ch31_04.htm) ........ 10
Figura 2: Ciclo de vida do fungo A. flavus em cultura de milho (Adaptado de
http://www.aspergillusflavus.org/). ...................................................................................... 10
Figura 3: Esquema dos sete princípios do HACCP (Hazard Analysis and Critical
Control Points )(Adaptado de http://www.fehd.gov.hk/safefood/library/haccp/2.html).
.................................................................................................................................................. 12
Figura 4: a) colônias de A. flavus; b) verso das colônias da placa a; c) conídios
maduros e imaduros; d) cabeça conidial mostrando a haste rugosa, visícula oval e
filíades pequenas e ampuliformes nascidas direto da vesícula; e) conídios (Singh et
al., 1991). ................................................................................................................................ 13
Figura 5: a) colônias de A. parasiticus; b) verso das colônias da placa a; c) conídios
maduros; d) cabeça conidial mostrando a haste áspera, cabeça radial e filíades
(Singh et al., 1991). ............................................................................................................... 14
Figura 6: Localizações de laboratórios credenciados pelo MAPA (Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento), ANVISA (Agência Nacional de Vigilância
Sanitária), e outros (http://www.micotoxinas.com.br/laboratorios.html) ........................ 16
Figura 7: Grupo de genes localizados no rDNA e local de anelamento de primers
universais (ITS1 e ITS4) para amplificação da região ITS. ............................................ 20
Figura 8: Pequena subunidade do DNA mitocondrial ribossomal com local de
anelamento de primers universais MS1 e MS2; e grande subunidade do DNA
mitocondrial ribossomal com local de anelamento de primers universais ML1 e ML2,
ML3 e ML4, ML5 e ML6, ML7 e ML8 .................................................................................. 22
Figura 9. Esquema de construção do IAC com deleção de seqüências entre os sítios
do primer (Abdulmawjood et al., 2002). ............................................................................. 26
Figura 10. Esquema de construção do IAC com inserção de seqüências entre os
sítios do primer (Abdulmawjood et al., 2002). ................................................................... 26
Figura 11: Esquema de construção do IAC com um sítio de anelamento diagnóstico
específico e outro sítio de anelamento complementar ao plasmídio pUC19
(Sachadyn & Kur, 1998). ...................................................................................................... 27
Figura 12. A – 82Kb do grupo de genes envolvidos na via biossintética de afaltoxinas
de A. flavus e A. parasiticus. A nova nomenclatura dos genes é dada na esquerda
da linha vertical e a nomenclatura antiga é dada na direita. Ao longo da linha vertical
as setas indicam a direção de transcrição dos genes. A régua à esquerda da linha
vertical indica o tamanho relativo desses genes em quilobases; B – Setas no painel
VIII
B indicam as ligações a partir dos genes para as enzimas que eles codificam, das
enzimas para os passos de bioconversão em que elas estão envolvidas, e dos
intermediários para os produtos dos passos de bioconversão da aflatoxina.
Abreviações descritas indicam: ácido norsólico (NOR), averatina (AVN), 5’hidroxiaveratina (HAVN), oxoaveratina (OAVN), averufanina (AVNN), averufina
(AVF), acetato versiconal hemiacetal (VHA), versiconal (VAL), versicolorina B
(VERB), versicolorina A (VERA), demetilesterigmatocistina (DMST), diidrodemetilesterigmatocistina (DHDMST), esterigmatocistina (ST), diidroesterigmatocistina
(DHST),
O-metilesterigmaticistina
(OMST),
diidro-O-metil-esterigmatocistina
(DHOMST), aflatoxina B1 (AFB1) aflatoxina B2 (AFB2), aflatoxina G1 (AFG1),
aflatoxina G2 (AFG2); C – Genes envolvidos na via biossintética de
esterigmatocistina de A. nidulans (Yu et al.. 2004). ......................................................... 30
Figura 13: Gene aflR da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus contendo um
único exon de 1335pb. Sobreposição dos segmentos seqüenciados e tamanhos de
fragmentos gerados para cada segmento. Acc número de acesso do Genbank da
seqüência que foi utilizada para desenho dos primers e exons. ................................... 48
Figura 14: Gene aflP da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus contendo cinco
exons. Sobreposição dos segmentos seqüenciados e tamanhos de fragmentos
gerados para cada segmento. Acc número de acesso do Genbank da seqüência que
foi utilizada para desenho dos primers e exons. .............................................................. 49
Figura 15: Gene aflQ da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus contendo sete
exons. Sobreposição dos segmentos seqüenciados e tamanhos de fragmentos
gerados para cada segmento. Acc número de acesso do Genbank da seqüência que
foi utilizada para desenho dos primers e exons. .............................................................. 49
Figura 16: Amplificação de RAPD com os primers T20 e OPF10. A) RAPD com
primer T20. M: marcador 1kb ladder plus; 1 ao 5: isolados UCB015, UCB017,
UCB022, UCB040 e UCB052; 6: controle negativo; 7 ao 12: UCB007, UCB036,
UCB044, UCB045, UCB060 e UCB077. B) RAPD com o primer OPF10. M: marcador
1kb ladder plus; 1 ao 5: isolados UCB015, UCB017, UCB022, UCB040 e UCB052; 6:
controle negativo; 7 ao 12: UCB007, UCB036, UCB044, UCB045, UCB060 e
UCB077. .................................................................................................................................. 54
Figura 17: Dendograma UPGMA representando as relações genéticas das amostras
de A. flavus isoladas a partir de A. occidentale e B. excelsa, baseado na combinação
dos perfis de RAPD obtidos com 32 primers de RAPD. As similaridades foram
obtidas utilizando o coeficiente de Jaccard. ...................................................................... 55
Figura 18: Amplificação de PCR com os primers ASPITSF2 e ASPITSR3 específicos
de A. flavus. M: Marcador 1kb ladder plus; 1: controle negativo; 2 ao 4: isolados de
A. flavus UCB024, UCB045 e UCB060; 5 e 6: isolados 1 e 2 de Trichoderma
harzianum; 7 e 8: isolados 1 e 2 de Aspergillus fumigatus; 9 e 10: isolados 1 e 2 de
Aspergillus awamore; 11 e 12: isolados CMUnB 1824 e 1848 de Fusarium solani f.
sp. glycines; 13: isolado CMUnB 1974 de F. solani. ........................................................ 56
Figura 19: Digestão das enzimas SmaI, ClaI e XhoI. M: marcador 1 Kb ladder Plus;
1: DNA plasmidial; 2: digestão do DNA plasmidial com as enzimas SmaI e ClaI; 3:
IX
digestão do DNA plasmidial com as enzimas XhoI e ClaI; 4: digestão do DNA
plasmidial somente com a enzimas SmaI; 5: digestão do DNA plasmidial somente
com a enzima XhoI. ............................................................................................................... 57
Figura 20: Limite de detecção de A. flavus com os primers ASPITSF2 e ASPITSR3.
M: marcador 1 kb ladder plus; 1 ao 8: produtos de PCR amplificados com 20 ng, 5
ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg e 10 fg de DNA genômico de A. flavus; 9:
controle negativo.................................................................................................................... 58
Figura 21. Limite de detecção de A. flavus e IAC. M: marcador 1 Kb ladder Plus; 1:
concentração do IAC 10 ng; 2: concentração do IAC 1 ng; 3: concentração do IAC
100 pg; 4: concentração do IAC10 pg; 5: concentração do IAC 1 pg; 6: concentração
do IAC 100 fg; 7: concentração do IAC 10 fg; 8: concentração do IAC 1 fg; 9:
controle negativo. A. flavus manteve uma concentração padrão de 10ng em todas as
reações. ................................................................................................................................... 58
Figura 22: Amplificação de PCR específica de A. flavus e IAC. M: marcador 1 Kb
ladder Plus; 1 ao 3: isolados UCB036, UCB040 w UCB044 de A. flavus; 4: isolado 1
de A. awamori; 5: isolado 1 de A. fumigatus; 6: isolado 1 de A. niger; 7 e 8: isolados
CMUnB 1824 e 1848 de F. solani f. sp. glycines; 9: isolado CMUnB 1974 de F.
solani; 10: isolado 1 de Penicillium citrinum; 11: isolado 1 de Trichoderma harzianum;
12: isolado 1 de Cladosporium cladosporioides; 13: controle negativo. ......................... 58
Figura 23: Amplificação de PCR específica A. flavus e IAC com os primers
ASPITSF2 e ASPITSR3, M: marcador 1 kb ladder plus; 1 ao 48: UCB001 – UCB048;
49: controle negativo. ............................................................................................................ 59
Figura 24: Amplificação de PCR específica para Aspergillus e limite de detecção
para Aspergillus com os primers ASP_GEN_MTSSU_F2 e ASP_GEN_MTSSU_R1.
a) amplificação específica de Aspergillus. M: marcador 1kb ladder plus; A: isolado
UCB003 de A. flavus; F: isolado 1 de A. fumigatus; T: isolado 1 de Trichoderma
harzianum; C: controle negativo b) Limite de detecção de Aspergillus com
temperatura de anelamento à 64,4°C. M: marcador 1kb ladder plus; 1 ao 7:
concentração do DNA genomico 10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001, e 0.0001ng,
respectivamente; C: controle negativo. c) Limite de detecção de Aspergillus com
temperatura de anelamento a 66,3°C. M: marcador 1kb ladder plus; 1 ao 7:
concentração do DNA genomico 10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001, e 0.0001ng,
respectivamente; C: controle negativo. .............................................................................. 60
Figura 25: Digestão do fragmento de DNA gerado pelos primers
ASP_GEN_MTSSU_F1 e ASP_GEN_MTSSU_R1 pela enzima SnaBI. M: marcador
molecular 1 Kb ladder Plus; 1: fragmento de DNA diferido pela enzima SnaBI.......... 61
Figura 26: Gradiente de concentração do DNA plasmidial, IAC. M: marcador
molecular 1Kb ladder Plus; 1: concentração do IAC 10 ng/μl; 2: concentração do IAC
5 ng/μl; 3: concentração do IAC 1 ng/μl; 4: concentração do IAC 100 pg/μl; 5:
concentração do IAC 10 pg/μl; 6: concentração do IAC 1 pg/μl; 7: concentração do
IAC 100 fg/μl; 8: concentração do IAC 10 fg/μl; 9: concentração do IAC 1 fg/μl. Todas
as reações possuem DNA genômico de A. flavus a 10ng. ............................................. 62
X
Figura 27: Amplificação de PCR específica de Aspergillus e IAC. M: marcador 1 Kb
ladder Plus; 1 ao 3: isolados UCB036, UCB040 e UCB044 de A. flavus; 4: isolado 1
de A. awamori; 5: isolado 1 de A. fumigatus; 6: isolado 1 de A. niger; 7 e 8: isolados
CMUnB 1824 e 1848 de F. solani f. sp. glycines; 9: isolado CMUnB 1974 de F.
solani; 10: isolado 1 de Penicillium citrinum; 11: isolado 1 de Trichoderma harzianum;
12: isolado 1 de Cladosporium cladosporioides; 13: controle negativo. ......................... 62
Figura 28: Gradiente de temperatura utilizando os primers sintetizados para os
genes aflQ, aflP e aflR da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus. a)
Temperatura de anelamento a 45°C. b) Temperatura de anelamento a 50°C. c)
Temperatura de anelamento a 55°C. d) Temperatura de anelamento a 60°C. e)
Temperatura de anelamento a 65°C. M: marcador molecular 1kb ladder plus; 1:
combinação dos primers AFLP_F1 e AFLP_R1; 2: combinação dos primers AFLP_F2
e AFLP_R2; 3: combinação dos primers AFLP_F3 e AFLP_R3; 4: combinação dos
primers AFLP_F4 e AFLP_R4; 5: combinação dos primers AFLR_F1 e AFLR_R1; 6:
combinação dos primers AFLR_F2 e AFLR_R2; 7: combinação dos primers AFLR_F3
e AFLR_R3; 8: combinação dos primers AFLR_F4 e AFLR_R4; 9: combinação dos
primers AFLQ_F1 e AFLQ_R1; 10: combinação dos primers AFLQ_F2 e AFLQ_R2;
11: combinação dos primers AFLQ_F3 e AFLQ_R3; 12: combinação dos primers
AFLQ_F4 e AFLQ_R4; 13: combinação dos primers AFLQ_F5 e AFLQ_R5. Todas as
reações foram feitas com o isolado UCB001 de A. flavus. ............................................. 63
Figura 29: Gene aflR de A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae. Tamanho em pb
esperado do gene e éxon. .................................................................................................... 65
Figura 30: Gene aflP de A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae. Tamanho em pb
esperado do gene e seus respectivos éxons. ................................................................... 65
Figura 31: Gene aflQ de A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae. Tamanho em pb
esperado do gene e seus respectivos éxons. ................................................................... 66
Figura 32: SNPs entre A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae que ocorrem para o gene
aflR. Mudanças de aminoácidos entre as espécies em decorrência dos SNPs. ........ 67
Figura 33: Distância genética entre o gene aflR de A. flavus, A. parasiticus e A.
oryzae. ..................................................................................................................................... 68
Figura 34: SNPs entre A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae do gene aflP. Mudança
de aminoácidos entre as espécies em decorrência dos SNPs. ..................................... 69
Figura 35: SNPs entre A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae do gene aflQ. Mudança
de aminoácidos entre as espécies em decorrência dos SNPs. ..................................... 70
Figura 36: Grupo de genes da via biossintética de aflatoxinas em A. flavus.
Seqüência do grupo de genes de 78264pb. Total de 22 genes da via biossintética.
Distância entre os 3 genes estudados, aflR, aflQ e aflP. ................................................ 71
XI
Índice de Tabelas
Tabela 1: Combinações testados entre primers específicos desenhados a partir de regiões
específicas para A. flavus em rDNA ITS nuclear, com tamanho de produto esperado, em pares
de bases, para cada combinação de primer............................................................................ 42
Tabela 2: Combinações entre primers de regiões específicas do mtDNA SSU rDNA e
tamanhos de pares de base esperados para cada combinação de primer. ............................. 42
Tabela 3: Combinações entre primers dos genes aflQ, aflP e aflR de A. flavus, com
seqüências dos primers Forward e Reverse, respectivamente, tamanhos esperados, em
pares de bases, para cada combinação e temperatura de anelamento utilizada. ................ 48
Tabela 4: Caracterização dos isolados de A. flavus quanto ao local de origem, hospedeiro de
origem, e presença de aflatoxinas com suas respectivas concentrações em meios de cultura
YES e CYA. ........................................................................................................................... 52
Tabela 5: Tamanho esperado, em pares de bases para os éxons e ítrons dos genes aflQ e
aflP em A. flavus. ................................................................................................................... 66
Tabela 6: SNPs entre isolados de A. flavus. G1 e G2: isolados de B.excelsa com origem da
Amazônia; G3: A. occidentale com origem do Piauí. ............................................................... 71
XII
Índice de Quadros
Quadro 1: Principais organismos produtores de micotoxinas; principais micotoxinas;
principais substratos de ocorrência dos fungos produtores de micotoxinas; principais regiões
de ocorrências de micotoxinas; temperaturas e atividade da água idéias para a produção de
micotoxina pelo fungo responsável; e efeito toxigênico das micotoxinas. Fonte:
http://apavic.com/html/sections/articulo/art_Alltech.asp; http://fao.org/; Diário Oficial de las
Comunidades Europeas – 08/04/1999, http://www.exopol.com/general/circulares/84circ.html.
Cast, 2003; Lahlali et al., 2005; Magan, 2006; Ramirez et al., 2006.. ..................................... 3
XIII
SUMÁRIO
1
1 Introdução ..................................................................................................................... 1
1.1
Micotoxinas ............................................................................................................... 1
1.2
Aflatoxinas ................................................................................................................. 4
1.3
Grãos brasileiros ....................................................................................................... 5
1.3.1
Castanha-do-Brasil (Castanha do Pará) ............................................................ 6
1.3.2
Amendoim .......................................................................................................... 7
1.3.3
Castanha de caju ............................................................................................... 8
1.4
Contaminação por Aspergillus flavus ........................................................................ 9
1.5
Sistemas de controle de micotoxinas ...................................................................... 11
1.5.1
Diagnose morfológica de fungos micotoxigênicos ........................................... 12
1.1.1
Detecção cromatográfica de micotoxinas ........................................................ 14
1.5.2
Diagnose Imunológica de micotoxinas............................................................. 16
1.5.3
Diagnose molecular de fungos micotoxigênicos .............................................. 17
2
Justificativa .................................................................................................................... 35
3
Objetivos ........................................................................................................................ 37
4
1.2
Objetivo geral .......................................................................................................... 37
1.3
Objetivos específicos .............................................................................................. 37
Material e Métodos ........................................................................................................ 38
4.1
Coleção de Aspergillus flavus ................................................................................. 38
4.1.1
Identificação morfológica dos isolados de Aspergillus flavus .......................... 38
4.2
Identificação de isolados de Aspergillus flavus aflatoxigênico ................................ 38
4.3
Extração do DNA genômico de Aspergillus flavus .................................................. 39
1.4
Análise da variabilidade genética em isolados de Aspergillus flavus aflatoxigênicos
e Aspergillus flavus não aflatoxigênicos via RAPD ........................................................... 40
1.5
Primers específicos desenhados para diagnose molecular de Aspergillus flavus .. 41
1.5.1
Primers específicos para região nuclear do rDNA ITS .................................... 41
4.3.1
Primers específicos para região do mtDNA SSU rDNA ................................... 42
1.6
Desenho de controles de amplificação interno (IACs) e otimizações dos sistemas
de PCR especifico ............................................................................................................. 43
1.6.1
Desenho do controle de amplificação interno (IAC) para região do rDNA ITS
específico de Aspergillus flavus ..................................................................................... 43
4.3.2
Otimização do sistema de PCR utilizando primers para a região do rDNA ITS
específicos para Aspergillus flavus e IAC ...................................................................... 44
4.3.3
Desenho do controle de amplificação interna (IAC) para região do mtDNA SSU
rDNA específico do gênero Aspergillus ......................................................................... 45
4.3.4
Otimização do sistema de PCR utilizando primers para a região mtDNA SSU
rDNA específicos para o gênero Aspergillus e IAC ....................................................... 46
1.7
Análise da diversidade nucleotídica dos genes aflR, aflP e aflQ da via biossintética
de aflatoxinas em populações de Aspergillus flavus aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos ..
................................................................................................................................ 47
XIV
1.7.1
flavus
Escolha de genes candidatos da via biossintética de aflatoxinas em Aspergillus
......................................................................................................................... 47
1.7.2
Desenho e otimização de primers específicos para os genes aflQ, aflP e aflR47
4.3.5
Seqüenciamento dos genes aflR, aflP e aflQ da via biossintética de aflatoxinas
em Aspergillus flavus ..................................................................................................... 50
1.7.3
Análise bioinformática da diversidade nucleotídica dos genes aflR, aflP e aflQ
da via biossintética de aflatoxinas ................................................................................. 50
5
Resultados ..................................................................................................................... 52
1.8
Identificação de isolados de Aspergillus flavus aflatoxigênico e não aflatoxigênico ...
................................................................................................................................ 52
1.9
Caracterização da variabilidade genética em isolados de Aspergillus flavus
aflatoxigênico e não aflatoxigênico via RAPD ................................................................... 53
1.10
Desenho e otimização do controle de amplificação interno (IAC) para o sistema
de PCR da região do rDNA ITS específica para Aspergillus flavus. ................................. 55
5.1
Otimização de primers específicos para regiões do mtDNA SSU rDNA de
Aspergillus flavus. .............................................................................................................. 59
1.11
Desenho e otimização do controle de amplificação interno (IAC) para o sistema
de PCR da região do mtDNA SSU rDNA específico para Aspergillus. ............................. 60
1.12
Análise da diversidade nucleotídica dos genes aflR, aflP e aflQ da via
biossintética de aflatoxinas em populações de Aspergillus flavus aflatoxigênicos e não
aflatoxigênicos ................................................................................................................... 63
1.12.1
Otimização de primers específicos para os genes aflR, aflP e aflQ ................ 63
1.12.2 Seqüenciamento dos genes aflR, aflP e aflQ da via biossintética de aflatoxinas
em Aspergillus flavus ..................................................................................................... 64
1.12.3 Análise da diversidade nucleotídica inter e intra-específica dos genes aflR, aflP
e aflQ da via biossintética de aflatoxinas no gênero Aspergillus ................................... 64
6
Discussão ...................................................................................................................... 72
7
Conclusões .................................................................................................................... 80
2
Trabalhos em andamento e perspectivas futuras .......................................................... 81
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................... 82
Apêndice A .......................................................................................................................... 103
Apêndice B .......................................................................................................................... 115
Apêndice C .......................................................................................................................... 118
Anexo A – Resumos de participações em congressos ....................................................... 120
Anexo B – Artigo publicado ................................................................................................. 123
XV
1
1 1 Introdução
Alimentos como grãos, leite, entre outros e seus derivados são extremamente
suscetíveis a contaminação por fungos, os quais são organismos saprófitos incapazes de
gerar matéria orgânica a partir de matéria inorgânica, dependendo de alguma forma dos
alimentos derivados de plantas ou animais. Alguns destes fungos que contaminam os
alimentos, também são produtores de micotoxinas, que constituem produtos do metabolismo
secundário, pertencentes a diferentes classes químicas, com efeito teratogênico,
imunosupressivo, nefrotóxico, hepatóxico e carcinogênico sobre a saúde humana e animal
(Bullerman, 1979). De acordo com FAO, (2009) perdas econômicas significantes estão
associadas com impactos na saúde humana, produtividade animal, e o comércio nacional e
internacional. Estima-se que 25% da agricultura mundial são afetadas, por fungos
produtores de micotoxinas, o que gera uma perda global de alimentos de 1.000 milhões de
toneladas por ano. Outro exemplo, são os Estados Unidos que possuem perdas anuais de
culturas, como milho, cereais e castanhas, somando aproximadamente US$ 932 milhões ao
ano (Cast, 2003). Já no Brasil, cerca de 45% da produção de milho é contaminado por
micotoxinas, representando uma perda de 14 a 16 milhões de toneladas ao ano (cib, 2004).
1.1 Micotoxinas
As micotoxinas variam em grau de severidade, podendo alguns fungos produzir
toxinas letais e outros produzirem toxinas que não apresentam tanto impacto na saúde
humana e animal. As micotoxinas geralmente aparecem na cadeia alimentar do homem,
tendo início na contaminação do alimento pelo fungo produtor da toxina na lavoura, onde as
micotoxinas geralmente permanecem resistentes à decomposição do alimento em sistemas
digestivo de animais.
Fungos produtores de micotoxinas são responsáveis por perdas econômicas em uma
ampla gama de produtos agrícolas e tem seu efeito estendido na cadeia alimentar até o
consumidor. Em algumas culturas observa-se a contaminação por esses fungos durante a
germinação das sementes, crescimento e armazenamento. O resultado é que em diversos
estágios do desenvolvimento essa contaminação destrói e degrada os grãos, afetando o seu
valor nutricional, e geram adicionais para prevenções e controles de contaminação por
fungos micotoxigênicos, como o HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points).
Consumidores das áreas rurais e de países tropicais estão especialmente
submetidos aos efeitos agudos e de longo prazo causados pelas micotoxinas, que agem
2
como agentes primários infecciosos e tem seu efeito acentuado pela subnutrição. Além
disso, a exposição ou ingestão crônica da população a essas toxinas representa um
aumento no risco de câncer.
Mais de 350 micotoxinas já foram isoladas, das quais mais de 20 são comumente
encontradas em diversos alimentos e comprovadamente causam toxicidade à saúde
humana (Geisen, 1998). As aflatoxinas que são produzidas pelo gênero Aspergillus,
principalmente A. flavus e A. parasiticus, são uma das principais micotoxinas amplamente
associadas a produtos agrícolas dos trópicos e subtrópicos, como castanhas, amendoim e
milho.
Dentre os diferentes tipos de toxinas produzidas por fungos, como fumonisina,
tricotecenos, zearalenona, ocratoxina e patulina, a aflatoxina B1 é a mais tóxica, sendo
associada a câncer de fígado. Fungos do gênero Fusarium, presentes em milho, cevada,
aveia e trigo produzem as fumonisinas, que afetam o sistema nervoso. Já os tricotecenos,
incluindo deoxinivalenol (DON) e zearalenona, causam hemorragias, diarréias e vômitos
levando até a morte. A ocratoxina A, produzida por A. carbanarius, A. ochraceus e
Penicillium verrucosum, estando associada a climas temperados, cresce sob condições
quentes e úmidas. Geralmente é encontrada em alimentos como cevada, café, uvas,
podendo causar câncer no fígado e rim. A patulina, produzida por Penicillium expansum e P.
griseofulvum, está associada a uma grande variedade de frutas e vegetais (quadro 1). As
micotoxinas são extremamente estáveis, resistindo a altas temperaturas de cozimento.
Epidemias causadas por micotoxinas são raras, mas seu efeito carcinogênico devido à
longa exposição a pequenas quantidades da toxina constitui alto risco para a saúde humana
(Lubulwa & Davis, 1994).
Danos econômicos causados por micotoxinas incluem, portanto, perda da qualidade
de produtos agrícolas por contaminação de fungos e conseqüente produção de toxina,
perdas de animais, diminuição da produtividade, custos indiretos em sistemas de controle,
gastos na remoção da toxina para recuperar o produto rejeitado, e não aceitação do produto
pelo mercado importador. Além de danos econômicos, a contaminação na cadeia alimentar
por micotoxinas, pode levar em longo prazo, um considerável impacto social, devido ao
comprometimento da saúde humana.
3
Quadro 1: Principais organismos produtores de micotoxinas; principais micotoxinas; principais substratos de
ocorrência dos fungos produtores de micotoxinas; principais regiões de ocorrências de micotoxinas;
temperaturas e atividade da água idéias para a produção de micotoxina pelo fungo responsável; e efeito
toxigênico das micotoxinas. Fonte: http://apavic.com/html/sections/articulo/art_Alltech.asp; http://fao.org/;
Diário
Oficial
de
las
Comunidades
Europeas
–
08/04/1999,
http://www.exopol.com/general/circulares/84circ.html. Cast, 2003; Lahlali et al., 2005; Magan, 2006; Ramirez
et al., 2006.
ORGANISMO
Aspergillus
flavus,
Aspergillus
parasiticus,
Aspergillus
pseudotamarii,
Aspergillus
nomius
Fusarium
moniliforme,
Fusarium
proliferatum,
Fusarium
anthophillum,
Fusarium
globosum
Gibberella
moniliformes
Fusarium
graminearum,
Fusarium
culmorum,
Fusarium
crookwellense,
Fusarium
sporotrichioides,
Fusarium poae
MICOTOXINA
SUBSTATO
OCORRÊNCIA
Aflatoxinas
(B1, B2, G1 e
G2)
Amendoim,
milho,
castanhas,
amêndoas,
semente de
algodão, frutos
frescos e
secos, arroz
parboilizado,
leite e seus
derivados.
Milho, cevada,
aveia, trigo e
cereais
Fumonisina
TO e AW
EFEITO TOXIGÊNICO
América Latina,
África, Ásia, partes
da Austrália e dos
Estados Unidos
0.97 – 0.99 aw.
TO a 25°C.
Ocorre
preferencialmente
nos trópicos e
subtrópicos
Imunológico, hematopoético,
hepatóxico, nefrotóxico,
teratogênico, carcinôgeno.
Reduz a produção e o
crescimento dos animais.
África, China
Argentina, Brasil,
França, Indonésia,
Itália, Filipinas,
Polônia, Tailândia,
Estados Unidos.
0.98 – 0.93 aw.
TO entre 22 28°C.
Ocorre tanto em
climas temperados
como em tropicais.
Hepatóxico, nefrotóxico,
carcinogênico.
Causa edema pulmonar em
eqüinos e suínos, e
suspeita-se de provocar
câncer de esôfago em
humanos.
Europa, EUA,
China, Nova
Zelândia, Japão,
Canadá, Israel e
Coréia.
0.98 – 0.995 aw.
TO entre 20 25°C.
Ocorre em regiões
frias e úmidas.
Imunológico, hematopoético,
nefrotóxico, neurotóxico,
dermonecrótico.
Causa hemorragias,
diarréias e vômitos
prolongados em animais.
Rações com 5% de
contaminação é suficiente
para provocar recusa das
mesmas pelos animais.
EUA, Canadá e
Europa.
0.950 – 0.995 aw.
TO a 25 °C.
Ocorre em regiões
mais frias e
úmidas.
Teratogênico.
Em porcos, afeta o sistema
reprodutivo e em humanos
há suspeitas de ser
cancerígeno.
Balkãs, Europa
Central, Suécia,
Dinamarca, Itália,
Reino Unido,
Canadá, EUA e
parte da América do
Sul.
0.96 – 0.98 aw.
TO entre 25 30°C.
Em Penicillium TO
varia entre 10 –
25°C.
Ocorre em regiões
com climas
temperados e
tropicais.
Imunológico, nefrotóxico,
teratogênico, carcinogênico,
hepatóxico.
0.890 – 0.980 aw.
TO entre 5 –
25°C.
Ocorre em regiões
frias e úmidas.
Tricotecenos
(Deoxinivalenol,
nivalenol, Toxina
T2).
Trigo, milho,
aveia e
cevada.
Zearalenona
Milho, sorgo,
aveia, cevada
e trigo.
Ocratoxina A
Cevada, trigo,
alfafa, canade-açúcar,
milho,
amendoim,
café, arroz,
frutas secas e
vinhos.
Penicillium
expansum
Penicillium
griseofulvum
Patulina
Frutas como
maçã, peras e
uvas, vegetais
e cereais.
Turquia, Portugal e
Bélgica
Claviceps
purpurea
Ergotamina
Centeio e grãs
em geral
Estados Unidos,
Brasil, Europa
Central
TO entre 24 30°C.
Penicillium
citrinum,
Penicillium
expansum
Citrinina
Trigo, aveia,
cevada, milho,
arroz
Sudeste dos
Estados Unidos
0.775 aw.
TO a 30°C.
Fusarium
graminearum,
Fusarium
culmorum,
Fusarium
crookwellense,
Fusarium
sporotrichioides
Aspergillus
ochraceus,
Penicillium
verrucosum,
Penicillium
cyclopium
TO – Temperatura Ótima; AW – Atividade da água.
Carcinogênico e
mutagênico. Irritante para o
estômago, causando
náuseas e vômitos. Em
bovinos causa hemorragia
no trato digestivo.
Vasoconstrutor, gangrena
de extremidades,
neurotóxico.
Vasodilatador,
broncoconstrutor,
Nefrotóxico, causando dano
renal.
4
1.2 Aflatoxinas
O termo “aflatoxina” foi primeiro descrito em 1960, devido à morte de centenas de
perus, patos e outros animais domésticos, atribuído a presença de toxinas de A. flavus na
ração importada da América do Sul. Desde então, aflatoxinas têm sido apontadas como o
grupo mais importante de micotoxinas, devido a sua alta toxicidade, suas propriedades
hepatocarcinogênicas e sua ocorrência comum em diferentes alimentos, sendo produzidas
por fungos do gênero Aspergillus como A. flavus, A. niger e A. parasiticus (FAO, 2003). A
IARC (International Agency for Research on Cancer) tem designado a aflatoxina como um
cancerígeno do fígado humano.
Os sintomas da intoxicação por aflatoxina podem ser agudos ou crônicos. Na
toxicidade aguda as aflatoxinas promovem no fígado a infiltração de lipídeos nas células
hepáticas, implicando em necroses ou morte de células do fígado. Metabólitos de aflatoxinas
atuam inibindo a síntese protéica e lipídica, além de diminuir o metabolismo de glicose. Ao
mesmo tempo em que reduzem as funções do fígado, promovem desordem no mecanismo
de coagulação do sangue. Provocam ainda, edema nas extremidades inferiores, dores
abdominais e vômito.
Os sintomas crônicos da ingestão da aflatoxina no organismo animal pelo consumo de
rações contendo farelo de milho ou qualquer outro alimento contaminado, quando exposto
por longos períodos a dosagens de concentrações baixas a médias, vão desde
hemorragias, cirrose e necrose do fígado, rins hemorrágicos e congestionados até o câncer
do fígado ou hepatite, causando redução no desempenho e desenvolvimento do animal, de
maneira que só será percebida em estágios elevados (Hussein & Brasel, 2001).
A ingestão de aflatoxinas por animais produtores de leite, não só reduz a produção,
como também transfere de 1 a 3% da toxina ingerida para o leite e, por conseguinte, passa
para os derivados do leite. O efeito da aflatoxina é mais danoso em animais estressados,
subnutridos e em estados de convalescença (Fonseca, 2008).
Aflatoxinas compõem um grupo exclusivo de compostos heterocíclicos e altamente
oxigenados. Existem duas formas principais, chamadas B e G, derivadas da nomenclatura
das cores de fluorescência “blue” e “green” que são produzidas quando iluminadas com luz
U.V. em placas de cromatografia de camada delgada. Estas formas são subdivididas em B1,
B2, G1 e G2 com base na sua fluorescência, sendo que a aflatoxina B1 é reconhecida como a
mais tóxica, devido a seu alto potencial hepatocarcinogênico (Edwards et al., 2002). Outras
formas da família da aflatoxina são M1 e M2, que são formas oxidadas da aflatoxina B1
modificadas no trato digestório de alguns animais e isoladas no leite, urina e fezes (Yu et al.,
2002). A exposição à aflatoxinas ocorre por inalação e ingestão, com risco aumentado nas
5
fases de colheita, trilha, ensacamento, limpeza e armazenamento. Em seu estado seco, as
aflatoxinas são bastante estáveis, resistentes a temperaturas acima do ponto de ebulição,
entretanto, na presença de umidade e a elevadas temperaturas ocorre a sua destruição.
No Brasil, o Ministério da Saúde estabelece através da Resolução nº 34, de 19 de
janeiro de 1977, da Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos, o limite
máximo de 30ppb (partes por bilhão) para o somatório das aflatoxinas dos tipos B1 e G1
encontradas em alimentos em geral, como a castanha-do-Brasil. Além desta Resolução,
outra legislação brasileira também estabelece parâmetros para a presença de aflatoxinas
em alimentos. O Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária, através
da Portaria nº 183, de 21 de março de 1996, adotou como válida, a Resolução do Grupo
Mercado Comum do Sul – MERCOSUL nº 56, de 01 de janeiro de 1995, que estabelece o
limite de 20ppb para o somatório das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 em amendoim e milho.
Apesar de mais rigorosa, essa Portaria não pode ser utilizada para produtos
industrializados, sob responsabilidade do Ministério da Saúde, pois como foi internalizada
apenas pelo Ministério da Agricultura, ela é aplicável apenas para produtos in natura
(Inmetro, 2008). O limite estabelecido para a presença de aflatoxinas em ração animal é o
somatório das aflatoxinas resultando em 50ppb. Para o leite, o limite estabelecido é de
0,05ppb para aflatoxina B1 e 0,5ppb para o somatório das aflatoxinas. Em exportações, os
limites seguem as legislações estabelecidas pelo país importador. Por exemplo, a União
Européia estabelece limites para a exportação de castanha-do-Brasil de 2ppb para
aflatoxina B1 e 4ppb para o somatório das aflatoxinas. Atualmente as aflatoxinas são bem
descritas pela literatura devido a sua alta incidência em grãos.
1.3 Grãos brasileiros
Apesar da grande produção agrícola, o Brasil, é um dos principais países que tem
grande porcentagem de seus produtos contaminados por aflatoxinas devido às formas
inadequadas de manejo e baixo valor agregado ao produto, o que impossibilita a melhoria
de técnicas de manejo. Exemplos de grãos contaminados são dados por Da Silva et al.
(2000) que mostram em estudo a micobiota de 140 amostras de sorgo coletados no Brasil,
entre estas estavam 10 amostras de sorgo recém colhido e 130 amostras de sorgo
armazenado. Foram analisados os níveis de contaminação detectados de aflatoxina e
fumonisina nos grãos, assim como, fatores abióticos, como conteúdo de umidade do grão,
atividade da água, temperatura, umidade relativa, e pluviosidade média na hora da colheita.
O estudo mostrou uma predominância do gênero Phoma (57,1%), Aspergillus (42,7%),
Fusarium (25%), e Rhizopus (21,4%), e a presença de outros nove fungos filamentosos. No
6
total de amostras analisadas, 12,8% estavam contaminadas com aflatoxina B1 com
concentração variando entre 7 a 33 mg/kg e 74,2% contaminadas com fumonisina B1 com
concentração variando entre 0,11 a 0,15 mg/kg.
Vargas et al. (2001) correlacionam a presença de aflatoxinas (B1, B2, G1, e G2),
zearalenona e fumonisinas (B1) em 214 amostras de milho não processadas coletadas em
diferentes regiões do Brasil em colheitas entre os anos de 1997 a 1998. Foram encontradas
aflatoxina B1 em 38,3%, zearalenona em 30,4%, e fumonisina B1 em 99,1% das amostras,
onde os níveis de toxina variaram de 0,2 a 129, 36,8 a 719, e 200 a 6100 mg/kg,
respectivamente. A co-ocorrência de duas micotoxinas carcinogênicas, aflatoxina B1 e
fumonisina B1 foi observada em 100% de todas as amostras contaminadas por aflatoxina
(82 amostras). Co-ocorrências de aflatoxina B1, zearalenona, fumonisina B1 foram
encontradas em 18 amostras, enquanto aflatoxina B1, aflatoxina B2, fumonisina B1 foram
encontradas em 43 amostras.
Caldas & Silva (2007) analisaram dez diferentes produtos derivados do milho
comercialmente vendidos no Distrito Federal, no Brasil, quanto à presença das micotoxinas
fumonisinas (FB1 e FB2) e aflatoxinas (B1, B2, G1, and G2). A partir de 208 amostras
analisadas, 80,7 e 71,6% tiveram níveis quantificáveis de FB1 e FB2, respectivamente, por
CLAE. Os níveis do total de fumonisinas (FB1 + FB2) variaram de 0,127 mg/kg para flocos de
milho até 2,04 mg/kg para creme de milho. Não foram detectadas fumonisinas nas amostras
de milho fresco analisadas. Das 101 amostras analisadas, não foram detectadas aflatoxinas
por CCD.
Gonçalez et al. (2008) que demonstram em um trabalho análises da microbiota e
contaminação por micotoxinas em amendoins coletados em diferentes estágios de
maturação em Junqueirópolis, no Estado de São Paulo, Brasil. A microbiota encontrada foi
de Fusarium spp. e A. flavus, encontrados em 26% e 17% respectivamente, das amostras
analisadas. Das analises realizadas por CLAE (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência),
estavam presentes aflatoxinas e ácido ciclopiazônico em alta incidência, sendo detectado
em 32% das amostras. As concentrações foram de 4,20 mg/kg (ppm) a 198,84 mg/kg (ppm)
de aflatoxinas, e de 260 mg/kg a 600 mg/kg de ácido ciclopiazônico. Fumonisinas não foram
detectadas por CLAE. Os resultados correlacionam com a grande dispersão de ocorrência
de fungos.
1.3.1 Castanha-do-Brasil (Castanha do Pará)
A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K.), também conhecida como
castanha-do-pará, é o fruto de uma das árvores mais altas e importantes da floresta
7
Amazônica. Possui ocorrência em todo o Estado nativo da região amazônica, sendo os
Estados do Acre, Amazonas, Amapá, Rondônia e Pará os principais produtores brasileiros.
A castanha-do-Brasil é o primeiro produto extrativista em importância para as comunidades
que vivem na Amazônia, onde só o Brasil no ano de 2008, produziu mais de 29 mil
toneladas de castanha, das quais mais de 13 mil toneladas foram exportadas para Europa e
Estados Unidos, gerando recursos na ordem de 20 milhões de dólares (IBGE, 2007,
CONAB, 2009). Atualmente, o Brasil é o segundo país que mais exporta a castanha-doBrasil, sendo a Bolívia o maior exportador do mundo.
Por ser um produto do extrativismo, o qual emprega cerca de quatro mil famílias, as
práticas de manejo da espécie são precárias, com os ouriços sendo abertos na floresta, o
que permite a contaminação do produto por fungos e coliformes. Ainda no local da coleta, as
castanhas boas são separadas das murchas por imersão em água (geralmente de um
igarapé), aumentando a contaminação devido ao aumento de umidade da castanha. Os
problemas agravam-se com os manejos subseqüentes, como armazenamento, transporte,
entre outros.
A escassez de melhoria tecnológica tem provocado a estagnação ou a involução de
setores agrícolas e extrativistas. É urgente a necessidade de melhoria do manejo, coleta,
beneficiamento, empacotamento e armazenamento da espécie, ressaltando que a
manutenção do baixo teor de umidade em todas as fases é fundamental para um produto de
melhor qualidade, principalmente por tratar-se de um produto de exportação. O Brasil corre
o risco de perder mercado para os produtos de origem boliviana e peruana, produtos dos
quais, entidades norte-americanas e européias estão investindo em tecnologias nos setores
extrativistas. Perdas anuais da castanha-do-Brasil por micotoxinas em países em
desenvolvimento, como o Brasil, além de provocar uma redução na economia do país
devido a não aceitação dos produtos que excedem os limites regulamentares de
micotoxinas pelo mercado estrangeiro, são vendidos no mercado interno, o que aumenta o
risco de contaminação por micotoxinas pela população brasileira.
1.3.2 Amendoim
O amendoim cultivado (Arachis hypogaea L.) cobre uma área mundial de 25,5 milhões
de hectares com uma produção global de mais de 47 milhões de toneladas no ano de 2006
(FAO, 2008). É uma das seis principais culturas oleaginosas crescidas em todo mundo,
sendo uma importante fonte de proteína vegetal comestível (FAO, 2008). O gênero Arachis
tem seu centro de origem na América do Sul, mas a maior produção da cultura encontra-se
na Ásia (66,8%) e África (24,6%). Já no Brasil, o amendoim é produzido em todo o território
8
brasileiro principalmente em regiões semi-áridas. Cobre uma área de mais de 115 mil
hectares, chegando a produzir cerca de mais de 300 mil toneladas no ano de 2008
(Agrianual, 2009), onde mais de 50 mil toneladas são exportadas e/ou destinadas para a
indústria de alimentos (Embrapa, 2008). No nordeste do Brasil, onde a produção é
tipicamente de agricultura familiar e sujeita às típicas variações no regime de chuvas, o
amendoim é mais suscetível à contaminação por aflatoxina na etapa de pré colheita. A
contaminação por fungos produtores de aflatoxinas são responsáveis por perdas de até 50%
em cultivares não resistentes em todo o mundo (Meena et al., 2002).
1.3.3 Castanha de caju
A castanha de caju (Anacardium occidentale L.) possui uma enorme importância
sócio-econômica no Brasil, especialmente nos estados do Nordeste. A cultura dos cajueiros
ocupa uma área de 700 mil hectares, produzindo 266 mil toneladas e gerando recursos da
ordem de 190 milhões de dólares no ano de 2007 (Agrianual, 2008), oferecendo
aproximadamente 100.000 empregos diretos e indiretos (Paula Pessoa et al., 1995). Seu
principal produto é a amêndoa processada, que é exportada principalmente para os EUA,
Canadá e Europa (Agrianual, 2008; FAO, 2009), sendo o Brasil responsável por 30% de
toda castanha de caju exportada para o mundo (SECEX, 2004).
Os estudos desenvolvidos pela equipe responsável da Embrapa Agroindústria
Tropical confirmam a presença de diversos tipos de fungos associados à deterioração das
amêndoas. O processo de infecção inicia ainda no campo, na pré-colheita, agravando-se
durante o armazenamento, que é feito em locais com elevada umidade e temperatura. A
temperatura ideal de 37ºC favorece preferencialmente o Aspergillus em vez de outros
gêneros, facilitando o movimento dos conidiósporos. Muitos metabólitos, incluindo a
aflatoxina G2, já foram confirmados em amêndoas de cajueiros no Brasil (Freire et al., 1996).
Cerca de 10% das castanhas que chegam às indústrias de processamento são desprovidas
de amêndoas, as quais foram destruídas devido a ataque de fungos. Dos 90% restantes,
apenas a metade apresenta condições para a exportação após o processamento (Pinheiro,
2004).
Devido às condições precárias de manejo, colheita, armazenamento e entre outros, é
notória a preocupação dos exportadores brasileiros quanto à ocorrência de micotoxinas nas
castanhas exportáveis. Para conferir a boa qualidade da castanha, antes da exportação,
análises cromatográficas são realizadas por laboratórios credenciados pelo MAPA
(Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento). Entretanto, devem ser considerados
possíveis resultados negativos quanto à presença de micotoxinas quando o produto sai do
9
Brasil, porém ao chegar ao destino final, o carregamento pode apresentar resultados
positivos, acarretando em sérios prejuízos aos exportadores, os quais se vêm na obrigação
de recolher o carregamento de volta ao país de origem e ao pagamento de multas
contratuais. Isto ocorre porque durante o transporte, normalmente por via marítima, as
condições se tornam favoráveis ao desenvolvimento de fungos produtores de toxinas, que
passam despercebidos durante as análises (Freire et al., 1996).
1.4 Contaminação por Aspergillus flavus
A. flavus é um fungo patogênico de várias espécies de plantas e animais, podendo
infectar sementes de milho, amendoim, árvores de castanhas, animais domésticos e até
humanos. A contaminação do A. flavus depende da espécie do hospedeiro, onde a
contaminação pode ser em forma de micélio ou como esclerócitos, que germinam para
produzir hifas adicionais ou produzem os conídios (esporos assexuados), podendo ser
dispersos no solo e ar (figura 1). Esses esporos são, então, transportados, por insetos ou
vento, para a planta hospedeira onde ocorre a germinação e proliferação do fungo (figura 2).
Embora a presença de insetos não seja necessária para a contaminação por A. flavus, a
presença deles aumenta o nível de contaminação e leva à produção de altos níveis de
aflatoxina, que em grande parte, está associado a lesões da cultura pelo aumento de
contaminação por A. flavus (Center for Integrated Fungal Research, 2008).
Duas
condições
importantes
para
infecções
por
A.
flavus
significativas
e
contaminações por aflatoxina são a temperatura e umidade, onde altas temperaturas e
estresse hídrico (15-32%) levam a altos níveis produção de aflatoxina pelo A. flavus (Payne,
1998). A temperatura do ambiente está relacionada tanto com a reprodução e crescimento
(12-48°C), tendo uma temperatura ótima de 37°C, quanto com a produção de aflatoxinas
(25-30°C) pelo A. flavus (Klich et al., 1994). Essa habilidade de se manter em substratos
com estresse hídrico favorece o crescimento de A. flavus sob outros fungos, o que aumenta
a sua contaminação.
10
Figura 1: Ciclo de vida de Aspergillus spp. (figura a esquerda), e Penicillium spp. (figura a direita)
(Adaptado de Dube, 1990 in FAO, Barley Post-Harvest Operation: Chapter 4
(http://www.fao.org/inpho/content/compend/text/ch31/ch31_04.htm)
Figura 2: Ciclo de vida do fungo A. flavus em cultura de milho (Adaptado de
http://www.aspergillusflavus.org/).
11
1.5 Sistemas de controle de micotoxinas
A detecção de alimentos contaminados com micotoxinas constitui o primeiro passo
contra a intoxicação. O controle de micotoxinas é um processo complexo, compreendendo um
programa de controle de qualidade integrado por toda a cadeia de produção, uma vez que a
contaminação por micotoxinas vai desde os estágios da colheita até a pós-colheita. Para
proteger a saúde pública, os governantes têm implantado diferentes tipos de procedimentos de
controles, incluindo um parâmetro de limites de micotoxinas permitido, como descrito
anteriormente. Entretanto, parâmetros estritos como o da União Européia, levam países
Africanos à perda de US$ 670 milhões a cada ano por perdas na exportação (Salay, 2003).
Em 2001 (http://www.agricultura.gov.br/) no Brasil o Ministério da Agricultura, Pecuária
e Abastecimento instituiu esforços para promover um melhor controle e monitoramento em
todo o sistema alimentar. O novo programa integra atividade de acompanhamento, controle,
inspeção e acompanhamento de contaminantes, concordando com as normas da HACCP
(Hazard Analysis and Critical Control Points).
O HACCP (Hazard Analysis and Critical Control Points) é definida pelo NACMCF
(National Advisory Committee on Microbiological Criteria for Foods) como um processo
sistemático para ser usado na produção de alimentos como uma forma de prevenção da
ocorrência de contaminações, e assim, garantir a sua inocuidade, apoiando o seu uso pela
indústria e agências governamentais de inspeção e controle (National Advisory Committee
on Microbiological Criteria for Foods, 1998). O conceito básico da HACCP é a prevenção e
não inspeção do produto terminado, onde os agricultores, pessoas encarregadas do
manuseamento, distribuição, e o consumidor, devem possuir toda a informação dos
procedimentos relacionados ao alimento, tornando possível a identificação do local onde
uma hipotética contaminação possa ter ocorrido e determinação para evitá-la (Segurança
alimentar, 2008).
O HACCP consiste de sete princípios: 1. Efetuar uma análise em todo o processo de
produção alimentar e identificar as medidas preventivas; 2. Identificar os pontos críticos de
controle (PCCs) onde os perigos possam ser controlados e eliminados; 3. Estabelecer
limites críticos para as medidas preventivas associadas com cada PCC; 4. Estabelecer os
requisitos de controle (monitoramento) dos PCCs. Estabelecer procedimentos para a
utilização dos resultados do monitoramento para ajustar o processo e manter o controle; 5.
Estabelecer ações corretivas para o caso de desvio dos limites críticos; 6. Estabelecer
procedimentos de verificação para verificar se o sistema está funcionando adequadamente
7. Estabelecer um sistema para registro de todos os controles. Esses princípios são
aplicáveis a todas as fases da produção de alimentos, incluindo a agricultura básica,
pecuária, industrialização e manipulação dos alimentos, serviços de alimentação coletiva,
12
sistemas de distribuição e manuseamento e a utilização do alimento pelo consumidor
(Segurança alimentar, 2008).
Figura
3:
Esquema
dos
sete
princípios
http://www.fehd.gov.hk/safefood/library/haccp/2.html).
do
HACCP
(Adaptado
de
1.5.1 Diagnose morfológica de fungos micotoxigênicos
Dentre os critérios estabelecidos pelo HACCP, a diagnose e detecção de espécies
de fungos que produzem micotoxinas estão associadas ao monitoramento alimentar, onde
existem diversas formas de diagnose e detecção de fungos micotoxigênicos. Uma delas é a
identificação morfológica, no entanto através desta análise não há diferenciação de fungos
aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos. A. flavus e A. parasiticus são as espécies de fungos
micotoxigênicos mais importantes devido ao seu potencial para produção de aflatoxinas em
diferentes sistemas biológicos. São fungos que produzem ramificações filamentosas em seu
crescimento, denominadas hifas, as quais muitas vezes são chamadas de moldes. Uma
rede de hifas conhecida como micélio secreta enzimas que quebram complexas fontes
alimentares, onde pequenas moléculas resultantes são absorvidas pelo micélio que irão
gerar energia para o desenvolvimento do fungo. Ao olho nu, não é possível observar as
13
hifas individuais, mas densos tapetes de micélios e conídios (esporos assexuados) muitas
vezes podem ser vistos (Cast, 2003).
A morfologia do A. flavus apresenta colônias com diâmetro entre 4,0 - 4,5cm,
possuindo as colônias uma coloração amarelo-verde e tornando-se verde à medida que a
colônia vai envelhecendo. A cabeça é radial, transformando-se com o tempo colunar, a
vesícula é oval possuindo toda a superfície fértil. As hastes são longas e rugosas, e as
métulas são pequenas. As filíades são pequenas e ampuliformes, os conídios é globuloso a
subglobuloso, normalmente áspero e amarelo-verde. Enquanto que a morfologia do A.
parasiticus possui colônias entre 3,2 – 3,5cm de diâmetro, variando entre amarelo-verde e
verde escuro à medida que vai envelhecendo. A cabeça é radial, com hastes longas e
ásperas, e vesícula globulosa sendo fértil em toda a sua superfície. Quase não se observa a
presença de métulas. As filíades são ampuliformes com longas e amplas terminações. Os
conídios são globulosos, bastante ásperos, quase sempre mostram tecido de conectividade
(Singh et al., 1991). Por ser uma metodologia lenta e que não estipula a presença de
aflatoxinas, a diagnose morfológica atualmente está em desuso para análises laboratoriais
de produtos para exportação.
Colônia entre 4–
4,5cm de diâmetro.
Cor: amarelo
esverdeado
Verso das
colônias
Conídio
Conídios imaduros
Filíade
Conídios maduros
Cabeça do
conidióforo
Conídiósporos
Haste
e
d
Figura 4: a) colônias de A. flavus; b) verso das colônias da placa a; c) conídios maduros e imaduros;
d) cabeça conidial mostrando a haste rugosa, visícula oval e filíades pequenas e ampuliformes
nascidas direto da vesícula; e) conídios (Singh et al., 1991).
14
Verso das
colônias
Colônias entre
3,2 – 3,5cm de
diâmetro
Conídio
Filíade
Cabeça do
conidióforo
Conídiósporos
Haste
d
c
Figura 5: a) colônias de A. parasiticus; b) verso das colônias da placa a; c) conídios maduros; d)
cabeça conidial mostrando a haste áspera, cabeça radial e filíades (Singh et al., 1991).
1.1.1 Detecção cromatográfica de micotoxinas
Uma ferramenta bastante rotineira para medidas de controle de qualidade em
castanhas e amêndoas são as análises cromatográficas que incluem a metodologia para
detecção das toxinas por CCD (Cromatografia de Camada Delgada) e CLAE (Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência). Ambas as metodologias são rotineiramente utilizadas em
produtos para a exportação por laboratórios credenciados pelo MAPA (Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento).
A CCD é uma metodologia de cromatografia utilizada para separar componentes
químicos por polaridade, possibilitando a identificação das toxinas específicas e suas
concentrações por comparação visual da intensidade dos pontos de interesse do padrão de
análise. A técnica envolve duas fases, a estacionária e a líquida, a fase líquida é absorvida
por capilaridade pela fase estacionária, separando os compostos em questão. O CCD é uma
metodologia que tem uma grande versatilidade para o uso de solventes, porém as análises
realizadas por essa técnica são demoradas, o que dificulta o uso da técnica para conduzir
testes de grande porte, como alimentos de exportação e importação. Além das análises
serem lentas, a CCD não detecta concentrações de aflatoxinas menores do que 5 ppb, o
que torna a técnica menos precisa (Lin, et al., 1998).
15
Outra metodologia muito utilizada pelos laboratórios credenciados pelo MAPA
(Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento) que realizam análises de alimentos no
Brasil para a detecção de aflatoxinas é a análise por CLAE. Esta análise consiste em uma
coluna com uma matriz, por onde a amostra passa e separa componentes e contaminantes
diferentes estruturalmente relacionados de acordo com a escolha da matriz, que ao contrário
da CCD, a CLAE mostra ser mais eficiente e rápida, por sua eficiência em separar e
quantificar as toxinas em baixas concentrações, variando entre 0 a 320ppb (Chu, 1992). A
metodologia de CLAE utilizada para a detecção de aflatoxinas é específica. Esta consiste na
utilização de clunas de imunoafinidade específicas para aflatoxinas na extração e
purificação do extrato em análise.
Tanto a CLAE quanto a CCD são duas técnicas de detecção cromatográficas muito
utilizadas em laboratórios de análises micotoxicológicas. No Brasil, as análises de alimentos
são realizadas por laboratórios credenciados pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária
e Abastecimento), Ministério da Saúde, Inmetro, ANVISA, entre outros órgãos responsáveis
pela fiscalização de grãos (Figura 6). Atualmente não se sabe a porcentagem dos produtos
agrícolas que são consumidos pelo mercado interno que passam por análises laboratoriais,
por isto novos métodos utilizados como preventivos para a detecção de fungos produtores
de aflatoxinas são importantes para HACCP, e saúde humana e animal.
16
LABORATÓRIO CENTRAL DO
DISTRITO FEDERAL-LACEN-DF
1.
2.
3.
LACQSA (MAPA)
Ministério da Agricultura
FUNDAÇÃO EZEQUIEL
1.
2.
CTAA/EMBRAPA
INCQS/FIOCRUZ
TECPAR (MAPA)
1.
2.
3.
LAMIC – UFSC (MAPA)
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DO
RIO GRANDE-Lab. Micotoxinas
CENTRO DE DIAGNÓSTICO E
PESQUISA EM PATOLOGIA
AVIÁRIA-CDPA
UNIVERSIDADE
FEDERAL DE
SANTA
CATARINA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Grãos & Alimentos (MAPA)
JLA Brasil (MAPA)
SFDK (MAPA)
SGS do Brasil (MAPA)
CERELAB (MAPA)
LAN/ESALQ/USP (MAPA)
ITAL-ANALI (Anvisa)
Instituto de Ciências BiomédicasUSP
E.S.A. LUIZ DE QUEIROZ-USP
INSTITUTO ADOLFO LUTZ
FACULDADE DE ENGENHARIA
DE ALIMENTOS-UNICAMP
FACULDADE DE CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS–UNESP
INSTITUTO DE TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS-ITAL
Figura 6: Localizações de laboratórios credenciados pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento), ANVISA, e outros (http://www.micotoxinas.com.br/laboratorios.html)
1.5.2 Diagnose Imunológica de micotoxinas
O método ELISA (Enzyme linked immune-sorbent assay) é baseado na abilidade de
um anticorpo específico de distinguir a estrutura tridimensional de uma micotoxina
específica. Esse método é freqüentemente utilizado em análises de detecção de
micotoxinas. É baseado na extração da micotoxina presente em grãos por um solvente, e
ligação de uma porção da amostra extraída a uma enzima. Em seguida o conjugado
enzima-micotoxina são adicionados à microplacas com poços revestidos de anticorpos
possibilitando a competição antígeno-anticorpo. Os poços são então lavados e um substrato
é adicionado para reação de coloração. A intensidade da cor é medida por absorbância
(Zheng et al., 2006).
Por ser um método rápido e econômico, diversos autores têm descrito a técnica
como uma alternativa na diagnose de micotoxinas. Como exemplo, Chun et al., 2007 com
17
intuito de monitorar nozes e derivados comercializados no Sul da Coréia, utilizaram ELISA
para uma diagnose rápida e CLAE-MS para quantificação e confirmação da presença de
aflatoxina. Do total de 85 amostras, 31 mostraram leituras para possível contaminação,
porém somente em 9 amostras foram confirmadas a presença de aflatoxina variando em
vários níveis acima de 28,2 μg/kg. O trabalho mostra que apesar da técnica de ELISA ser
uma diagnose rápida para aflatoxinas, métodos de cromatografia como CCD e CLAE ainda
são necessários para a confirmação de produtos possivelmente contaminados.
Reddy et al., 2009 também analisaram por meio de ELISA de competitividade
indireta 1200 amostras de arroz coletadas em 20 Estados da Índia. A. flavus mostrou uma
contaminação dominante em todas as amostras. Outras contaminações predominantes
foram de A. Níger, A. ochraceus e A. parasiticus. Aflatoxina B1 foi detectada em 67,8% das
amostras variando entre 0,1 a 308 μg/kg. Todas as amostras coletadas a partir de
armazenamento ao ar livre, expostas à chuva e que possuíam 1 ano de armazenamento
apresentaram aflatoxina B1.
Outra técnica aplicada a diagnose imunológica de micotoxinas é a PCR-ELISA. Essa é
uma técnica onde produtos de PCR são hibridizados a uma sonda fluorescente de captura
imobilizada. Essa reação possibilita quantificar seqüências internas do produto de PCR,
sendo uma alternativa mais econômica que a PCR em tempo real, além de possibilitar
analise de múltiplas seqüências em um curto período de tempo.
Estudos feitos utilizando a PCR-ELISA têm apresentado grande potencial para distinção
de produtores e não produtores de micotoxina, como descrito por Grimm & Geisen, 1998 o
qual usaram nove isolados de Fusarium produtores e não produtores de fumonosinas em
PCR ELISA com 2 primers específicos para produtor de fumonosina e uma sonda marcada
com biotina no final 5’ para produtor de fumonosina. As reações de PCR usando primers
específicos não mostraram que as reações foram absolutamente específicas, ocorrendo
alguns resultados positivos para não produtor de fumonosina. Porém a PCR-ELISA
apresentou resultados positivos para todos os outros isolados testadas pela PCR
convencional que tiveram resultados negativo.
1.5.3 Diagnose molecular de fungos micotoxigênicos
A reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) permite a amplificação de segmentos
específicos a partir de amostras de DNA. O resultado da PCR pode ser observado via
eletroforese, onde os produtos da PCR são separados por tamanho de fragmento em géis
de agarose. A reação de PCR ocorre basicamente pela desnaturação inicial da dupla fita de
DNA e anelamento do primer, oligonucleotídeos com aproximadamente 20 a 30pb que
18
anelam em regiões alvo do DNA. Após o anelamento do primer, ocorre a síntese do
fragmento pela ação da DNA polimerase. O produto da PCR (Polymerase Chain Reaction) é
sintetizado exponencialmente nos seguintes ciclos repetitivos da reação.
Uma das principais vantagens do método de PCR sobre os demais métodos de
detecção de micotoxinas é que o mesmo é capaz de detectar DNA de células fúngicas vivas
ou mortas, possibilitando a detecção de fungos produtores de micotoxinas em diferentes
amostras, por longos períodos. Além disso, como a PCR indica a presença do DNA do
organismo produtor da micotoxina, e não da toxina em si, um resultado positivo indica não
apenas a potencial ocorrência de micotoxinas naquele momento, mas também em
curto/médio prazo, podendo o fungo ser identificado independente do estágio do
desenvolvimento. Isto é de vital importância no caso de produtos de exportação, os quais
são freqüentemente testados e certificados como livres da toxina ao sair do país, mas
apresentam resultados positivos quando atingirem seu destino, devido à toxina ser
produzida durante o tempo de viagem ou armazenamento do produto. Outra vantagem é
que a PCR substitui o tempo de análises microbiológicas por amplificações de marcadores
específicos do genoma em vez de crescer o organismo, o que demoraria dias, pela técnica
de PCR, demoraria horas (Niessen, 2008).
O método de PCR, portanto oferece uma alternativa rápida, relativamente barata e
segura para a análise da contaminação de uma amostra por fungos produtores de
micotoxinas. Este método possibilitará, por exemplo, que lotes positivos sejam tratados com
fungicidas, por exemplo, o benomil, de forma a eliminar o fungo produtor da toxina, portanto
evitando o risco de futura contaminação. Além disso, a PCR possibilita a identificação das
fontes de contaminação nas diversas etapas da produção, transporte e armazenamento.
No contexto do sistema HACCP, novas técnicas utilizando o método de PCR para a
identificação de fungos micotoxigênicos é de grande importância para o sistema de controle de
qualidade do alimento, pois pode identificar o fungo produtor de aflatoxinas em qualquer
estágio de produção do alimento, onde ações corretivas serão estabelecidas imediatamente
com maior eficiência, garantindo a qualidade do alimento. Este método também pode ser
utilizado como teste preliminar em um grande número de amostras, sendo que um resultado
negativo eliminará a necessidade de se realizar testes cromatográficos. Já a ocorrência de um
resultado positivo, indicará que a amostra potencialmente contém o fungo produtor de
micotoxinas, de forma que as mesmas poderão ser submetidas aos testes cromatográficos,
para confirmação.
Desta forma, a análise poderá em alguns casos, passar de dias para horas. Além de
ser uma diagnose relativamente rápida, o método de PCR também é muito sensível para a
detecção da presença do fungo produtor de micotoxinas, detectando a presença do DNA do
organismo a uma concentração entre picogramas (pg) e fentogramas (fg) por microlitro (μl)
19
de reação, como descrito por Midorikawa et al. (2008). Neste trabalho um conjunto de
primers desenvolvidos especificamente para a região ITS do DNA ribossomal de A. flavus,
mostrou especificidade até o limite de 10fg. Já Bufflier et al. (2007), utilizaram microarranjos
de oligonucleotídeos obtidos a partir de seqüências do gene da calmodulina mostrou
especificidade para A. carbonarius, A. japonicus, A. aculeatus e A. ibericus em um limite de
especificidade de até 3,2pg de DNA.
Bluhm et al. (2004) utilizaram um sistema de PCR em tempo real, para a detecção de
isolados de Fusarium spp. produtores de tricotecenos e fumonisinas, e identificação de
Fusarium graminearum e Fusarium verticillioides coletados em amostras de milho. Os
primers e sondas foram desenvolvidos a partir de seqüências dos genes TRI6 e FUM1
envolvidos na biossíntese de micotoxina, e de seqüências da região do DNA ribossomal de
Fusarium, como controle positivo interno para o gênero. O sistema de PCR em tempo real
mostrou ser específico a um limite de detecção entre 50ng até 5pg do DNA genômico por
reação testada em 21 amostras de Fusarium spp, onde foram detectados produtos de PCR
para os genes TRI6 e FUM1.
1.5.3.1 DNA ribossomal nuclear
A técnica de PCR também pode ser aplicada na determinação da posição
taxonômica de fungos. Amplificações e seqüenciamento direto do DNA ribossomal (rDNA)
foi uma das primeiras aplicações de PCR dentro da micologia. No núcleo da célula
eucariótica, o rDNA é transcrito para rRNA, onde moléculas como, 18S, 5,8S, 28S e 5S
tornam-se componentes estruturais do ribossomo. Genes do rDNA têm regiões conservadas
e variáveis, e são utilizadas para o estudo de grupos taxonômicos relacionados. As duas
regiões espaçadoras, ITS1 e ITS2 (Internal Transcribed Spacer) estão localizadas ao lado
do gene 5,8S do rRNA são muito variáveis e usadas freqüentemente para distinção do nível
de espécie (White et al., 1990; Pinheiro, 2004). Primers universais como ITS5 e ITS4 são
eficazes, pois permitem que as regiões do ITS sejam amplificadas usando seqüências
conservadas de dentro dos genes 18S, 5.8S e 28S das seqüências de rDNA (Figura 7),
onde o gene 18S, subunidade menor (SSU), é o mais conservado e usado somente para
comparação de organismos distintamente relacionados. Já o gene 28S, é a região mais
variável, favorecendo a comparação entre gêneros e em alguns casos, entre espécies
diferentes. (White et al., 1990). Diversos trabalhos como o de Zhao (2001) e Sugita (2004),
demonstraram que primers específicos, que foram desenhados a partir de seqüências
conservadas do rDNA ITS, são eficazes na distinção entre espécies do gênero Aspergillus.
20
Já Haugland & Vesper (2000) desenvolveram uma patente em conjunto com US
Patent and Trademark Office, no qual detecta uma grande variedade de organismos
fúngicos baseados em seqüências de rRNA utilizando a tecnologia do TaqManTM para
detecção sensível em PCR - tempo real. Mishra et al. (2003) também usou a região do ITS
em genes do rRNA de F. avenaceum, F. culmorum, F. equiseti, F. oxysporum e F.
sambucinum para identificar esses organismos alvo em quatro cores de fluorescência em
uma mesma reação. Kulik et al. (2004) identificou F. sporotrichioides baseado na região do
ITS2 de gene rRNA, a partir de culturas puras e também de fungos presentes no tecido da
planta.
Nicolaisen et al. (2005) utilizou a técnica de microarranjo para identificação múltipla
de espécies de Fusarium. No estudo foram desenhados 57 oligonucleotideos de captura
(CO) baseado em seqüências da região rDNA ITS2 de Fusarium, e usados para a produção
de micro arranjos. A partir desses arranjos de CO, produtos de PCR hibridizam
especificamente na região ITS de F. graminearum/F. culmorum, F. pseudograminearum, F.
poae, F. sporotrichioides, F. equiseti, F. langsethiae e F. tricinctum/F. avenaceum. Poucos
COs apresentaram hibridização parcialmente complementar a espécies não alvo, podendo
ser eliminada com otimizações da hibridização.
Dentro do contexto de diagnose molecular de fungos, a região do rDNA ITS é bem
elucidada para a distinção de isolados de fungos produtores de micotoxinas por sua grande
variabilidade nas regiões do ITS.
Figura 7: Grupo de genes localizados no rDNA e local de anelamento de primers universais (ITS1 e
ITS4) para amplificação da região ITS.
1.5.3.2 DNA mitocondrial
Assim como a região do rDNA ITS é variável e muito utilizada em diagnose molecular
de fungos, a região do DNA mitocondrial também é bem elucidada para distinção entre
gêneros e espécies de fungos potencialmente micotoxigênicos.
21
As mitocôndrias têm DNA e ribossomos próprios e sintetizam algumas de suas
proteínas. O mtDNA é circular e aloja-se na matriz mitocondrial em estruturas pontuais
chamadas
nucléoides,
que
podem
conter
de
4
a
5
cópias
(http://www.cytochemistry.net/cell-biology/mitochondria_lifecycle.htm).
O
do
mtDNA
mtDNA
produz
limitado número de RNAs (RNA mensageiro, RNA transportador e RNA ribossomal) e
proteínas e enzimas essenciais para a formação de uma mitocôndria funcional que estão
envolvidas em processos de transferência de energia como citocromo b, citocromo oxidase
e subunidades de ATPase (Sederoff, 1984). O sistema de tradução organelar pelo qual
mRNAs mitocondriais são decodificados, é também composto em parte de rRNAs
componentes-específicos,
notavelmente
pequenas
subunidades
(SSU)
e
grandes
subunidades (LSU) e raramente 5S rRNA (Gray et al., 1999) (Figura 8). O mtDNA de fungos
apresenta alto grau de variabilidade estrutural, similar ao observado em plantas, e seu
tamanho pode variar de 17 a 121 kilobases (kb) (Zimmer et al., 1984; Lu, 1996), embora o
tamanho do genoma da maioria das espécies estudado esteja entre 30 e 80 kb (Gray, 1989;
Lu, 1996). É usualmente de origem materna, o que muito contribui para o entendimento da
evolução dos fungos. Um grande número de estudos evolucionário em fungos tem por base
o mtDNA e especialmente o rRNA mitocondrial (Hegedus et al., 1998; Moncalvo et al., 2000;
Gonzalez & Labarere, 2000; Hofstetter et al., 2002).
Além
disso,
o
Fungal
Mitochondrial
Genome
Project
(FMGP)
(http://megasun.bch.umontreal.ca/People/lang/FMGP/FMGP.html) já possui seqüenciado o
mtDNA de Aspergillus nidulans com aproximadamente 33Kb. Enquanto A. flavus possui seu
genoma
completo
seqüenciado
pelo
Microbial
Genome
Sequencing
Project
(http://www.aspergillusflavus.org) contendo aproximadamente 36,8Mb.
Em fungos, genes do rDNA mitocondrial evoluem mais rapidamente que os
rDNA nuclear (Bruns & Szaro, 1992), onde o arranjo dos genes é variável (Grossman &
Hudspeth, 1985; Hoeben & Clark-Walker, 1986), e a variação pode ser observada mesmo
entre taxas relacionados (Clark-Walker & McArthur, 1983; Bruns et al., 1988), por esse
motivo, são freqüentemente utilizados em estudos filogenéticos para um grau taxonômico
intermediário como gênero (Bruns et al., 1991). O mtDNA também é considerado como um
atrativo
para
marcadores
moleculares
de
RFLPs
(Restriction
Fragment
Length
Polymorphisms) por ter um número relativamente grande de cópias e ser facilmente
purificado. Diversos estudos mostram que o mtDNA é rico em RFLPs a nível intra-específico
(eg. Smith & Anderson, 1989; Bruns et al., 1988; Gardes et al., 1991; Hamari et al., 2003;
Juhász et al., 2007), onde em um mapeamento desses polimorfismos revelam variação
causada por longas mutações (Bruns et al., 1988). Bretagne et al. (1995), trabalhando com
mtDNA, desenharam primers específicos para as espécies de A. fumigatus, A. flavus, A.
22
terreus e A. niger e conseguiram distinguir essas espécies de outros fungos e leveduras de
interesse médico. A amplificação de genes do mtDNA com primers universais seguido de
seqüenciamento pode proporcionar a detecção de variabilidade tanto inter-específica como
intra-específicas e ser de grande valia no desenvolvimento de primers específicos para A.
flavus.
Figura 8: Pequena subunidade do DNA mitocondrial ribossomal com local de anelamento de primers
universais MS1 e MS2; e grande subunidade do DNA mitocondrial ribossomal com local de
anelamento de primers universais ML1 e ML2, ML3 e ML4, ML5 e ML6, ML7 e ML8
1.5.3.3 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Recentemente vários autores têm mostrado o uso de técnicas da biologia molecular
para análise da variação genômica de diferentes níveis taxonômicos de fungos. Análises por
meio de RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) tem se tornado uma ferramenta muito
utilizada para a observação de polimorfismos genéticos entre microorganismos. É baseado
na técnica de PCR convencional, diferenciando-se por utilizar oligonucleotídeos de
seqüências arbitrárias para a amplificação de regiões específicas. Busca a detecção de
polimorfismo entre os indivíduos estudados sem nenhum conhecimento prévio das
seqüências de DNA, onde o padrão de bandas produzido permite a discriminação entre
isolados de uma espécie (Cavalcanti et al., 2005).
Diversos estudos utilizando RAPD como marcadores para a diferenciação de fungos
micotoxigênicos têm sido relatado pela literatura, como, por exemplo, Yoder & Christianson
(1998) que usaram o RAPD no estudo taxonômico de espécies da seção Discolor de
Fusarium. Marcadores específicos para o táxon foram desenvolvidos a partir de análises de
RAPD, onde um sistema de PCR foi utilizado para a identificação de F. crookwellense, F.
culmorum, F. graminearum, F. sambucinum, F. torulosum e F. venenatum. Moller et al..,
1999 também usaram marcadores baseados em RAPD como fonte de seqüências para o
desenvolvimento de um sistema de detecção baseado em PCR para F. verticillioidese e F.
23
subglutinans, os quais foram analisados em um sistema de PCR múltipla, onde primers
específicos para as duas espécies foram combinados.
Além de diversos estudos realizados para diferenciação entre espécies utilizando o
RAPD, este também é diversamente utilizado para caracterização da variabilidade genética.
Um exemplo é o estudo de Gopal, et al. (2008), que por meio de 36 primers de RAPD
analisaram a variabilidade genética de 17 isolados de Trichoderma spp. Mostrando um
polimorfismo de 91.8%, onde foram divididos em 2 grandes grupos. A técnica de RAPD
também foi usada para demonstrar a variabilidade genética de A. Níger e espécies
relacionadas, onde oito grandes grupos foram demonstrados por padrões de RFLP e RAPD
(Megnegneau et al., 1993). Midorikawa et al. (2008) mostraram estudo na caracterização da
variabilidade genética de amostras coletadas no Brasil de A. flavus, onde 142 bandas de
DNA foram amplificadas por 11 primers de RAPD e analisadas pelo método UPGMA
(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean). As amostras foram agrupadas de
acordo com o hospedeiro e origem geográfica. Batista et al. (2008) também mostraram a
diversidade genética de A. flavus de oito regiões do Brasil utilizando marcadores
moleculares como ITS, ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) e RAPD. Os resultados
foram aplicados para a construção de uma matriz de similaridade. E posteriormente utilizado
em um dendrograma analisado pelo método UPGMA. Os perfis mostrados por ISSR e
RAPD entre as amostras de A. flavus, indicaram que uma amostra deveria ser A. ryzae, uma
A. parasiticus e duas A. tamarii. Essas amostras foram retestadas e confirmadas por
métodos tradicionais.
Choo et al. (2009), em um estudo de caracterização de amostras de A. decursiva, P.
praeruptorum e A. sylvestris, ervas muito usadas na farmacologia Koreana, utilizaram
regiões de rDNA ITS e RAPD. Em comparação com seqüências do rDNA ITS, foram
desenvolvidos primers específicos para A. sylvestris, e a partir de análises de RAPD foram
desenvolvidos marcadores SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) específicos
para A. decursiva e P. praeruptorum, onde foram estabelecidos para a detecção simultânea
das 3 espécies por PCR múltipla. O mesmo também foi realizado em estudos descritos por
Ray & Roy (2008); Ding et al. (2008); Jain, et al. (2008).
Muitos estudos usando RAPD vêm sendo feito para diferenciar gênero, espécie de
fungos produtores de micotoxinas, um exemplo é dado por Pan, et al. (2007), onde foi
realizada análise filogenética de 16 amostras de Aspergillus, entre elas A. oryzae, A. flavus,
A. sojae, por meio de RAPD. A partir de três primers de RAPD as amostras mostraram
padrões polimórficos estáveis, sendo analisadas um total de 181 bandas. Os dados
sugerem que o polimorfismo genético das amostras é abundante e há a evidencia da
diferenciação genética. A árvore filogenética das 16 amostras correspondeu à taxonomia
morfológica tradicional, demonstrando que é aplicável o uso de marcadores moleculares
24
baseados em RAPD para análise filogenética para Aspergillus. Além da caracterização
genética, as amostras produtoras de aflatoxinas, foram facilmente discriminadas por RAPD.
1.5.3.4 Controle de amplificação interno (IAC)
Apesar da técnica de PCR ser bem descrita nos últimos 15 anos para a
identificação de fungos, principalmente para fungos micotoxigênicos, esta técnica não está
livre de problemas em potenciais. A dificuldade pode ser a contaminação, de amostras não
representativas, e o principal a inibição da PCR (Paterson, 2006).
Resultados negativos podem ser: a falta de seqüências gênicas apropriadas,
reagentes
degradados, termocicladores,
e
inibidores da
PCR,
como
metabólitos
secundários. Para tanto é indicado o uso de um controle de amplificação interno (IAC). A
utilização do IAC em micologia foi realizada a mais de 10 anos para suprir a problemática de
inibições da PCR, por um grupo de pesquisadores (Bretagne et al., 1995) que
aparentemente parecem ser o único grupo de pesquisa que usaram IAC para análises de
PCR em fungos.
A razão para a utilização do IAC é a possibilidade de resultado falso negativo,
podendo acontecer por várias razões incluindo: diferenças nos reagentes da PCR; maquinas
de termocicladores inconsistentes e variantes; inibidores gerais da cultura ou substrato. Em
geral metabolitos secundários que são conhecidos por inibir enzimas e também possuem
profundos efeitos em ácidos nucléicos e proteínas. A produção de metabólitos secundários
nas culturas é qualitativamente e/ou quantitativamente diferente entre táxons e mesmo entre
análises repetidas do mesmo isolado (Frisvad, 1998). Kainz (2000) descreve que
fragmentos de DNA inibem a polimerase por ligarem enzimas ao acido nucléico e contribui
para o efeito plateau observado em PCR onde a taxa da reação decai. Além disso, Wilson
(1997) menciona que DNA não alvo pode por si só ser um inibidor da PCR, porém somente
em altas concentrações. Por essas razões, é aconselhável o uso do IAC como requerimento
básico, principalmente para as reações de PCR com natureza diagnostica.
O IAC é um ácido nucléico que pode ser amplificado pelos mesmos primers usados
para o ácido nucléico alvo dentro de cada tubo da reação. Se o IAC e o produto alvo são
visualizados, então, tem-se um resultado positivo para o gene de interesse. No caso da
visualização do IAC, mas não do produto alvo, então significa que o gene alvo não está
presente. Quando o IAC e o produto alvo não estão presentes no gel, é sinal de que a PCR
falhou. (Ma and Michailides, 2006). Atualmente, existem duas estratégias principais para a
construção do IAC baseadas nas metodologias de PCR. A primeira delas é o IAC
competitivo, o qual o DNA alvo e IAC são amplificados com o mesmo conjunto de primers,
25
sob as mesmas condições e no mesmo tubo de PCR. Nessa estratégia, sempre há
competição entre o DNA alvo e IAC e a quantidade de IAC é crítica para o limite de
detecção. A competição pelo IAC pode, portanto, diminuir a eficiência da amplificação da
PCR e resultar um limite de detecção menor. Um segundo parâmetro critico é o tamanho do
IAC. Aumentando o tamanho relativo de um DNA alvo em relação ao outro DNA,
teoricamente, conduzir a cinética da reação de PCR para os produtos de PCR pequenos. A
segunda estratégia é o IAC não competitivo. Nesse segundo cenário, o DNA genômico alvo
e IAC são amplificados usando diferentes conjuntos de primers para cada DNA alvo, onde
duas reações com cinéticas diferentes ocorrem simultaneamente. A cinética de cada reação
não é influenciada pela competição de primers, e onde não há a formação de quimeras
entre os fragmentos da PCR (Hoorfar et al. 2004).
Abdulmawjood (2002) descreve dois métodos para síntese do IAC competitivo. A
primeira estratégia usada consiste na deleção de seqüências entre os dois sítios do primer.
Para tanto, o produto de PCR original é digerido com enzima de restrição cortando em duas
posições, produzindo três fragmentos. Após a eletroforese, os dois fragmentos de interesse
são extraídos do gel e ligados utilizando uma ligase para criar um fragmento menor do que o
original, mantendo os sítios dos primers. Depois de ligado, o fragmento é então purificado e
clonado para se obter o DNA plasmidial (Figura 9). Já a segunda estratégia, consiste no
aumento de tamanho do IAC utilizando um plasmídio como fita molde. Os primers foram
idênticos aos primers usados na reação diagnóstico, possuindo um final 5’over-hanging
enquanto o final 3’ é complementar a seqüência de DNA (plasmídio) (Figura 10).
26
Figura 9. Esquema de construção do IAC com deleção de seqüências entre os sítios do primer
(Abdulmawjood et al., 2002).
Figura 10. Esquema de construção do IAC com inserção de seqüências entre os sítios do primer
(Abdulmawjood, et al., 2002).
Descrevem Sachadyn e Kur (1998) um método para a síntese de IAC não
competitivo, onde há um sítio de anelamento no final 5’ para um primer diagnóstico
específico e um sítio de anelamento no final 3’ para um primer complementar a seqüência
do DNA genômico alvo (Figura 11).
27
Figura 11: Esquema de construção do IAC com um sítio de anelamento diagnóstico específico e outro
sítio de anelamento complementar ao plasmídio pUC19 (Sachadyn & Kur, 1998).
1.5.3.5 Via biossintética de aflatoxinas
A biossíntese de aflatoxina aparentemente é regulada por vários mecanismos
interligados que incluem elementos da regulação transcricional e fatores fisiológicos que
afetam o metabolismo do fungo (Payne & Brown, 1998). Podendo, estes mecanismos se
tornarem instáveis e acarretarem em grandes diferenças nos níveis de produção de
aflatoxinas (Cary & Ehrlich, 2006). A biossíntese de aflatoxinas possui muitos níveis de
regulação, os quais alguns são quase específicos da via, enquanto outros funcionam como
um mecanismo global do metabolismo secundário. Nos últimos anos o uso da genética vem
proporcionando um maior conhecimento sobre o mecanismo regulatório, mostrando que a
via biossintética de aflatoxinas é regulada por diversos mecanismos (Georgianna, 2008).
Diversos fatores ambientais controlam a biossíntese de aflatoxinas, incluindo o
desenvolvimento do fungo, luz, fonte de carbono, temperatura, e pH (O’Brian et al., 2007).
Os genes envolvidos diretamente na síntese de aflatoxinas compreendem um
conjunto de 25 genes da via metabólica de A. flavus e A. parasiticus (Figura 12) (Yu et al.
2004). Atualmente sabe-se que um defeito no gene cypA de A. flavus é o responsável pela
perda de síntese das aflatoxinas G1 e G2 (Ehrlich et al., 2004). O genoma do grupo
responsáveis pela síntese de aflatoxinas tem aproximadamente 70kb e 8 cromossomos. A
partir de seqüências completas do genoma de A. flavus, pode se falar que o grupo de genes
responsáveis pela produção de aflatoxinas está localizado perto do telômero do
cromossomo 3 (http://www.bio.nite.go.jp/dogan/MicroTop?GENOME_ID=ao).
Sabe-se que a via metabólica de aflatoxinas é controlada pela ativação da
transcrição do gene aflR, o qual ativa a transcrição coordenada de três genes estruturais do
cluster de gene de aflatoxina, aflD (nor1), aflM (ver1), aflP (omtA) (Chang et al., 1995).
Porém, o gene ou genes que controlam a expressão do gene aflR ainda são desconhecidos.
O produto gênico de aflR regula a biossíntese de aflatoxina ligando-se ao promotor do gene
estrutural do grupo de genes de aflatoxina (Woloshuk et al., 1994). Essa é uma clara
evidência de que o desenvolvimento do fungo e a biossíntese de aflatoxina estão ligados e
dividem elementos regulatórios.
Estudos mostram que isolados não aflatoxigênicos de A. flavus, em muitos casos,
possuem grandes deleções de partes ou inteiras do grupo de genes responsáveis pela
síntese de aflatoxinas (Chang et al., 2005). Isolados de A. flavus aflatoxigênicos sempre
mostram, usando um sistema de PCR múltiplo, quatro segmentos de DNA específicos para
28
os genes aflR, aflD (nor1), aflM (ver1), aflP (omtA). Em estudo Criseo et al. (2008)
demonstraram que isolados de A. flavus não aflatoxigênicos apresentam bandas de DNA
variável, diferente do padrão de quatro bandas como observado em sistema de PCR
múltiplo de isolados de A. flavus aflatoxigênicos. Dos isolados de A. flavus não
aflatoxigênicos 36,5% mostraram fragmentos de DNA que corresponde ao conjunto
completo de genes (padrão de 4), como achado em isolados de A. flavus aflatoxigênicos. 43
(32%) dos isolados mostraram um padrão de três bandas agrupados em quatro perfis, onde
nor-1, ver-1 e omt-A foram os perfis mais freqüentes. Um total de 25 (18,7%) dos isolados
de A. flavus não aflatoxigênicos mostraram padrão de duas bandas e 16 (12%) dos isolados
mostraram um padrão de uma banda. Em um isolado, vindo de alimento de ave, nenhuma
banda foi encontrada. O gene nor-1 foi o mais representativo entre os quatro genes
aflatoxigênicos analisados. Baixa incidência foi encontrada para o gene aflR. Observando-se
um alto nível de variabilidade entre isolados não aflatoxigênicos.
Chao, et al. (2006), examinaram 34 amostras de Aspergillus da seção Flavi, onde o
gene aflR, que codifica a proteína contendo o motif zinc-finger DNA-binding, de 23 dessas
amostras foi com sucesso amplificado e seqüenciado. Nenhum produto de PCR foi
encontrado em cinco amostras de A. sojae ou em seis amostras de A. oryzae. Esses
resultados de PCR sugerem que o gene aflR é ausente ou significantemente diferente em
algumas amostras de A. sojae e A. oryzae. Os genes aflR seqüenciados de 23 amostras
positivas tiveram 96,6% de similaridade, que foi particularmente conservado no domínio do
DNA-binding zinc-finger.
Cary et al. (2007), utilizaram a tecnologia de microarranjos para identificar genes
diferencialmente expressos em amostras do tipo selvagem para veA e amostras de
mutantes para veA, que poderia estar envolvidos na produção de aflatoxinas e
desenvolvimento da esclerótica, que permite a sobrevivência do fungo sob condições
adversas. Uma vez que, a deleção do gene veA em A. flavus e A. parasiticus bloqueia a
produção de aflatoxinas assim como a formação da esclerótia. A análise revelou que 684
genes em que a expressão mudou significativamente através do tempo, onde 136 desses
genes foram diferencialmente expressos entre as duas amostras incluindo 27 genese que
demonstraram uma diferença significante na expressão de ambas as amostras através do
tempo, grupo de 115 genes demonstra com grande expressão na amostra do tipo selvagem
do que na amostra do tipo mutante. Também foi identificado um subgrupo de genes
dependentes veA que mostraram perfis de expressão dependente de tempo similares
aquelas de genes conhecidos da via biossintética de aflatoxinas ou que mostraram ser
candidatos para envolvimento na produção da esclerótia no tipo selvagem.
Vários estudos vêm sendo feitos na tentativa de correlacionar genes da via
biossintética a fungos produtores e não produtores de micotoxinas, onde o gene aflR é
29
principal alvo por ser um regulador positivo da via metabólica (Yu et al. 2004; Somashekar,
2004). Entretanto, Paterson (2006) sugere que o gene aflR não seja confiável para o uso de
diferenciação de aflatoxinas por também estar envolvido na regulação de produção de
esterigmatocistina, o penúltimo precursor da produção de aflatoxinas, o qual pode
apresentar um resultado falso positivo. Genes como aflP ou aflQ, aparentemente, são os
melhores candidatos para estudos de distinção entre fungos produtores e não produtores de
micotoxinas por não serem relevantes para a biossíntese de esterigmatocistina, uma opção
válida para primers diferenciadores de aflatoxinas em alimentos. Rodrigues et al. (2008),
testaram os genes aflD e aflQ da via biossintética de A. flavus por meio de PCR e RT-PCR,
para verificar a presença de expressão, onde a presença de ambos os genes não
mostraram correlação com a aflatoxigenicidade do fungo. A expressão de aflD não foi
considerada como um bom marcador para o diferenciamento de isolados aflatoxigênicos e
não aflatoxigênicos, mas aflQ mostrou boa correlação entre a expressão e habilidade de
produção de aflatoxinas.
Yang et al. (2004) trabalharam com genes avfA, omtA e ver-1, para detectar genes
alvos aflatoxigênicos. Foram usados isolados de A. flavus, A. parasiticus, A. oryzae, A.
niger, A. terreus, Penicillium expansum, e Fusarium verticillioides como DNA molde para
testar a especificidade em PCR múltipla. Resultados positivos foram alcançados de isolados
com DNA aflatoxigênico, A. flavus e A. parasiticus para os três pares de primers, sendo
comprovado por PCR-ELISA. A reação precisou de poucas horas, possibilitando uma
detecção rápida e simultânea de diversas amostras a baixo custo.
Bufflier et al. (2007) descrevem que com o intuito de identificar espécies de Aspergillus:
A. carbonarius, A. japonicus, A. aculeatus e A. ibericus, produtor de ocratoxina A em uvas e
vinhos, um microarranjo de baixa complexidade (OLISA), baseado em sondas de
oligonucleotídeos de DNA, foram obtidos de seqüências do gene da calmodulina. O
microarranjo diferenciou todas as espécies de Aspergillus, onde o limite de detecção para A.
carbonarius de 3,2pg de DNA molde para reação de PCR.
30
C.
Figura 12. A – 82Kb do grupo de genes envolvidos na via biossintética de aflatoxinas de A. flavus e A.
parasiticus. A nova nomenclatura dos genes é dada na esquerda da linha vertical e a nomenclatura
antiga é dada na direita. Ao longo da linha vertical as setas indicam a direção de transcrição dos
genes. A régua à esquerda da linha vertical indica o tamanho relativo desses genes em quilobases; B
– Setas no painel B indicam as ligações a partir dos genes para as enzimas que eles codificam, das
enzimas para os passos de bioconversão em que elas estão envolvidas, e dos intermediários para os
produtos dos passos de bioconversão da aflatoxina. Abreviações descritas indicam: ácido norsólico
(NOR), averatina (AVN), 5’-hidroxiaveratina (HAVN), oxoaveratina (OAVN), averufanina (AVNN),
averufina (AVF), acetato versiconal hemiacetal (VHA), versiconal (VAL), versicolorina B (VERB),
versicolorina A (VERA), demetilesterigmatocistina (DMST), diidrode-metilesterigmatocistina
(DHDMST), esterigmatocistina (ST), diidroesterigmatocistina (DHST), O-metilesterigmaticistina
(OMST), diidro-O-metil-esterigmatocistina (DHOMST), aflatoxina B1 (AFB1) aflatoxina B2 (AFB2),
aflatoxina G1 (AFG1), aflatoxina G2 (AFG2); C – Genes envolvidos na via biossintética de
esterigmatocistina de A. nidulans (Yu et al.. 2004).
31
1.1.1.1 Genes da via biossintética de aflatoxinas: polimorfismos e
expressão diferencial
Em comparações entre duas espécies que divergiram a milhões de anos, são poucas
diferenças entre os indivíduos de cada espécie, porém quando a mesma região do genoma
é coletada de indivíduos da mesma espécie, a diferença é mínima. Essas pequenas
diferenças, variações podem ser chamadas de SNPs (Single nucleotide Polymorphisms),
que são simplesmente variações genéticas na seqüência de DNA que ocorrem quando um
único nucleotídeo no genoma é alterado. São também considerados como mutações
pontuais que tiveram sucesso evolutivo suficiente para reaparecer em uma proporção
significativa da população de uma espécie.
Os SNPs, atualmente, são muito utilizados para diferenciação fenotípica entre
indivíduos da mesma espécie, estando em grande parte, encontrados em regiões
codificantes, os éxons. Quando presentes em regiões não codificantes, os SNPs não
alteram a proteína codificadora, sendo de grande utilidade para estudos evolutivos. Porém
quando presentes em regiões codificadoras de proteínas, como as vias regulatórias de um
gene, podem afetar as taxas de transcrição e causar mudanças na produção da proteína
codificada, levando a alterações na estrutura funcional do gene (Kim, 2007).
Extensivos estudos para a identificação de SNPs em regiões de interesse de
genomas têm sido realizados. Hayashi et al. (2004) estudaram a abundância e localização
de SNPs em regiões com genes de resistência Piz e Piz-t de arroz em genomas de
cultivares susceptíveis, e em cada cultivar doador de Piz e Piz-t. Foram encontrados
grandes distribuições de SNPs, 1 SNP a cada 390bp entre a região do gene Piz, e 1 SNP a
cada 173bp na região do gene Piz-t, sugerindo esses genes tiveram historias evolutivas
distintas. Uma vantagem desse estudo é que genotipagem por SNPs é uma técnica rápida,
barata e confiável. Cho et al. (1999) em genotipagem de Arabidopsis thaliana por SNPs,
utilizaram dois ecótipos, Columbia e Landsberg, e plantas susceptíveis ao fungo patogênico
Erysiphe orontii. As análises demonstraram que 64% dos 412 marcadores apresentaram
clara discriminação entre plantas Columbia e Landsberg, e 58% dos marcadores
discriminaram os heterozigotos.
Andersen et al. (2008) amplificando parte de genes da via biossintética da lignina do
genoma de milho (Zea mays L.) de amostras com diferentes forragens, encontraram 6 locos,
que codificam C4H, 4CL1, 4CL2, C3H, F5H, e CAD, com diferentes níveis de diversidade
nucleotídica e desequilíbrio de ligamento por meio do TASSEL, o que possivelmente reflete
nos níveis de seleção.
Figueiredo et al. (2008), em análises filogeográficas de amostras representativas de
sorgos de diferentes cultivares, mostraram a diversidade de seqüências de seis genes
32
responsáveis pela qualidade do grão do sorgo (Shrunken2, Brittle2, Soluble starch
synthaseI, Waxy, Amylose extender1, e Opaque2). Haplótipos com aproximadamente 1kb
aparentemente foram pouco afetados pelo efeito da recombinação, enquanto similaridades
entre as seqüências, possibilitaram o agrupamento de alelos relacionados e a discriminação
de 2 ou 3 grupos remotamente relacionados dependendo do gene. Os resultados indicaram
que a domesticação do sorgo envolveu a estrutura de populações fundadoras. Alelos que
mostraram estar enraizados pela genealogia revelaram relacionamentos derivados de
mutações ou recombinações. Comparações em germoplasmas revelaram contrastes entre
genes, onde Shrunken2, Brittle2 e Soluble starch synthaseI mostraram uma perda da
diversidade fora da região de origem do sorgo. Enquanto Waxy, Amylose extender1, e
Opaque2 mostraram uma nova variação devido a mutações de pós-domesticação.
Kristensen et al. (2007), apresentaram um trabalho sobre SNPs de Fusarium
baseado em minisequenciamento usando reações de SNaPshot (Applied Biosystems) e
primers de SNP desenhados baseados em motivos protéicos derivados de análises
filogenéticas de seqüências de tradução do fator-1. Dezesseis espécies de Fusarium
produtores de tricotecenos e moniliformina foram detectados e identificados pelo sistema.
Um número de primers de SNPs foram desenvolvidos para detectar clados de espécies com
a síntese particular de micotoxinas. O sistema conseguiu distinguir três grandes grupos
produtores de tricotecenos, os do tipo A (Fusarium langsethiae e F. sporotrichioides), tipo B
(F. cerealis, F. culmorum, F. graminearum, F. lunulosporum e F. pseudograminearum), e tipo
A e tipo B (grupos dos tipos A e B), e alguns produtores de moniliformina. SNPs parecem
ser o meio mais ambíguo para diferenciar Aspergillus spp., porém SNPs na região 5’ não
traduzida e na região codante completa do gene regulatório da biossíntese de aflatoxinas,
aflR (Chang et al. 1995; Lee et al. 2006), e na região parcial do gene citocromo b
mitocondrial podem diferenciar A. sojae de A. parasiticus, assim como, A. oryzae de A.
flavus (Wang et al. 2001).
Análises utilizando SNPs em genes da via biossintética de A. flavus para diferenciar
aflatoxicidade não estão descritas na literatura, o que mostra ser um novo caminho para a
distinção entre fenótipos toxigênicos de A. flavus. Possíveis SNPs em sítios de domínios
protéicos da via biossintética entre A. flavus aflatoxigênico e não aflatoxigênico podem
influenciar a transcrição final do gene, levando ao fenótipo negativo, a ausência de toxina.
Entretanto, sistemas de RT-PCR (PCR de transcriptase reversa) específico para A. flavus
aflatoxigênico tem sido bem elucidado na literatura. A RT-PCR detecta o mRNA específico
de um gene da biossíntese da aflatoxina, o qual garante que esse gene está transcrevendo
ativamente, podendo ser considerado que a aflatoxina será produzida sob as condições a
qual foi analisada, como condições ambientais e nutrientes estabelecidos.
33
Mayer et al. (2003) demonstraram que a concentração do mRNA de nor-1 (aflD)
medida por RT-PCR em A. flavus aflatoxigênico colonizado em trigo pode estar
correlacionada com o crescimento cinético do fungo e com a presença de aflatoxina B1.
Sweeney et al. (2000) mostrou que aflatoxina de A. parasiticus pode ser monitorada
por RT-PCR, onde RNAs totais de 439 amostras de A. parasiticus, cultivados em meios
indutor e não indutor de aflatoxina, foram amplificados por RT-PCR com primers específicos
para os genes aflR e aflQ. Os autores demonstraram que a produção de aflatoxinas
monitorada por CCD estava correlacionada com a transcrição dos genes em questão.
Sherm et al. (2005) estudaram isolados de A. flavus e A. parasiticus cultivados em
meio indutor YES e não indutor YEP. Os resultados obtidos pela analise de RT-PCR, onde
todas as amostras de Aspergillus foram crescidas em YES, detectaram transcritos
específicos dos genes aflD, aflO, aflP correlacionados sempre com a proporção de
aflatoxinas determinada pelo detecção do HPLC. A detecção de transcritos de outros genes
testados, como aflG, aflH, aflI, aflK, aflM, aflQ, aflR e aflS não estavam sempre
correlacionados com a toxicidade atual de cada isolado. Transcrições de genes
aflatoxigênicos aflD, aflO e aflP estavam sempre ausentes em isolados crescidos em meio
YEP, enquanto transcritos do gene tub1 foram detectados em ambas as culturas crescidas
em meio YES e YEP.
Degola et al. (2008) com intuito de desenvolver um sistema de RT-PCR múltiplo para
diferenciar A. flavus produtor de aflatoxinas e A. flavus não produtor de aflatoxinas,
utilizaram 27 amostras de A. flavus coletadas de grãos de milho, originários da Itália. Cinco
genes da via biossintética de A. flavus, dentre eles 2 genes são regulatórios (aflR e aflS), e
três genes estruturais (aflD, aflO e aflQ), foram alvo de primers específicos para destacar a
expressão dos genes em micélios cultivados sob condições de indução para produção de
aflatoxinas. Culturas crescidas em 48 horas expressaram o conjunto completo de genes
analisados, enquanto culturas crescidas em 24 horas não apresentaram o mesmo padrão.
Também foram feitos PCRs utilizando DNA genômico extraídos das mesmas amostras
analisadas, correlacionando com a expressão gênica das amostras.
Cai, et al. (2008), também utilizando análises de RT-PCR mostraram que o gene
nadA foi expresso em meio YES, indutor de aflatoxina, e não foi expresso em meio YEP,
não indutor de aflatoxina. O gene nadA não foi expresso em mutantes com deleção no gene
aflR. Para esclarecer a função do gene nadA foi deletado o gene nadA em A. parasiticus
aflatoxigênico. Os quatro mutantes para o gene nadA foram isolados pelo acúmulo do
pigmento amarelo (NADA) nos micélios e meio de cultura. Depois de cultivados, isolados
mutantes e tipos selvagens foram cultivados em meio YES por três dias, cada mutante
produziu cerca de 50% do total de aflatoxinas G que o tipo selvagem produziu. Em
contraste, as aflatoxinas B não diferiram significativamente entre mutantes e tipos
34
selvagens. O pigmento NADA foi tão instável que não poderia mudar a aflatoxina G1
enzimaticamente. Medidas LC-MS mostraram que a massa molecular de NADA foi 360, que
significa 32 vezes maior que a AFG1. Este estudo confirmou que a fração citosolica de A.
parasiticus selvagem reforça a formação de AFG1 de OMST, enquanto a fração citosolica de
mutantes com deleção nadA não mostra a mesma atividade. Além disso, a fração do citosol
do tipo selvagem mostrou a atividade da enzima catalisando a reação de NADA para AFG1,
que requer NADPH ou NADH, indicando que NADA é um precursor para AFG1, em
contraste, a fração do citosol de mutantes com deleção para nadA não mostrou a atividade
da mesma enzima. Os resultados mostraram que a proteína nadA é a enzima citosólica
necessária para a biossíntese da aflatoxina G a partir de OMST, e que catalisa a reação do
NADA para AFG1, o último passo na biossíntese da aflatoxina G.
Estudos correlacionando ESTs (Expressed Sequence Tags) e microarranjos
(microarray) à aflatoxinas também têm sido descrito. Yu et al. (2007) com intuito de
identificar genes potencialmente envolvidos na produção de aflatoxinas de A. flavus,
analisaram um total de 7218 ESTs identificados de A. flavus de 26.110 clones de cDNA
seqüenciados. Classificações funcionais foram atribuídas a esses ESTs e genes
potencialmente envolvidos no processo de contaminação por aflatoxina. Baseado em
informações dessas seqüências de ESTs, um microarranjo do DNA genômico foi construído.
Para identificar redes potencialmente regulatórias que controlam a produção de aflatoxinas,
foram avaliados os perfis das expressões dos genes em meios indutores e não indutores em
A. flavus e A. parasiticus. Culturas cultivadas em meio indutor, foram suportadas pelos
resultados das expressões gênicas.
OBrian et al. (2003) tentando identificar genes adicionais da via biossíntetica de
aflatoxina, analisaram bibliotecas de cDNA de A. flavus e microarranjos de vidro de ESTs.
Em uma análise inicial de clones de cDNA, levou a identificação de 753 ESTs únicos. Muitas
seqüências mostraram similaridade para metabólicos e genes regulatórios conhecidos.
Entretanto, nenhuma função pôde ser correlacionada com mais de 50% dos ESTs. Análises
da expressão gênica de A. parasiticus cultivado em meios indutores e não indutores para a
produção de aflatoxinas foram avaliados usando microarranjos de vidro contendo os 753
ESTs, onde 24 genes foram mais expressos durante a biossíntese de aflatoxinas e 18 genes
foram mais expressos antes da biossíntese. Nenhuma função específica pode ser
relacionada aos 18 dos 24 genes, que elevaram a expressão, foram associados com a
biossintese de aflatoxina.
35
2 Justificativa
A produção de amendoim (Arachis hypogaea) tem sido altamente prejudicada pela
ocorrência de aflatoxinas, que afeta sobremaneira a sua exportação. Os níveis de
contaminação de aflatoxinas B1 em amendoim exportados para Europa têm atingido
números elevados (2 – 3 mg/kg), impossibilitando seu uso até para ração animal. Além do
amendoim, a castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa Humb. & Bompl.) contribui para a
economia do Brasil, pois a maior parte da sua produção anual é exportada para a Europa e
EUA. Nos últimos anos tem sido grande o número de lotes (cerca de 10%) de castanha-doBrasil rejeitados pela União Européia devido aos altos índices de contaminação por
aflatoxinas (superiores a 2,25 ppm), resultando na restrição para importação de castanha
pela União Européia (FAO, 2008).
O sistema de Análise de Perigos e Pontos Críticos de Controle, HACCP, é um
sistema preventivo que busca a produção de alimentos inócuos. Este princípio está
sustentado na aplicação de princípios técnicos e científicos na produção e manuseamento
dos alimentos desde o campo até a mesa do consumidor. Uma definição prática desta
análise deve destacar que este conceito cobre todo tipo de fatores de risco ou perigos
potenciais à inocuidade dos alimentos, que podem ser biológicos, químicos e físicos; quer
sejam os que ocorrem de forma natural no alimento, no ambiente ou seja, decorrentes de
erros no processo de fabricação.
Atualmente, os métodos de análise morfológica e cromatográfica de CCD e CLAE
utilizados para a detecção de micotoxinas pelos laboratórios particulares e credenciados
pelo MAPA (Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento), são métodos lentos e
caros com poucos laboratórios aptos a realizar. Com isso são realizadas poucas análises
para o mercado interno, permitindo que a população de um modo geral, consuma alimentos
potencialmente contaminados por aflatoxinas. Um exemplo é Caldas et al., 2002 que em
parceria com o Laboratório Central de Saúde Pública do Distrito Federal, Brasília,
encontraram níveis de aflatoxinas que ultrapassam os níveis aceitos pela legislação
brasileira em 19,6% das amostras de castanhas, milho, entre outros analisados.
Este projeto visa uma contribuição para o desenvolvimento de uma estratégia de
PCR, em forma de kit-diagnóstico rápido, eficiente e sensível para certificação de grãos
brasileiros livres de fungos aflatoxigênicos, e que não altere demasiadamente o custo final
do produto, ao mesmo tempo em que garanta a sua qualidade. O método molecular para a
identificação e detecção sensível de A. flavus permitirá detecção de isolados aflatoxigênicos
dos não aflatoxigênicos, o qual a morfologia não diferencia. A aplicação do método vai
facilitar a identificação de focos de contaminação precocemente, visando à redução das
perdas causadas pela contaminação de aflatoxinas. Além de contribuir para a
36
comercialização de um produto mais saudável, que aumentará a qualidade dos produtos
brasileiros no mercado nacional, o conhecimento gerado poderá também elevar a
exportação de grãos, aumentando a geração de divisas e empregos para os produtores.
37
3 Objetivos
1.2 Objetivo geral
Este projeto tem como objetivo o desenvolvimento de um método de PCR específico
para detecção de Aspergillus flavus aflatoxigênico em grãos brasileiros.
1.3 Objetivos específicos
1. Caracterizar aflatoxigenicidade em isolados de Aspergillus flavus por meio de CCD;
2. Caracterizar isolados de Aspergillus flavus aflatoxigênicos e Aspergillus flavus não
aflatoxigênicos por meio de RAPD, para o desenvolvimento de um sistema de RAPD
SCAR a ser utilizado na detecção de Aspergillus flavus aflatoxigênicos;
3. Desenvolver e validar um sistema de PCR específico para Aspergillus flavus a partir
da região nuclear rDNA ITS;
4. Desenvolver e validar um sistema de PCR específico para Aspergillus flavus a partir
da região mtDNA SSU rDNA;
5. Determinar a diversidade nucleotídica dos genes aflR, aflP e aflQ da via biossintética
de aflatoxinas em populações de Aspergillus flavus aflatoxigênicos e não
aflatoxigênicos
38
4 Material e Métodos
4.1 Coleção de Aspergillus flavus
4.1.1 Identificação morfológica dos isolados de Aspergillus flavus
A coleção de A. flavus do presente trabalho possui 63 isolados, que foram adquiridos
através de um mapeamento de áreas de ocorrência de amêndoas de cajueiro e amendoim
infectadas por A. flavus no campo e em locais de armazenamentos feitos pela Embrapa
Agroindústria (CNPAT), CE. As amêndoas foram adquiridas a partir de sete localidades: feiras
de Fortaleza-CE (origem Amazonas), Belém (origem Amazonas), Beribe County-CE, São
Raimundo Nonato-Piauí, Amazonas, Acre e Pará (anexo 1).
Para o isolamento de colônias de A. flavus, fragmentos de amêndoas do cajueiro e de
castanha-do-Brasil foram colocados em placas de petri com ágar-ágar (1,5%), mantidos em
condições de 12 horas no escuro e 12 horas em luminosidade e com temperaturas variando
de 23 a 28ºC (Freire et al., 1999). Após o surgimento de colônias, isolados de A. flavus
foram transferidos, com o auxílio de uma alça de Drigalsky, em cultura pura e cultivados em
tubos de ensaio e placas de petri com meio de cultura Czapek (em 100 ml de água
destilada, 30 g de NaNO3, 5 g de KCl, 5 g de MgSO4, 0,1 g de FeSO4) com extrato de
levedura (CYA) (Pitt & Hocking, 1985), contendo fitas de papel de filtro autoclavadas com
cerca de 0,5 mm de largura e 20 mm de comprimento. Após sete dias de crescimento a uma
temperatura de 25ºC, os papéis de filtro foram retirados das placas de petri colonizadas e
guardados em Eppendorf de 1,5ml e preservados juntamente com os tubos de ensaio
colonizados em câmara fria com temperatura cerca de 4ºC.
Para análises de SNPs, a extração do DNA dos 63 isolados de A. flavus foi
conduzida com um novo crescimento em uma fonte de celulose, arroz parboilizado
autoclavado, por 7-10 dias a 25°C. Em seguida, grãos de arroz que continham A. flavus
esporulados foram inoculados e crescidos em meio MMT de Martin (1950) e modificado
conforme Homechin (1987) (Corabi-Adell, 2004) por 7-10 dias a 25°C para facilitar o
isolamento das colônias de A. flavus.
4.2 Identificação de isolados de Aspergillus flavus aflatoxigênico
39
A presença ou ausência de aflatoxinas secretadas de 63 isolados de A. flavus foram
determinadas por meio de CCD (Paterson, 1994; Singh et al., 1991). Para tanto, os fungos
foram cultivados em meios específicos (CYA), e em extrato de levedura com sacarose (YES)
(Pitt & Hocking 1985), ambos indutores de produção de aflatoxinas. Os isolados foram
incubados durante 7 a 10 dias entre 25 a 30°C, apresentando assim, esporulação de
conidiósporos. Os 63 isolados de A. flavus foram submetidas ao crescimento no escuro durante
o período de crescimento.
Quadrados de micélio de 1 cm x 1 cm foram cortados e sob o micélio foi adicionado 10μl
da solução 2:1 de clorofórmio: etanol para a liberação da aflatoxina. Os micélios foram
pressionados a distâncias de 1 cm x 1cm na base da placa de TLC (Silica gel 60; Merck,
Darmstadt, Germany), onde foram adicionados posteriormente 1μl (10ppb/μl) de cada padrão
das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 (Sigma, St Louis, MO, USA). Em uma cuba de TLC foi
preparada uma solução 9:1 de 100 ml de clorofórmio e acetona, e acrescido à cuba a placa de
TLC e papel filtro de mesmo tamanho da placa de TLC para ajudar na migração do solvente
sobre a fase estacionária. Depois da migração do solvente até ¾ da placa de TLC, esperou-se
a secagem da placa à temperatura ambiente por 15 minutos para a sua revelação em câmara
de U.V. cromato view com o comprimento de onda de 366nm (tabela 4).
4.3 Extração do DNA genômico de Aspergillus flavus
Os micélios de cada isolado de A. flavus foram crescidos em frasco erlenmeyer de 250
ml com 100 ml de meio de cultura líquido CYA, e incubados a 25ºC à 120rpm, durante 3
dias. Os micélios de cada isolado foram recuperados por filtragem manual, e lavado com
água destilada e esterilizada, para remoção de todo resíduo do meio de cultura. Foram
acondicionados em tubos eppendorf de 1,5ml, liofilizados, e macerados em cadinho de
porcelana.
Após a maceração, o DNA genômico foi extraído pelo método fenol-clorofórmio
(Raeder & Broda, 1985), onde foram homogeneizados 50mg de micélio macerado em 500μl
de tampão de extração (Tris HCl 200 mM, NaCl 250 mM, EDTA 25 mM e SDS 0,5% pH 7,0).
Em seguida, foram adicionados 350 μl de fenol, misturando-se gentilmente o conteúdo.
Posteriormente, 150 μl de clorofórmio foi adicionado, misturando o conteúdo do eppendorf
por inversão até a uma aparência leitosa, iniciando-se nesta fase, a degradação do material
protéico. A suspensão foi centrifugada a 13.000 rpm por 30 minutos, em centrífuga
refrigerada à temperatura de 4º C. Da fase aquosa superior foi transferido no máximo 750 Pl
para eppendorf de 1,5 ml acrescentando-se 10 μl de RNAse (1 U/μl), incubando-os à 37ºC
por 10 minutos para remoção do RNA. Para a eliminação de proteínas residuais,
40
acrescentou-se igual volume de clorofórmio misturando o conteúdo suavemente por inversão,
seguido de centrifugação por 10 minutos a 13.000 rpm. Em seguida, transferiu-se a fase
aquosa superior para novos tubos eppendorfs onde o DNA foi precipitado com isopropanol à
-20ºC na proporção de 54% do volume da solução. Efetuou-se nova centrifugação por 10 a
20 segundos a 5.000 rpm e descartou-se o sobrenadante. Para a remoção de sais, o
precipitado foi lavado com 200 μl de etanol 70% a 4°C, centrifugado por 1 minuto onde
novamente o sobrenadante é descartado. A secagem do DNA foi efetuada no speedvacuum (Eppendorf Concentrator 5301) por 10 a 15 minutos e em seguida, ressuspendido
em 50 l de tampão TE (10mM Tris-HCl, pH 8,0 e 1 mM EDTA). O DNA purificado foi
submetido à eletroforese em gel de agarose 1% (5 V/cm) na presença de brometo de etídio
(1 μg/ml) e quantificado visualmente por comparação com o marcador padrão Low DNA
Mass Ladder (Invitrogen). Para finalizar, as amostras de DNA foram diluídas em água Milli-Q
estéril para uma concentração final de 5 ng/μl.
1.4 Análise da variabilidade genética em isolados de Aspergillus
flavus aflatoxigênicos e Aspergillus flavus não aflatoxigênicos
via RAPD
Foi realizada a caracterização molecular por RAPD de isolados de A. flavus
produtores e não produtores de aflatoxinas, estabelecidos pelo método de cromatografia de
camada delgada (CCD). Baseado no número de bandas observadas e reprodutibilidade
foram usados 32 primers randômicos (B10, B20, C10, C20, D20, E10, E20, G10, H10, J10,
J20, K10, K20, M10, M20, O10, O20, P10, P20, Q20, S10, T20, U20, V10, V20, OPA02,
OPA04, PM04, OPF10, OPF13, X10 e X20) para a estimativa da variabilidade genética dos
isolados de A. flavus, onde cinco isolados representativos foram selecionados entre os
produtores de aflatoxinas e cinco isolados entre os não produtores de aflatoxinas.
Com vista a obter bandas mais definidas, foi utilizada a Taq Platinum (Invitrogen) e
tampão de corrida TAE 1X. A PCR foi realizada com um volume final de 10 μl, contendo 2 μl
de água Milli-Q, 1,3 μl de tampão de Taq Platinum 1X, 1,0 μl de MgCl2 (50 mM), 1,5 μl do
primer (10 mM), 1,04 μl de dNTPs (2,5 mM), 1,04 μl de BSA 1X, 0,13 μl de Taq Platinum (5
U/μl) e 2 μl de DNA genômico (10 ng/μl). O programa de temperaturas usado foi:
desnaturação inicial a 94°C por 3 minutos; 39 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto,
anelamento a 36°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 2 minutos, extensão final a 72°C por
10 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose
1.5%, TAE 1X em 20 volts, acrescidos com 9μl de brometo de etídeo (1 μg/ml).
41
As condições experimentais foram padronizadas com somente bandas reproduzíveis
pontuadas, onde os dados binários foram combinados e analisados com o programa MVSP
v3.1 (Kovach 1999) para determinação de relações fenéticas. As similaridades foram
determinadas com o coeficiente de Jaccard, e visualizadas de acordo com o método
UPGMA.
1.5 Primers específicos desenhados para diagnose molecular de
Aspergillus flavus
1.5.1 Primers específicos para região nuclear do rDNA ITS
Para o desenvolvimento de primers específicos de região do rDNA ITS, foram feitas
em trabalho anterior, amplificações e análise de seqüências da região nuclear do rDNA ITS1
e ITS2 e do gene 5.8s em 48 isolados de A. flavus (Midorikawa et al., 2008). Nesse estudo,
foram analisados 43 seqüências depositados no Genbank do rDNA ITS de diversas espécies
no gênero Aspergillus junto com 19 espécies de 14 gêneros de fungos comumente associadas
com B. excelsa e A. occidentale no Brasil (Freire et al. 1999, 2000), junto com as seqüências
do rDNA ITS em isolados UCB01 a UCB48 (Genbank acessos EF409767 até EF409814). O
alinhamento das seqüências foi conduzido utilizando o ClustalW (Thompson et al. 1994) e o
desenho de primers utilizando o Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000).
Foram desenvolvidos 5 primers específicos para a região do rDNA ITS 1 e 2
(ASPITSF, ASPITSF2, ASPITSR, ASPITSR2 e ASPITSR3) (Tabela 1) os quais foram
testados para especificidade e sensibilidade em A. flavus (atividade entre 2007 e 2009). A
PCR foi realizada com um volume final de 12,5 μl, contendo 6,1 μl de água Milli-Q, 1,25 μl de
Tampão de Taq Platinum 1X, 0,375 μl de MgCl2 (50mM), 0,5 μl do primer (10mM), 1,0 μl de
dNTPs (2,5 mM), 0,625 μl de BSA 1X, 0,125 μl de Taq Platinum (5 U/μl) e 2,0 μl de DNA
(concentração de 10 ng/μl).
O programa de temperaturas utilizado foi de desnaturação inicial à 94ºC por 4
minutos, desnaturação do DNA à 92ºC por 1 minuto, temperatura de anelamento do primer
de 60ºC por 1 minuto, extensão de 72ºC por 1 minuto, extensão final de 72ºC por 5 minutos
e conservação da reação à 10ºC. Os três passos de desnaturação do DNA, anelamento e
extensão foram repetidas 39 vezes. De acordo com estudo anterior (Midorikawa et al., 2008)
dois primers específicos para a região do rDNA ITS de A. flavus (ASPITSF2 e ASPITSR3) foram
selecionados como candidatos promissores para PCR especifica em A. flavus.
42
Tabela 1: Combinações testados entre primers específicos desenhados a partir de regiões específicas
para A. flavus em rDNA ITS nuclear, com tamanho de produto esperado, em pares de bases, para cada
combinação de primer.
Primers Forward
ASPITSR
400pb*
400pb
ASPITSF
ASPITSF2
Primers Reverso
ASPITSR2
400pb
400pb
ASPITSR3
400pb
400pb
* tamanho do produto de PCR esperado (em pares de bases)
4.3.1 Primers específicos para região do mtDNA SSU rDNA
Um trabalho semelhante foi realizado para a região do mtDNA SSU rDNA, com
seqüências amplificadas de 48 isolados de A. flavus pelos primers universais MS1 e MS2
(White et al., 1990). O alinhamento das seqüências foi conduzido utilizando o programa Muscle
(Edgar, 2004) e incluindo seqüências disponíveis no Genbank de A. fumigatus, A. niger, A.
ochraceus, A. penicillioides, A. silvaticus e A. versicolor. Para o desenho de primers específicos
para o gênero Aspergillus foi utilizado o programa Primer3 (Rozen & Skaletsky 2000).
A partir do conjunto de primers específicos para o gênero Aspergillus desenhados
para a região mtDNA SSU rDNA (tabela 2), estes foram otimizados com isolados de A.
flavus, A. fumigatus e Trichoderma harzianum quanto a especificidade e sensibilidade. A
PCR foi realizada com um volume final de 12,5 μl, contendo 6,125 μl de água Milli-Q, 1,25 μl
de Tampão 10X, 0,25 μl do primer (10 mM), 1,25 μl de dNTPs (2,5 mM), 1,25 μl de BSA,
0,125 μl de Taq (5 U/μl) e 2,0 μl de DNA (concentração de 10 ng/μl).
O programa utilizado foi de desnaturação inicial à 94ºC por 4 minutos, desnaturação
do DNA à 92ºC por 1 minuto, temperatura de anelamento do primer de 60ºC por 1 minuto,
extensão de 72ºC por 1 minuto, extensão final de 72ºC por 5 minutos e conservação da
reação à 10ºC. Os três passos de desnaturação do DNA, anelamento e extensão foram
repetidas
39
vezes.
Dois
primers
específicos
para
o
gênero
Aspergillus,
ASP_GEN_MTSSU_F1 e ASP_GEN_MTSSU_R1 foram selecionados como candidatos
promissores para PCR específica em Aspergillus.
Tabela 2: Combinações entre primers de regiões específicas do mtDNA SSU rDNA e tamanhos de pares
de base esperados para cada combinação de primer.
Primers Forward
MS1
ASPITS_GEN_MTSSU_F1
ASPITS_GEN_MTSSU_F2
Primers Reverso
MS2 ASPITS_FLA_FLU_OCH_MTSSU_R ASPITS_GEN_MTSSU_R1
532pb*
531bp
531bp
532bp
480bp
480bp
532bp
480bp
480bp
* tamanho do produto de PCR esperado (em pares de bases)
43
1.6 Desenho de controles de amplificação interno (IACs) e
otimizações dos sistemas de PCR especifico
1.6.1 Desenho do controle de amplificação interno (IAC) para região
do rDNA ITS específico de Aspergillus flavus
Para a construção do controle de amplificação interna para a região rDNA ITS
específica de A. flavus, foi realizado um mapa de restrição por meio do programa DNAMAN
(Lynnon Corporation, 2008) a partir da seqüência (400pb) gerada pelos primers ASPITSF2 e
ASPITSR3 (apêndice b).
O produto da PCR gerado pelos primers ASPITSF2 e ASPITSR3, foi ligado ao vetor
plasmídio pGEM-Teasy. O mix da reação foi preparado com 5 μl de tampão 2X de DNA
ligase; 1 μl de T4 ligase; 1 μl da enzima pGEM-T Easy (50ng/μl); 2,5 μl (25ng) do produto da
PCR; e 0,5 μl de água MilliQ em um volume total de 10 μl. A incubação foi de 5 horas em
temperatura ambiente.
A transformação foi realizada por choque térmico utilizando células competentes de
E. coli preparadas usando cloreto de cálcio, onde foram usados 4 μl da ligação do vetor
pGEM-Teasy ao produto da PCR em 100μl de célula competente. A transformação foi
inoculada (100 ml) em meio LB sólido com ampicilina (100g/ml), na presença de Xgal (40
μl) e IPTG (4 μl). As colônias recombinantes contendo o inserto foram incubadas em 2 ml de
meio LB e ampicilina (2 μl) por 16 horas a 37°C em 200 rpm.
Para certificação de que todas as colônias continham o inserto, foi realizada uma
PCR a partir da colônia transformada. Para tanto, o mix foi preparado para um volume final
de 20 μl, contendo 13 μl de água MilliQ; 2 μl de tampão 1x; 1,6 μl de MgCl2 (50mM); 0.2 μl
de dNTPs; 0,5 μl do primer (10mM) (ASPITSF2 e ASPITSR3); 0,2 μl de Taq polimerase
(5U/μl); 2 μl da cultura transformada).
O programa de temperaturas usado foi: desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos; 35
ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento a 60°C por 1 minuto, extensão a
72°C por 30 segundos, extensão final a 72°C por 5 minutos. Das colônias que apresentaram
o inserto, o DNA plasmidial foi extraído por meio de lise alcalina.
A digestão foi conduzida utilizando duas enzimas de restrição, a SmaI (Invitrogen),
cortando na posição de nucleotídeo 36, e a ClaI (Invitrogen), cortando na posição de
nucleotídeo 147 do produto da PCR, resultando no splicing de um fragmento de 111pb. O
mix foi preparado com volume final de 50 μl, contendo 5 μl do tampão NEB4; 5 μl de BSA
1X; 10 μl (100 ng/μl) do DNA plasmidial; 1 μl da enzima ClaI; 29 μl de água MilliQ. A
incubação foi de 12 horas a 37°C.
44
Após a digestão da enzima ClaI, foi adicionado 2,5 μl da enzima SmaI e incubou a
25°C por 12 horas. A digestão foi novamente incubada a 65°C por 20 minutos. Foram
adicionados 2 μ de dNTP (1mM) e 1μl de Klenow 1U/μl (Invitrogen), DNA polimerase, e
incubou a 25°C por 15 minutos. Foram acrescentados 1,2μl de EDTA 500 mM pH 8,0 e
incubou a 75°C por 20 minutos. O DNA plasmidial contendo a região de anelamento dos
primers (3301pb), foi purificado do gel de acordo com o kit Geneclean II (Qbiogene).
Após retirar o fragmento de interesse pela digestão e transformar a extremidade
digerida por ClaI em cega (blunt end) pela DNA polimerase Klenow, foi feita a ligação das
extremidades geradas pela digestão de ClaI e SmaI. O mix foi preparado com 4,5 μl DNA
eluido do gel; 5 μl de tampão 2X (pGEM-T Easy); 0,5 μl de T4 ligase, e incubado overnight a
4°C para produzir um fragmento 111 pb menor que o fragmento específico original.
Uma nova transformação foi realizada utilizando a metodologia anterior. Porém as
placas de inoculação não continham Xgal e IPTG, uma vez que todas as colônias
apresentarão o inserto na região do lacZ e silenciando a expressão do gene não haverá
diferenciação das colônias em azuis e brancas. Depois do período de incubação, todas as
colônias foram selecionadas e diferenciadas por PCR de acordo com o método anterior.
Após a clonagem, a amostra recombinante foi armazenada em culturas de glicerina a uma
temperatura de 80°C negativos.
O DNA plasmidial foi isolado por meio de lise alcalina, e a uma concentração ótima,
usado como DNA molde do IAC em reações de PCR específicas. Os testes de
concentrações ideais dos DNAs genômicos e plasmidial foram realizados com ambas as
concentrações de DNAs variando entre 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg e 1 fg/μl.
Os produtos da PCR foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1%.
4.3.2 Otimização do sistema de PCR utilizando primers para a região do
rDNA ITS específicos para Aspergillus flavus e IAC
A partir dos primers ASPITSF2 e ASPITSR3 específicos para a região rDNA ITS em A.
flavus, uma otimização do sistema de PCR contendo um IAC foi realizada. Os testes de
especificidade dos primers foram conduzidos usando DNA genômico de isolados de A. flavus,
A. awamore, A. fumigatus, A. niger, Penicillium citrinum, Trichoderma harzianum,
Cladosporium cladosporioides e Fusarium solani. Isolados A. awamore, A. fumigatus, A. niger,
Penicillium citrinum, Trichoderma harzianum, Cladosporium cladosporioides foram obtidos da
Embrapa Cenargen, Brasília, e Isolados de F. solani foram obtidos do Departamento de
Patologia de Planta, da Universidade de Brasília (CMUnB).
45
Gradientes de temperatura e concentração de DNA genômico e plasmidial também
foram realizados. Para tanto, a PCR foi realizada com um volume final de 20 μl, contendo 11,4
μl de água MilliQ; 2 μl de tampão 1X; 1,6 μl de MgCl2 (50 mM); 0.8 μl de dNTP (2,5 mM); 0,5
μl do primer (10 mM) (ASPITSF2 e ASPITSR3); 0,2 μl de Taq polimerase (5 U/μl); 2 μl do
DNA genômico (10 ng/μl) e 1 μl do IAC (5 pg/μl).
O programa de temperaturas usado foi: desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos; 30
ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento a 62°C por 1 minuto, extensão a
72°C por 30 segundos, extensão final a 72°C por 5 minutos. Os produtos da PCR foram
visualizados por eletroforese em gel de agarose 1%. Os testes de limite de detecção foram
conduzidos com o DNA do isolado UCB040 de A. flavus diluído nas concentrações de 10ng,
1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg até 1 fg/μl. Todos os experimentos foram conduzidos
em duplicatas, com um controle negativo separado com a falta de DNA molde em cada
reação de PCR.
4.3.3 Desenho do controle de amplificação interna (IAC) para região
do mtDNA SSU rDNA específico do gênero Aspergillus
Para a construção do controle de amplificação interna para a região mtDNA SSU
rDNA específica do gênero Aspergillus, um mapa de restrição foi realizado por meio do
programa NEBcutter V2.0 da BioLabs (http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php), a partir
da
seqüência
de
480bp
gerada
pelos
primers
ASP_GEN_MTSSU_F1
e
ASP_GEN_MTSSU_R1 (apêndice c).
A partir do produto de PCR gerado pelos primers ASP_GEN_MTSSU_F1 e
ASP_GEN_MTSSU_R1, foi realizada uma digestão utilizando a enzima de restrição SnaBI
(BioLabs), cortando na posição 154, e gerando blunt end. O mix foi preparado com um
volume final de 50μl, contendo 10μl (100ng/μl) do produto da PCR, 5μl do tampão NEB 4
(10X), 5μl de BSA 1X, e 1μl da enzima de restrição SnaBI. A incubação foi a 37°C por 1 a 2
horas. Os fragmentos foram purificados do gel de agarose 1% de acordo com o Kit QIAEX II,
Gel extraction kit (150) (Qiagen).
Em seguida a purificação dos fragmentos do gel de agarose, foi conduzida a
adenilação para adicionar uma cauda poliA à extremidade onde ocorreu o corte da enzima.
O mix foi preparado com 10 μl finais, contendo 1,5 μl de tampão 10X (pht), 3,6 μl de dNTP
(2,5 mM), 9,7 μl do fragmento purificado do gel, e 0,2 μl de Taq polimerase (5 U) (pht). A
incubação foi a 72°C por 30 minutos. Após a adenilação do fragmento de 154bp, o
fragmento foi ligado ao vetor pGEM- T Easy. O mix da reação foi preparado com um volume
final de 10 μl contendo, 5 μl tampão 2X de DNA ligase; 1 μl de T4 ligase, 1 μl da enzima
46
pGEM-T Easy (50ng/μl); 2,5 μl (25 ng) do produto da PCR. A incubação foi por 5 horas em
temperatura ambiente.
A transformação foi realizada por eletroporação utilizando células competentes de E.
coli preparadas com glicerol. Foram usados 2.5 μl da ligação do vetor pGEM-T Easy ao
produto de PCR adenilado em 40 μl de célula competente a 1,8 V do eletroporador. A
transformação foi incubada em 1 ml de meio SOC por 1 hora à 37°C, onde 100 μl da
transformação foram inoculados em placas preparadas com meio LB, ampicilina (100 μg/ml),
Xgal (40 μl) e IPTG (4 μl). As colônias contendo o inserto foram inoculadas em 2 ml de meio
LB e ampicilina (2 μl) por 16 horas a 37°C em 200 rpm.
Para verificação da presença do fragmento de 154 bp no plasmídio, foi feita uma
PCR de colônia transformada, utilizando 2 colônias negativas e 4 colônias positivas. O mix
foi preparado com 20 μl finais, contendo 2 μl de tampão 10X pht, 0,8 μl de dNTP (2,5 mM),
2.5 μl de primer M13 forward (2 mM) e 2.5 μl de primer M13 reverso (2 mM), e 0,2 μl de taq
pht (5 U). Com o auxilio de uma ponteira, cada colônia foi mergulhada na reação de PCR.
Programa utilizado foi de desnaturação inicial de 95°C por 2 minutos, 30 ciclos com
desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento a 50°C por 1 minuto, e extensão a72°C por
30 segundos, e extensão final de 72°C por 5 minutos. Das colônias que apresentaram o
inserto, o DNA plasmidial foi extraído por meio de lise alcalina.
4.3.4 Otimização do sistema de PCR utilizando primers para a
região mtDNA SSU rDNA específicos para o gênero
Aspergillus e IAC
Os testes do sistema da PCR com DNA genômico e plasmidial, foram realizados com
primers
específicos
para
o
gênero
Aspergillus
da
região
mtDNA
SSU
rDNA,
ASP_GEN_MTSSU_F1 e ASP_GEN_MTSSU_R1, com isolados de A. flavus, A. awamore,
A. fumigatus, A. niger, Penicillium citrinum, Emericella, Trichoderma harzianum, Cladosporium
cladosporioides e Fusarium solani. Isolados de F. solani foram obtidos do Departamento de
Patologia de Planta, da Universidade de Brasília (CMUnB).
Foram feitas otimizações quanto à temperatura de anelamento do primer. Para tanto, foi
realizado uma gradiente de temperatura e concentração do DNA genômico e plasmidial, onde
a PCR foi preparada com um volume final de 20 μl, contendo 10,5μl de água MilliQ; 2μl de
tampão 1X; 0.8μl de dNTP (2,5mM); 0,5μl do primer (10mM) (ASP_GEN_MTSSU_F1 e
ASP_GEN_MTSSU_R1); 2,5μl do primer M13 reverso (2mM); 0,2μl de Taq polimerase
(5U/μl); 2μl do DNA genômico (10ng/μl) e 1μl do IAC (5pg/μl).
47
O programa de temperaturas usado foi: desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos; 30
ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento a 60°C por 1 minuto, extensão a
72°C por 30 segundos, extensão final a 72°C por 5 minutos. Os testes de concentrações
ideais dos DNAs genômicos e plasmidial, foram realizados com ambas as concentrações de
DNAs variando entre 10ng, 1ng, 100pg, 10pg, 1pg, 100fg, 10fg e 1fg/μl. Os produtos da PCR
foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1%.
1.7 Análise da diversidade nucleotídica dos genes aflR, aflP e aflQ
da via biossintética de aflatoxinas em populações de
Aspergillus flavus aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos
1.7.1 Escolha de genes candidatos da via biossintética de
aflatoxinas em Aspergillus flavus
Para o estudo da diversidade em genes da via biossintética candidatos na
diferenciação de A. flavus aflatoxigênico e não aflatoxigênico, uma busca foi feita na
literatura (apêndice d) por genes comprovadamente envolvidos na produção de aflatoxina
em A. flavus. Foram feitas buscas por seqüências completas desses genes candidatos no
GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
e
no
genoma
completo
de
A.
flavus
(http://www.aspergillus flavus.org). Selecionadas as seqüências de bancos de dados
eletrônicos, uma identificação de seqüências codificantes dos genes foi realizada com o
auxílio do programa Inter Pro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/). Através do programa Artemis
(Rutherford, et al., 2000) foram feitas anotações para os genes aflR, aflP e aflQ, quanto às
posições dos íntrons e éxons (figuras 13, 14 e 15).
1.7.2 Desenho e otimização de primers específicos para os genes
aflQ, aflP e aflR
A partir de seqüências completas dos genes aflR, aflP e aflQ de A. flavus, foram
desenhados um conjunto de primers que sobrepõem as seqüências gênicas com o auxilio
do programa Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/) (apêndice “e”) (tabela 3) (figuras 13, 14 e 15).
A otimização dos conjuntos de primers foi realizada a partir de um mix preparado para um
volume final de 20 μl, contendo 14 μl de água MilliQ; 2 μl de tampão 10X pht; 0,8 μl de dNTP
(2,5 mM); 0,5 μl de primer forward e 0,5 μl de primer reverse (10 mM); 0,2 μl Taq polimerase
(5 U/μl) pht; 2 μl de DNA genômico (10 ng). Para tanto, foi realizado um gradiente de
temperatura com as seguintes condições de temperaturas: desnaturação inicial a 95°C por 2
48
minutos; 30 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento variando entre 45 a
65°C por 1 minuto, extensão a 72°C por 30 segundos e extensão final a 72°C por 5 minutos.
Tabela 3: Combinações entre primers dos genes aflR, aflP e aflQ de A. flavus, com seqüências dos
primers Forward e Reverse, respectivamente, tamanhos esperados, em pares de bases, para cada
combinação e temperatura de anelamento utilizada.
Primers
Forward
Primers
Reverse
aflR_F1
aflR_R1
aflR_F2
aflR_R2
aflR_F3
aflR_R3
aflR_F4
aflR_R4
aflP_F1
aflP_R1
aflP_F2
aflP_R2
aflP_F3
aflP_R3
aflP_F4
aflP_R4
aflQ_F1
aflQ_R1
aflQ_F2
aflQ_R2
aflQ_F3
aflQ_R3
aflQ_F4
aflQ_R4
aflQ_F5
aflQ_R5
Seqüência dos Primers
TGTCGATATCATTCCAATTT
GCTGGCATGGTATGCT
GTGCAGCACGCGCTCTT
CCGATTTCTTGGCCGAGTC
TGCTAGCGAAAAGCAGCA
ACTCGGCGACCATCAGAG
GATTGTGGATGCGGTTGC
GTGCGAGGCAACGAAAAG
CGAATTAGGGCAAAAGGTGT
GCGCCGACGTCTATCTTC
GATGTTAGAGAGGATTTCCA
CTAGATAGGAACGGAGCTG
AACCTCGTCCACAGTGCT
CATCACTCGACACAATCGTC
GCCTTTCAGTGGATGACCT
AAATAGGCACACCCGACA
GATACGGCAGACGCGAAA
GTGCAAAAGGGGCATCTG
GAGGTTATGGGACAGACCA
ACAACTCATCTTTTCCATGC
CGACATACTGAACATGGGTA
TACCGTGTCCGATCCTC
TCTGGATCACATCAAGAGCA
CTGGGATCATGGGTAAACG
TTGTTTCACACCCGTCCA
GCACCAGTCGCAATACAGC
Tamanho do
fragmento
Temperatura de
anelamento
480pb
50°C
482pb
60°C
486pb
60°C
474pb
60°C
481pb
60°C
482pb
50°C
500pb
60°C
482pb
60 C
480pb
60°C
495pb
60°C
481pb
60°C
482pb
60°C
495pb
60°C
Figura 13: Gene aflR da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus contendo um único exon de
1335pb. Sobreposição dos segmentos seqüenciados e tamanhos de fragmentos gerados para cada
segmento. Acc número de acesso do Genbank da seqüência que foi utilizada para desenho dos
primers e exons.
49
Figura 14: Gene aflP da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus contendo cinco exons.
Sobreposição dos segmentos seqüenciados e tamanhos de fragmentos gerados para cada
segmento. Acc número de acesso do Genbank da seqüência que foi utilizada para desenho dos
primers e exons.
Figura 15: Gene aflQ da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus contendo sete exons.
Sobreposição dos segmentos seqüenciados e tamanhos de fragmentos gerados para cada
segmento. Acc número de acesso do Genbank da seqüência que foi utilizada para desenho dos
primers e exons.
50
4.3.5 Seqüenciamento dos genes aflR, aflP e aflQ da via
biossintética de aflatoxinas em Aspergillus flavus
O seqüenciamento de produtos de PCR de seqüências codificantes de genes da via
biossintética de isolados de A. flavus aflatoxigênico e não aflatoxigênico foi realizado na
plataforma de seqüenciamento da UCB, por meio de seqüenciadores automáticos de DNA
(ABI 377). Para tanto, o produto da PCR foi quantificado por meio de eletroforese e
seqüenciado de acordo com Sanger et al. (1977).
O mix usado para incorporação dos nucleotídeos marcados na reação de
seqüenciamento, foi feito em um volume final de 10μl, contendo 2μl do kit DynamicTM ET
Terminator (Pharmacia Biotech, EUA), 1,5μl dos primers forward (2mM), 50ng do produto de
PCR, água Milli-Q completando para o volume final. O programa de temperaturas que foi
usado possuiu 30 ciclos de amplificação envolvendo 95º C por 20 segundos, 50º C por 15
segundos e 60º C por 1 minuto.
A purificação foi realizada com 1 l de acetato de sódio/EDTA, para a lavagem das
amostras, e 40 l de etanol absoluto a temperatura ambiente, com vortex de 10 segundos,
centrifugando o material por 15 minutos a 12.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e
adicionado 400μl de Etanol 70% para a lavagem do pellet. O material foi centrifugado
rapidamente e após o descarte do etanol, o pellet foi seco por 10 minutos em speed vacuum
(Eppendorf Concentrator 5301). O DNA foi ressuspendido em 4μl de DyenamicTM ET loading
solution (Amersham Pharmacia Biotech, EUA) por aproximadamente 1 hora. Em seguida foi
realizado o seqüenciamento.
1.7.3 Análise bioinformática da diversidade nucleotídica dos genes
aflR, aflP e aflQ da via biossintética de aflatoxinas
Para uma maior compreensão das análises feitas para a determinação da
diversidade nucleotídica dos genes aflR, aflP e aflQ da via biossintética de aflatoxinas interespecifica entre as espécies A. flavus, A. parasiticus e A. oryzae, e intra-específica entre
isolados de A. flavus aflatoxigênico e não aflatoxigênico, foi feita uma anotação por meio do
programa Artemis v10 (Rutherford, et al., 2000) das posições e tamanhos dos introns,
exons, posição 5’ - 3’ UTR desses 3 genes a partir de seqüências depositadas no Genbank
de A. flavus, A. parasiticus e A. oryzae. Para tanto, foi utilizado o programa Sequencher v4.8
(Gene Codes Corporation) para análise comparativa das seqüências dos genes aflR, aflP e
aflQ da via biossintética em A. flavus, A. parasiticus e A. oryzae, alinhando e identificando
polimorfismos presentes.
51
A partir de seqüências geradas dos genes aflR, aflP e aflQ, análises serão feitas para
a determinação da diversidade nucleotídica no nível intra-específica, baseado em
comparações entre 63 isolados de A. flavus pertencentes a sete diferentes localidades e
dois diferentes hospedeiros, castanha do Brasil e castanha de caju. As anotações das
posições e tamanhos de íntrons e éxons, e posição 5’-3’ UTR serão feitas pelo programa
Artemis (Rutherford, et al., 2000), e para a análise de seqüências, quanto à eliminação de
baixa qualidade, correção e verificação dos cromatogramas, alinhamento com formações de
contigs, e identificação dos polimorfismos como, inserções e deleções, polimorfismos
sinônimos ou não sinônimos, será utilizado o programa Sequencher v4.8 (Gene Codes
Corporation). Para o estudo da diversidade nucleotídica, definição de haplótipos,
desequilíbrio de ligação será utilizado o programa Tassel (Bradbury et al., 2007), onde serão
analisadas a freqüência de SNPs dentro dos genes e entre os isolados, e desequilíbrios de
ligação intra-específica e inter-específica.
52
5 Resultados
1.8 Identificação de isolados de Aspergillus flavus aflatoxigênico e
não aflatoxigênico
Análises de cromatografia realizada por CCD em 63 isolados de A. flavus provenientes
de dois hospedeiros, B. excelsa (castanha do Brasil) e A. occidentale (castanha de caju),
revelaram 49 isolados aflatoxigênicos. Dentre esses foram detectados níveis de aflatoxina
B1 variando entre 1, 2, 5, 10, 20 e 50ppb (partes por bilhão) e aflatoxina G1 variando entre
1, 2, 30, 50 e 100ppb. Dos 63 isolados cultivados nos meios de cultura YES e CYA, 44
(69%) e 34 (53%) isolados produziram aflatoxinas, respectivamente. Embora ambos os
meios de cultura sejam específicos para indução da produção de aflatoxinas, os níveis
detectados nas amostras em meio YES foram 16% maiores que os níveis de aflatoxinas
detectados em meio CYA, mostrando que o meio YES possui uma maior indutividade para a
produção de aflatoxinas. A presença de aflatoxina B1, foi detectada em 18 dos 20 (90%)
isolados de A. occidentale, uma vez sendo descrita somente a produção de aflatoxina G1.
Os resultados mostraram que em 14 (22%) dos isolados não foram detectadas aflatoxinas.
Tabela 4: Caracterização dos isolados de A. flavus quanto ao local de origem, hospedeiro de origem,
e presença de aflatoxinas com suas respectivas concentrações em meios de cultura YES e CYA.
Número
do
isolado
Localidade (Brasil)
UCB001
UCB003
UCB004
UCB005
UCB006
UCB007
UCB008
UCB009
Fortaleza (Feira) (origem
Amazonas)
Fortaleza (Feira) (origem
Amazonas)
Belém (origem Amazonas)
Belém (origem Amazonas)
Belém (origem Amazonas)
Belém (origem Amazonas)
Belém (origem Amazonas)
Belém (origem Amazonas)
Beribe County, CE
UCB010
UCB011
UCB012
UCB013
UCB014
UCB015
UCB016
UCB017
UCB018
UCB019
UCB020
UCB021
UCB022
UCB023
UCB024
Beribe County, CE
Beribe County, CE
Beribe County, CE
Beribe County, CE
Beribe County, CE
Beribe County, CE
Beribe County, CE
Beribe County, CE
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
UCB002
Hospedeiro
AFLATOXINA /
CONCENTRAÇÃO (PPB) YES
AFLA
CONC.
(PPB)
AFL
A
CONC.
(PPB)
AFLATOXINA / CONCENTRAÇÃO
(PPB) CYA
AFLA
CONC.
(PPB)
10
Bertholletia
excelsa
B. excelsa
ND
B1
ND
ND
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
Anarcardium
occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
ND
B1
ND
ND
ND
ND
B1
ND
B1
B1
B1
B1
B1
B1
B1, B1
ND
B1
B1
B1
B1
B1
B1
20
10
50
10
20
20
50
50
50, 10
10
50
50
20
20
G1
100
ND
B1
ND
B1
ND
ND
B1
ND
B1, B1
B1
B1
B1
B1
B1
B1
ND
ND
B1
B1
B1
B1
ND
AFLA
CONC.
(PPB)
G1
50
G1
100
50
10
10
10, 10
5
50
1
10
10
50
10
20
10
10
53
UCB025
UCB026
UCB027
UCB028
UCB029
UCB030
UCB031
UCB032
UCB033
UCB034
UCB035
UCB036
UCB037
UCB038
UCB039
UCB040
UCB041
UCB042
UCB043
UCB044
UCB045
UCB046
UCB047
UCB048
UCB049
UCB050
UCB051
UCB052
UCB053
UCB054
UCB055
UCB056
UCB057
UCB058
UCB059
UCB060
UCB061
UCB062
UCB063
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
São Raimundo Nonato, Piauí
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Amazonas
Acre
Acre
Acre
Acre
Acre
Acre
Para
Para
Para
Para
Para
Para
Para
Para
Para
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
A. occidentale
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B. excelsa
B1
B1
B1
B1
B1
B1
B1
B1
ND
B1
B1
ND
B1
ND
ND
B1
B1
B1
B1
ND
ND
B1
B1
B1
ND
B1
B1
B1
B1
B1
B1
B1
B1
ND
B1
ND
B1
B1
ND
10
10
10
20
20
10
20
2
G1
50
10
50
50
10
10
20
50
50
10
10
2
50
50
10
10
10
10
10
2
2
G1
100
G1
2
G1
50
ND
ND
B1
ND
B1
ND
ND
B1
B1
B1
B1
ND
B1
B1
ND
B1
ND
B1
ND
ND
ND
B1
B1
B1
ND
B1
ND
B1
B1
ND
B1
ND
ND
B1
B1
ND
ND
ND
ND
50
10
G1
50
G1
50
50
G1
100
10
10
G1
30
G1
G1
1
30
5
2
50
50
2
10
2
50
2
10
10
50
1
20
* ND, aflatoxina não detectável.
1.9 Caracterização da variabilidade genética em isolados de
Aspergillus flavus aflatoxigênico e não aflatoxigênico via RAPD
A fim de determinar a variabilidade genética relacionando com a produção de
aflatoxina por A. flavus, análises foram realizadas por meio de RAPD utilizando os isolados
representativos UCB015, UCB017, UCB022, UCB040 e UCB052 produtores de aflatoxinas,
e isolados UCB007, UCB036, UCB044, UCB045 e UCB060 não produtores de aflatoxinas.
RAPD PCR foi conduzido utilizado 32 primers randômicos (figura 16 mostra exemplos de
polimorfismos observados com primers T20 e OPF10).
54
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
5000pb
2000pb
1650pb
650pb
A
B
Figura 16: Amplificação de RAPD com os primers T20 e OPF10. A) RAPD com primer T20. M:
marcador 1kb ladder plus; 1 ao 5: isolados UCB015, UCB017, UCB022, UCB040 e UCB052; 6:
controle negativo; 7 ao 12: UCB007, UCB036, UCB044, UCB045, UCB060 e UCB077. B) RAPD com
o primer OPF10. M: marcador 1kb ladder plus; 1 ao 5: isolados UCB015, UCB017, UCB022, UCB040
e UCB052; 6: controle negativo; 7 ao 12: UCB007, UCB036, UCB044, UCB045, UCB060 e UCB077.
Análises fenéticas de dados combinados de RAPD desenvolvidos por análises de
variabilidade com 32 primers de RAPD, amplificando 173 bandas, mostraram em cada dos
cinco isolados de A. flavus produtores de aflatoxina e cinco não produtores de aflatoxinas,
que são geneticamente distintos (figura 16).
Dos produtos amplificados por RAPD, foi verificado visualmente o número de
polimorfismos para cada primer, onde B10 produziu 11 bandas, B20 produziu três bandas,
C10 produziu quatro bandas, C20 produziu quatro bandas, D20 produziu sete bandas, E10
produziu duas bandas, E20 produziu sete bandas, G10 produziu oito bandas, H10 produziu
duas bandas, J10 produziu quatro bandas, J20 produziu sete bandas, K10 produziu cinco
bandas, K20 produziu oito bandas, M10 produziu sete bandas, M20 produziu três bandas,
O10 produziu cinco bandas, O20 produziu cinco bandas, P10 produziu cinco bandas, P20
produziu quatro bandas, Q20 produziu sete bandas, S10 produziu cinco bandas, T20
produziu seis bandas, U20 produziu três bandas, V10 produziu sete bandas, V20 produziu
seis bandas, OPA02 produziu sete bandas, OPA04 produziu sete bandas, OPF10 produziu
cinco bandas, OPF13 produziu oito bandas, PM04 produziu quatro bandas, X10 produziu
quatro bandas e X20 produziu três bandas.
O dendrograma representando a análise fenetica, produzido por meio do programa
MVSP v 3.1 (Kovach 1999) agrupou parte dos isolados por região de origem e planta
55
hospedeira em grupo 1 e grupo 2, onde o grupo 1 mostrou agrupamento de isolados vindas
do mesmo hospedeiro, B. excelsa, e com aflatoxigenicidade não detectável com similaridade
de 80%. Já o grupo 2 mostrou 92% de similaridade entre duas amostras de A. flavus
isoladas de A. occidentale originária de Beribe, Ceará, e produtoras de aflatoxinas (figura
17). Em seqüência, também foram feitas análises fenéticas para cada primer de RAPD
(anexo), onde o primer O20 agrupou isolados de A. flavus com aflatoxigênicidade não
detectável com similaridade de 68% enquanto os isolados aflatoxigênicos foram agrupados
com similaridade de 80%.
Apesar das análises não terem apresentado um cenário em que há um agrupamento
de isolados aflatoxigênicos e outro agrupamento de isolados com aflatoxigenicidade não
detectável, não exclui a possibilidade de ser feito um RAPD SCAR a partir de outros primers
de RAPD.
Grupo 1
Grupo 2
Figura 17: Dendograma UPGMA representando as relações genéticas das amostras de A. flavus
isoladas a partir de A. occidentale e B. excelsa, baseado na combinação dos perfis de RAPD obtidos
com 32 primers de RAPD. As similaridades foram obtidas utilizando o coeficiente de Jaccard.
1.10 Desenho e otimização do controle de amplificação interno
(IAC) para o sistema de PCR da região do rDNA ITS específica
para Aspergillus flavus.
A diagnose molecular de fungos está sendo muito utilizada nos últimos anos, como é o
caso deste estudo. Mas podem estar ocorrendo inibições da reação de PCR, o que resulta
em um resultado falso negativo. IACs proporcionam ao sistema de PCR uma maior
confiabilidade, no qual amplificação do IAC e não amplificação do DNA genômico
determinará que o gene alvo não esteja presente e descartando qualquer duvida de inibição
da PCR.
A partir de estudo (Midorikawa et al., 2008), os primers ASPITSF2 e ASPITSR3
amplificaram especificamente um produto de PCR do tamanho previsto somente a partir do
56
DNA genômico de A. flavus, sem amplificação quando testados com DNA genômico de
outros membros do gênero e fungos associados com B. excelsa e A. occidentale (figura 18).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
400pb
300pb
Figura 18: Amplificação de PCR com os primers ASPITSF2 e ASPITSR3 específicos de A. flavus. M:
Marcador 1kb ladder plus; 1: controle negativo; 2 ao 4: isolados de A. flavus UCB024, UCB045 e
UCB060; 5 e 6: isolados 1 e 2 de Trichoderma harzianum; 7 e 8: isolados 1 e 2 de Aspergillus
fumigatus; 9 e 10: isolados 1 e 2 de Aspergillus awamore; 11 e 12: isolados CMUnB 1824 e 1848 de
Fusarium solani f. sp. glycines; 13: isolado CMUnB 1974 de F. solani.
Para o desenvolvimento do IAC específico para a região rDNA ITS, duas digestões
iniciais foram realizadas, uma com a enzima SmaI e a outra com XhoI. Na segunda etapa da
digestão, foi adicionado a enzima ClaI em ambas as digestões. Ambas as digestões
mostraram resultado satisfatório, gerando um fragmento de 111bp pelas enzimas SmaI e
ClaI, e outro fragmento de 215bp gerado pelas enzimas XhoI e ClaI (figura 19). Ambos os
fragmentos foram descartados, sendo eluidos do gel somente os fragmentos maiores, os
quais continham os sítios de anelamento para os primers ASPITSF2 e ASPITSR3. A razão
para a realização de duas digestões foi por medida de segurança, caso uma das duas não
cortasse a posição esperada na segunda etapa da digestão. O IAC usado, foi extraído a
partir de plasmideos gerados pela digestão das enzimas SmaI e ClaI.
57
M
1
2
3
4
5
5,000 bp
2,000 bp
300 bp
200 bp
Fragmento de
215bp
100 bp
Fragmento de
111bp
Figura 19: Digestão das enzimas SmaI, ClaI e XhoI. M: marcador 1 Kb ladder Plus; 1: DNA plasmidial;
2: digestão do DNA plasmidial com as enzimas SmaI e ClaI; 3: digestão do DNA plasmidial com as
enzimas XhoI e ClaI; 4: digestão do DNA plasmidial somente com a enzimas SmaI; 5: digestão do
DNA plasmidial somente com a enzima XhoI.
Em desenvolvimento com o IAC, amplificação simultânea de produtos de PCR
distintos, porém que apresentam o mesmo sítio de anelamento para o par de primers usado
pode causar inibições ou favorecimentos na amplificação de ambos os produtos de acordo
com a taxa molecular do DNA genômico e IAC.
Quando usado somente com o DNA molde do fungo, o limite de detecção observado
foi de 10 fg (figura 20). Porém quando incorporado o IAC na reação, o limite de detecção de
A. flavus passa a ser de 1 pg e 10 fg de IAC. Na otimização da amplificação simultânea do
produto específico do rDNA ITS e o IAC, em um gradiente de concentração realizado com 8
diluições do DNA plasmidial, 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100fg, 10 fg e 1 fg, na qual a
concentração ótima de IAC foi considerada como 10pg para amplificações simultâneas de
fragmentos de 286pb de IAC e 397pb de A. flavus. (figura 21), usando uma concentração
padrão de 10ng para o DNA genômico.
Os primers que apresentaram melhor especificidade para A. flavus, foram o
ASPITSF2 e ASPITSR3 sob uma temperatura de anelamento de 62°C e concentrações de
10 ng/ μl do DNA genômico e 5 pg/ μl do DNA plasmidial, estipulados de acordo ao
gradiente de concentração de DNA. Foram usados os isolados de A. flavus, A. awamore, A.
fumigatus, A. niger, F. solani f. sp. glycines, Penicillium citrinum, Trichoderma harzianum, e
Cladosporium cladosporioides para a diferenciação entre espécie e outros gêneros de A. flavus
(figura 22). Testes utilizando 48 isolados de A. flavus (10 ng/μl) e IAC (5pg/μl) também foram
feitos (figura 23).
58
M1 2 3 4 5 6 7 8 9
400pb
300pb
Figura 20: Limite de detecção de A. flavus com os primers ASPITSF2 e ASPITSR3. M: marcador 1 kb
ladder plus; 1 ao 8: produtos de PCR amplificados com 20 ng, 5 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg
e 10 fg de DNA genômico de A. flavus; 9: controle negativo.
M1 2 3 4 5 6 7 8 9
400bp
300bp
Figura 21. Limite de detecção de A. flavus e IAC. M: marcador 1 Kb ladder Plus; 1: concentração do
IAC 10 ng; 2: concentração do IAC 1 ng; 3: concentração do IAC 100 pg; 4: concentração do IAC10
pg; 5: concentração do IAC 1 pg; 6: concentração do IAC 100 fg; 7: concentração do IAC 10 fg; 8:
concentração do IAC 1 fg; 9: controle negativo. A. flavus manteve uma concentração padrão de 10ng
em todas as reações.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
300bp
Figura 22: Amplificação de PCR específica de A. flavus e IAC. M: marcador 1 Kb ladder Plus; 1 ao 3:
isolados UCB036, UCB040 w UCB044 de A. flavus; 4: isolado 1 de A. awamori; 5: isolado 1 de A.
fumigatus; 6: isolado 1 de A. niger; 7 e 8: isolados CMUnB 1824 e 1848 de F. solani f. sp. glycines; 9:
isolado CMUnB 1974 de F. solani; 10: isolado 1 de Penicillium citrinum; 11: isolado 1 de Trichoderma
harzianum; 12: isolado 1 de Cladosporium cladosporioides; 13: controle negativo.
59
M 1
2 3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
400bp
300bp
M 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
M 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49
Figura 23: Amplificação de PCR específica A. flavus e IAC com os primers ASPITSF2 e ASPITSR3, M:
marcador 1 kb ladder plus; 1 ao 48: UCB001 – UCB048; 49: controle negativo.
5.1 Otimização de primers específicos para regiões do mtDNA SSU
rDNA de Aspergillus flavus.
Primers específicos candidatos para detecção molecular do gênero Aspergillus foram
desenhados a partir do mtDNA SSU rDNA. As seqüências iniciadoras forward
ASP_GEN_MTSSU_F1
e
ASP_GEN_MTSSU_F2
e
a
seqüência
reverse
ASP_GEN_MTSSU_R1, estão presentes nos gêneros Aspergillus. A seqüência iniciadora
reverse ASP_FLA_FLU_OCH_MTSSU_R é especifica para A. flavus, A. fumigatus e A.
ochracius. O tamanho esperado dos produtos de PCR com estes pares de primers
específicos é de 480bp.
Foram feitos gradientes de temperatura variando entre 63.2 a 71,1ºC utilizando-se os
primers ASP_GEN_MTSSU_F2 e ASP_GEN_MTSSU_R1 com 3 isolados de A. flavus, 1 de
A. fumigatus e 1 de Trichoderma harzianum. O gradiente de temperatura mostra (figura 24) que
houve afinidade dos primers até a temperatura 68,5°C. Na mesma figura 9 estão os testes de
sensibilidade em duas temperaturas, 64,4 e 66,3°C, detectando até 10pg do DNA genômico de
Aspergillus.
60
MAFTC AF TC AF TC AF TC AFTC
400bp
Amplificação
específica de
Aspergillus
63.2•C
64,4•C
66,3•C
67,4•C
68,5•C
a
M1 2 34 5 6 7 C
1 2 34 5 6 7 C
Limite de
detecção de
Aspergillus
400bp
64,4 • C
66,3•C
b
c
Figura 24: Amplificação de PCR específica para Aspergillus e limite de detecção para Aspergillus com
os primers ASP_GEN_MTSSU_F2 e ASP_GEN_MTSSU_R1. a) amplificação específica de
Aspergillus. M: marcador 1kb ladder plus; A: isolado UCB003 de A. flavus; F: isolado 1 de A.
fumigatus; T: isolado 1 de Trichoderma harzianum; C: controle negativo b) Limite de detecção de
Aspergillus com temperatura de anelamento à 64,4°C. M: marcador 1kb ladder plus; 1 ao 7:
concentração do DNA genomico 10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001, e 0.0001ng, respectivamente; C: controle
negativo. c) Limite de detecção de Aspergillus com temperatura de anelamento a 66,3°C. M:
marcador 1kb ladder plus; 1 ao 7: concentração do DNA genomico 10, 5, 1, 0.1, 0.01, 0.001, e
0.0001ng, respectivamente; C: controle negativo.
1.11 Desenho e otimização do controle de amplificação interno
(IAC) para o sistema de PCR da região do mtDNA SSU rDNA
específico para Aspergillus.
O IAC, como já foi apresentado anteriormente, possui diferentes métodos de ser
desenvolvido. Outro método utilizado é a amplificação com primers que possuam sítios de
anelamento do IAC diferentes dos sítios de anelamento do DNA genômico, impedindo a
formação de quimeras quando amplificados. Os primers utilizados para o IAC especifico
para a região do mtDNA SSU rDNA de Aspergillus foram ASP_GEN_MTSSU_F1 e
ASP_GEN_MTSSU_R1, e M13 reverso.
O IAC específico para a região do mtDNA SSU rDNA de Aspergillus foi desenvolvido a
partir do fragmento de 480bp gerado pelo par de primers ASP_GEN_MTSSU_F1 e
ASP_GEN_MTSSU_R1. Em seguida, uma digestão foi realizada com a enzima SnaBI
cortando o fragmento na posição 154, gerando dois fragmentos, um com 154 bp e outro com
326 bp (figura 25). Ambos os fragmentos foram eluidos do gel, um contendo o sítio de
61
anelamento para o primer ASP_GEN_MTSSU_F1 e o outro contendo o sítio de anelamento
para o primer ASP_GEN_MTSSU_R1.
O motivo para a eluição de ambos os fragmentos foi uma medida de aproveitamento de
ambos os fragmentos. Porém após o processo de adenilação, ligação e transformação, foi
realizada uma PCR de colônia com duas colônias azuis negativas e quatro colônias brancas
positivas para a presença de inserto. Duas colônias retiradas da placa transformada com o
inserto de 154bp e duas retiradas da placa transformada com o inserto de 326bp. Somente
uma colônia apresentou o inserto esperado, 154bp, sendo as outras três colônias falsas
positivo.
M
1
1
1
1
1
300bp
200bp
100bp
Fragmento de
326bp
Fragmento de
154bp
Figura 25: Digestão do fragmento de DNA gerado pelos primers ASP_GEN_MTSSU_F1 e
ASP_GEN_MTSSU_R1 pela enzima SnaBI. M: marcador molecular 1 Kb ladder Plus; 1: fragmento de
DNA diferido pela enzima SnaBI.
Os primers utilizados para a amplificação do IAC e DNA genômico foram
ASP_GEN_MTSSU_F1 e ASP_GEN_MTSSU_R1, e M13 reverse, onde o anelamento ocorre
na posição 176 do vetor pGEM-T easy e gerando um fragmento de 330pb, e apresentando
melhor especificidade a uma temperatura de anelamento a 60°C.
Também foi realizado um gradiente de concentração do DNA plasmidial com 9
diluições, 10 ng, 5 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg e 1 fg onde as concentrações
de 1 ng e 100 pg foram estabelecidas como as melhores concentrações, usando uma
concentração de 10 ng para o DNA genômico (figura 26).
62
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
400bp
300bp
Figura 26: Gradiente de concentração do DNA plasmidial, IAC. M: marcador molecular 1Kb ladder
Plus; 1: concentração do IAC 10 ng/μl; 2: concentração do IAC 5 ng/μl; 3: concentração do IAC 1
ng/μl; 4: concentração do IAC 100 pg/μl; 5: concentração do IAC 10 pg/μl; 6: concentração do IAC 1
pg/μl; 7: concentração do IAC 100 fg/μl; 8: concentração do IAC 10 fg/μl; 9: concentração do IAC 1
fg/μl. Todas as reações possuem DNA genômico de A. flavus a 10ng.
Também foram realizados testes para a especificidade do DNA plasmidial e
genômico, onde foram utilizados isolados 36, 40 e 44 de A. flavus, isolado 1de A. awamore,
isolado 1 de A. fumigatus, A. niger, Penicillium citrinum, Trichoderma harzianum, e
Cladosporium cladosporioides para a diferenciação entre gêneros de A. flavus. A concentração
do DNA plasmidial usada foi de 100pg e DNA genômico de 10ng por reação de PCR (figura
27).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
400bp
300bp
Figura 27: Amplificação de PCR específica de Aspergillus e IAC. M: marcador 1 Kb ladder Plus; 1 ao
3: isolados UCB036, UCB040 e UCB044 de A. flavus; 4: isolado 1 de A. awamori; 5: isolado 1 de A.
fumigatus; 6: isolado 1 de A. niger; 7 e 8: isolados CMUnB 1824 e 1848 de F. solani f. sp. glycines; 9:
isolado CMUnB 1974 de F. solani; 10: isolado 1 de Penicillium citrinum; 11: isolado 1 de Trichoderma
harzianum; 12: isolado 1 de Cladosporium cladosporioides; 13: controle negativo.
63
1.12 Análise da diversidade nucleotídica dos genes aflR, aflP e aflQ
da via biossintética de aflatoxinas em populações de
Aspergillus flavus aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos
1.12.1
Otimização de primers específicos para os genes aflR,
aflP e aflQ
A partir do genoma completo da via biossintética de aflatoxinas em A. flavus (Genbank), foram
desenhados 13 pares de primers (Primer3) com sobreposições para os genes aflQ, aflP e aflR de A.
flavus. Um gradiente de temperatura foi realizado com temperaturas variando entre 45 até 65°C, onde
a temperatura estipulada foi de 60°C para todos os primers, com exceção dos pares de primers
AFLP_F2 e AFLP_R2 e AFLR_F1 e AFLR_R1 que tiveram suas temperaturas estipuladas
para 50°C (tabela 3) (figura 28).
a
45°C
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
c
55°C
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
b
50°C
60°C
d
65°C
Figura 28: Gradiente de temperatura utilizando os primers sintetizados para os genes aflQ, aflP e aflR
da via biossintética de aflatoxinas de A. flavus. a) Temperatura de anelamento a 45°C. b)
Temperatura de anelamento a 50°C. c) Temperatura de anelamento a 55°C. d) Temperatura de
anelamento a 60°C. e) Temperatura de anelamento a 65°C. M: marcador molecular 1kb ladder plus;
1: combinação dos primers AFLP_F1 e AFLP_R1; 2: combinação dos primers AFLP_F2 e AFLP_R2; 3:
combinação dos primers AFLP_F3 e AFLP_R3; 4: combinação dos primers AFLP_F4 e AFLP_R4; 5:
combinação dos primers AFLR_F1 e AFLR_R1; 6: combinação dos primers AFLR_F2 e AFLR_R2; 7:
combinação dos primers AFLR_F3 e AFLR_R3; 8: combinação dos primers AFLR_F4 e AFLR_R4; 9:
combinação dos primers AFLQ_F1 e AFLQ_R1; 10: combinação dos primers AFLQ_F2 e AFLQ_R2;
11: combinação dos primers AFLQ_F3 e AFLQ_R3; 12: combinação dos primers AFLQ_F4 e
AFLQ_R4; 13: combinação dos primers AFLQ_F5 e AFLQ_R5. Todas as reações foram feitas com o
isolado UCB001 de A. flavus.
e
64
1.12.2
Seqüenciamento dos genes aflR, aflP e aflQ da via
biossintética de aflatoxinas em Aspergillus flavus
Um total de 310 seqüências de alta qualidade foram gerados até hoje, a partir de
produtos de PCR purificados. Isso representa 55% do total esperado para os 63 isolados de
A. flavus, com os 13 pares de primers específicos para os três genes candidatas da via
biossintetica de aflatoxinas. Um resumo do número de seqüências amplificadas consta em
apêndice f.
1.12.3
Análise da diversidade nucleotídica inter e intraespecífica dos genes aflR, aflP e aflQ da via biossintética de
aflatoxinas no gênero Aspergillus
A partir de seqüências completas no GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) dos
genes aflR, aflP e aflQ de A. flavus, A. parasiticus e A. oryzae foram geradas anotações por
meio do Artemis, onde foram determinados os tamanhos de íntrons e éxons de cada gene
(figuras 29, 30 e 31). Os três genes possuem tamanhos de íntrons e éxons iguais para as
três espécies, sendo o gene aflR o único formado por um éxon com tamanho de 1335 pb.
Em A. flavus, o tamanho em pares de bases dos íntrons e éxons para o genes aflQ e
aflP é dado pela tabela 5. O gene aflQ é composto por sete éxons e seis íntrons. Cada éxon
possui variações de tamanhos em pares de bases entre 130 à 400pb. Já para o gene aflP
que possui cinco éxons e quatro íntrons, o tamanho dos éxons variam entre 110 à 370pb.
Todos os íntrons dos genes aflQ e aflP possuem tamanhos em pares de bases menores do
que os éxons, característico de todos os fungos.
Uma análise comparativa realizada entre as seqüências do Genbank de A. flavus, A.
parasiticus e A. oryzae para os genes aflR, aflP e aflQ, mostrou que o produto do gene aflR
é uma proteína reguladora da biossíntese de aflatoxina para as 3 espécies. Semelhante às 3
espécies de Aspergillus, o gene aflP produz a O-metiltransferase A, que tem como função a
conversão da stegmatocistina para O-metilsterigmatocistina e dihi-O-metilsterigmatocistina.
O gene aflQ em A. parasiticus e A. oryzae tem como produto uma oxidoreductase A e tem
como função a conversão do O-metilsterigmatocistina em AFB1 e AFG1, e dihi-Ometilsterigmatocistina em AFB2 e AFG2. Já o gene aflQ de A. flavus, produz a Glucosemethanol-choline oxidoreductase, com função de síntese do versiclorin B sintase (VBS).
65
Figura 29: Gene aflR de A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae. Tamanho em pb esperado do gene e
éxon.
Figura 30: Gene aflP de A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae. Tamanho em pb esperado do gene e
seus respectivos éxons.
66
Figura 31: Gene aflQ de A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae. Tamanho em pb esperado do gene e
seus respectivos éxons.
Tabela 5: Tamanho esperado, em pares de bases para os éxons e ítrons dos genes aflP e aflQ em A.
flavus.
GeneaflQ Tamanhoempb
GeneaflP Tamanhoempb
Exon 1
370
Inrtron 2
60
Exon 2
124
Intron3
59
Exon3
110
Intron 4
52
Exon 4
361
Intron 5
59
Exon 5
292
Exon 1
196
Intron 1
76
Exon 2
130
Intron 2
55
Exon 3
192
Intron 3
64
Exon 4
152
Intron 4
49
Exon 5
Intron 5
Exon 6
Intron 6
Exon 7
245
58
272
62
400
Considerando que a taxa de mutação em eucariotos é de 10-4 a 10-6 por gene por
geração, observou-se em análise de diversidade genética dos genes aflQ, aflP e aflR de A.
flavus, A. parasiticus e A. oryzae, que para o gene aflR ocorrem 25 SNPs significando, 1
SNP a cada 53.4pb. Dentre os 25 SNPs a mudança de aminoácidos ocorre em 11 deles.
67
Comparando seqüências de A. flavus em relação à A. parasiticus, estão presentes 21
SNPs, onde 3 deles ocorrem na primeira base, 6 na segunda base e 14 na terceira base do
códon de aminoácidos. Em comparação com A. flavus e A. oryzae, as mutações são menos
severas, onde uma ocorre na primeira base, uma na segunda base e duas na terceira base
do códon de aminoácidos. Entre todas as mudanças de troca de aminoácidos, uma das
mais significativas é a que ocorre na posição 1075, a troca de uma valina por uma
metionina, um códon de iniciação (figura 32). Essas mudanças mostram que, para o gene
aflR, A. parasiticus possui 23 sítios polimórficos em relação à A. flavus enquanto A. oryzae
possui 5 sítios polimórficos. Mostrando que A. parasiticus está mais distante geneticamente
de A. flavus do que A. oryzae em relação ao gene aflR (figura 33).
Figura 32: SNPs entre A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae que ocorrem para o gene aflR. Mudanças
de aminoácidos entre as espécies em decorrência dos SNPs.
68
Figura 33: Distância genética entre o gene aflR de A. flavus, A. parasiticus e A. oryzae.
Analisando seqüências do gene aflP, observou-se ocorrência de 61 SNPs, ou seja, 1
SNP a cada 24,3 pb. Dentre os 61 SNPs ocorrem mudanças de aminoácidos em 15 deles.
Comparando as seqüências de A. parasiticus e A. flavus, estão presentes 5 mutações na
primeira base, 7 na segunda base e 21 na terceira base do códon de aminoácidos.
Seqüências de A. oryzae comparadas com as de A. flavus, foram observados 2 mutações
na primeira base, 2 mutações na segunda base e 11 mutações na terceira base do códon de
aminoácidos (figura 34). Em relação ao gene aflP, A. parasiticus e A. flavus continuam
distantes geneticamente, em comparação à A. flavus e A. oryzae.
69
Figura 34: SNPs entre A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae do gene aflP. Mudança de aminoácidos
entre as espécies em decorrência dos SNPs.
Já o gene aflQ apresentou 151 SNPs, uma média de ocorrência de 1 SNP a cada
12,9 pb. Seqüências de A. parasiticus mostraram 13 mutações na primeira base, 3 na
segunda base e 70 na terceira base de códon de aminoácidos em relação à seqüência de A.
flavus. Comparando as seqüências de A. oryzae e A. flavus, observou-se a ocorrência de 3
mutações na primeira base e 10 na terceira base do códon de aminoácidos (figura 35).
Comparações das seqüências revelaram que a freqüência de mutação para este gene é
quatro vezes maior em relação ao gene aflR e quase duas vezes maior em relação ao gene
aflP.
70
Figura 35: SNPs entre A. parasiticus, A. flavus e A. oryzae do gene aflQ. Mudança de aminoácidos
entre as espécies em decorrência dos SNPs.
A via biossintética de aflatoxinas em A. flavus possui um tamanho de 78264pb, onde
estão localizados 22 genes, seqüência essa que foi depositada no Genbank em 2004.
71
Entretanto, de acordo com novos estudos, já são descritos 29 genes (Georgianna, et al.,
2008) (figura 36).
Figura 36: Grupo de genes da via biossintética de aflatoxinas em A. flavus. Seqüência do grupo de
genes de 78264pb. Total de 22 genes da via biossintética. Distância entre os 3 genes estudados,
aflR, aflQ e aflP.
A partir do alinhamento de seqüências de 8 isolados de A. flavus produtores de
aflatoxinas e 6 isolado com toxina não detectável, foram encontrados onze SNPs e sete
haplótipos. O haplótipo mais freqüente foi o haplótipo 6, que ocorreu em 6 dos isolados
analisados.
Tabela 6: SNPs entre isolados de A. flavus. G1 e G2: isolados de B.excelsa com origem da Amazônia;
G3: A. occidentale com origem do Piauí.
SNP
Posição
P UCB042
P UCB032
P UCB031
NP UCB018
P UCB023
P UCB024
P UCB033
G2
G1
G2
G3
G3
G3
G2
1
78
C
T
C
C
T
C
C
2
84
G
A
G
G
G
A
G
3
4
5
6
7
8
9
10 11
93 100 101 102 103 105 212 236 170 Haplótipo Freqüência
A G
C
T
A TC A
A
A
6
6
A G
C
T
A TC A
A
A
5
2
A G
A
T
A CC A
A
A
2
2
A G
C
T
A CC A
A
A
3
1
A G
C
T
A TC A
A
A
4
1
A G
A
T
A TC A
A
A
7
1
G A
C
C
C TT C
C
G
1
1
ND – Aflatoxina não detectável
P – Produtor de aflatoxina
72
6 Discussão
A necessidade de métodos de diagnose molecular no Brasil é dada não somente como
um método preventivo, mas também pelo acesso limitado para análises baseadas em
cromatografia para a presença de aflatoxinas. Tendo em vista o grande volume de produção
agrícola produzida pelo Brasil e a baixa quantidade de laboratórios credenciados a realizar
essas análises. Esses dados indicam que a produção de grãos brasileiros tem acesso
limitado à diagnose cromatográfica para produtos destinados ao mercado interno.
Resultados falso-negativos em lotes destinados à exportação também são muito freqüentes,
onde a detecção molecular do fungo aflatoxigênico antes da exportação poderia servir como
uma ferramenta importante de auxílio para a identificação da fonte de contaminação, e para
implementação da prevenção de contaminação por fungos produtores de aflatoxinas na
qualidade dos programas de controle como o HACCP. Com o intuito de gerar estratégias de
diagnose molecular para A. flavus aflatoxigênico, quatro estratégias moleculares foram
avaliadas, cada qual com potenciais resultados discriminatórios.
Baseado na caracterização cromatográfica de 63 isolados de A. flavus quanto à
produção de aflatoxinas por meio de CCD, e comparados em dois meios indutivos para a
produção de aflatoxinas, 90% das amostras de A. flavus isoladas a partir de A. occidentale
mostraram produção de níveis detectáveis de aflatoxina B1, antes descrito somente como
produtor de aflatoxina G1 em hospedeiros de A. occidentale (Freire et al.., 1999).
Embora ambos os meios de cultura sejam indutores da produção de aflatoxinas, os
níveis detectados nas amostras em meio YES foram 16% maiores que os níveis de
aflatoxinas detectados em meio CYA, mostrando que o meio YES possui uma maior
indutividade para a produção de aflatoxinas.
Apesar de 14 (22%) isolados não terem apresentado níveis de aflatoxinas
detectáveis, não elimina a hipótese de o isolado ser produtor de aflatoxinas, uma vez que os
testes realizados por meio de CCD não detectam níveis de toxinas baixos (Lin, et al.., 1998).
Devido à falta de precisão pela análise de CCD, fazem-se necessárias análises de produção
de aflatoxinas por meio de CLAE não só neste trabalho, mas assim como, nos demais
laboratórios do Brasil credenciados para análises cromatográficas.
Os resultados obtidos por meio de CCD co-relacionam com os dados descritos pela
literatura, onde grande parte das culturas de castanha do Pará, castanha do Brasil,
amendoim e milho são mais suscetíveis a contaminação por fungos produtores de
aflatoxinas (Hirano et al., 2001; Vargas et al., 2001; Gonçalez et al., 2008; De Mello &
Scussel, 2007). Caldas et al., 2002 em parceria com o Laboratório Central de Saúde Pública
73
do Distrito Federal, Brasília, realizaram uma análise para detectar os níveis de aflatoxinas
em alimentos para consumo do Distrito Federal. Em 366 amostras de alimentos, composta
por amendoim e derivados, castanhas, milho, produtos de trigo e aveia, arroz e feijão, foram
detectadas aflatoxinas em 19,6% das amostras. Amendoim e derivados apresentaram a
maior incidência de contaminação de 34,7%. Das amostras positivas, aflatoxina B1 estava
presente em 98.5%, aflatoxina B2 em 93%, aflatoxina G1 em 66.7% e aflatoxina G2 em
65.4%. Os níveis de aflatoxina encontrados ultrapassam os níveis aceitos pela legislação
brasileira, significando um grande fator de risco para a população que consome esses
alimentos regularmente.
Com intuito de revelar a variabilidade genética de A. flavus aflatoxigênico e identificar
seqüências candidatas para o desenho de primer para detecção molecular de amostras
aflatoxigênicos por meio de RAPD SCAR, 32 primers de RAPD foram utilizados. As análises
fenéticas associadas com os dados de RAPD revelaram dois grupos distintos com uma
possível correlação com a produção de aflatoxinas por A. flavus. Além disso, ambos os
grupos agruparam A. flavus por região de origem e hospedeiro, mostrando que a população
de A. flavus possui grande diversidade genética, concordando com os resultados obtidos por
Midorikawa et al. (2008). Essa correlação pode indicar que origens separadas de A. flavus
para cada tipo de hospedeiro, ou que a maioria dos isolados de castanha de caju e castanha
do Brasil tenham se tornado clones isolados de acordo com o seu hospedeiro com pressão
seletiva para conservar genes envolvidos na especificidade do hospedeiro, restringindo o
fluxo contínuo de genes entre isolados de outros hospedeiros. Assim como em muitos
ascomicetos, a população de A. flavus de solo estudada por Geiser et al. (1998) eram
clones. Entretanto, estudos relatam que há a diversidade intra-específica entre A. flavus de
solo (Griffin et al., 2001; Ehrlich et al., 2007)
Embora as amostras estudadas tenham sido correlacionadas de acordo com a região
de origem e hospedeiro em estudo prévio (Midorikawa et al., 2008), a diversidade genética
detectada utilizando 32 primers de RAPD não diferenciaram isolados de A. flavus produtor
de aflatoxina e não produtor de aflatoxina. Nenhuma banda monomórfica para A. flavus
produtor de aflatoxina foi identificada para posterior aplicação na detecção de isolados
aflatoxigênicos por meio de RAPD SCAR. Esses resultados também foram relatados por
Fungaro et al. (2004) que isolaram 29 amostras de A. niger, 17 amostras de A. tubingensis e
29 amostras de A. carbonarius, onde foram analisados 71 locos por meio de RAPC. A partir
de bandas monomórficas de A. carbonarius geradas, um fragmento denominado OPX7809 foi
clonado e seqüenciado. Com base na seqüência do OPX7809, primers específicos foram
desenhados, o OPX7F809 e OPX7R809, onde mostraram especificidade somente para A.
carbonarius. Uma segunda analise também foi feita com o intuito de diferenciar isolados de
A. carbonarius produtor de ocratoxina A (OTA) e isolados de A. carbonarius não produtor de
74
OTA. Para tanto, foi feito uma análise de RAPD utilizando 10 primers com 29 isolados de A.
carbonarius (23 toxigênicos e 6 não toxigênicos). Nenhuma correlação foi encontrada entre
o genótipo gerado pelo RAPD e produção de micotoxinas. Os resultados obtidos por
Fungaro et al. (2004) foram similar aos resultados obtidos por Tran-Dinh et al. (1999), e
Lourenço et al. (2007) onde os resultados da análise por RAPD suportam a caracterização
dos isolados de A. flavus, porém não diferenciam isolados de A. flavus toxigênicos dos não
toxigênicos.
Entretanto, sistemas de detecção por meio de RAPD SCAR têm sido relatados, por
exemplo, Voetz & Rath, (2002) desenvolveram um método de RAPD SCAR para diagnose
molecular em fungos produtores de ocratoxina A em Penicillium verrucosum e Aspergillus
ochraceus. Schilling et al. (1996) também aplicaram essa técnica para a diagnose específica
em espécies produtoras de micotoxinas como Fusarium culmorum, F. graminearum e F.
avenaceum. Geisen (1998) aplicou em potenciais produtores de fumonisinas, F. moniliforme,
F. nygamai, F. napiforme e F. proliferatum. Yoder & Christianson (1998) aplicaram em F.
crookwellense, F. sambucinum, F. torulosum e F. venenatum toxigênicos. Comparações
entre os perfis de RAPD também distinguiram isolados de F. moniliforme com alta e baixa
produção de fumonisinas (Jimenez et al., 2000). Geisen et al. (2001) usando dados de
seqüências de genes da via biossintética de Penicillium roquefortii da toxina PR, desenhou
três primers longos (21-25 nucleotídeos) para os genes ari1, nor1 e omt1, correlacionando
com a produção de metabólitos secundários.
Embora a técnica seja bem descrita para fungos produtores de micotoxinas, dentro do
gênero Aspergillus pouco tem sido descrito para diagnose de fungos aflatoxigênicos
baseada em RAPD. Entretanto, Morales et al. (1996) além de determinar relações
filogenéticas entre membros do gênero, relacionou espécies produtoras de aflatoxinas por
meio de RAPD. Apesar dos resultados obtidos não terem diferenciado A. flavus produtor de
aflatoxinas como o esperado, RAPD ainda é um meio para distinção de fungos produtores
de aflatoxinas, demonstrando ser uma técnica em potencial para a aplicação pelo HACCP
em diagnose de fungo.
Baseado em diversos alinhamentos de seqüências do gênero Aspergillus, assim como
outros gêneros de fungo freqüentemente isolados de castanha do Brasil e castanha de caju
contaminadas, foram gerados primers específicos para espécie A. flavus a partir de
seqüências da região ITS1 e ITS2 (White et al., 1990). Esses primers oferecem um potencial
sistema robusto de detecção de PCR de A. flavus, em conjunto com primers específicos
para genes da via biossintética de aflatoxinas, utilizando como um método de PCR múltipla
na diagnose molecular de amostras aflatoxigênicos em grãos brasileiros. A aplicação da
região conservada do rDNA nuclear ITS não codante para detecção molécula específica de
espécies têm sido considerável em fungos micotoxigênicos, sendo esta região, um grande
75
atrativo para ser utilizada como marcador molecular por possuir grande número de cópias
ao longo do genoma, assim, facilitando a sua amplificação por meio de PCR.
Kumeda & Asao (1996) relataram que análises da variabilidade da região rDNA ITS
por meio de SSCP e RFLPs pode ser utilizada para classificar amostras de Aspergillus da
sessão Flavi em 4 grupos, A. flavus/A. oryzae, A. parasiticus/A. sojae, A. tamarii e A.
nomius. Spreadbury et al. (1993), Zhao et al. (2001) desenvolveram primers específicos a
partir da região rDNA ITS para diagnose de tecidos do pulmão lesionados por A. fumigatus.
Radford et al. (1998) utilizaram a região rDNA IGS para discriminar A. fumigatus em nível
sub específico para o uso em monitoramento ambiental. Sugita et al.. (2004) desenvolveram
um sistema de detecção nested PCR usando primers derivados da região rDNA ITS para
isolados clínicos de A. fumigatus, A. niger e A. flavus. González et al. (2008) também
desenvolveram primers específicos a partir da região rDNA ITS para A. flavus contaminante
de farinha de trigo. Também foi desenvolvido primers específicos para A. carbonarius e A.
ochraceus (Patiño et al., 2005).
No caso de fungos micotoxigênicos, como os de gênero Fusarium, a variabilidade da
região rDNA ITS tem sido amplamente aplicada para relações taxonômicas (O'Donnel, 1992;
Grimm & Geisen, 1998, Waalwijk et al., 1996), onde também tem sido aplicada em detecção
molecular de patógenos (eg. Edel et al., 1996). Já Jurado, et al. (2006) desenvolveram
primers específicos para região IGS de Fusarium spp. contaminantes de arroz. Grimm &
Geisen (1998) desenvolveram um sistema de PCR-ELISA a partir de uma seqüência da
região ITS1, específico para espécies de Fusarium produtores de fumonisinas. Trabalhos
similares têm sido relatado utilizando a variabilidade da região rNDA ITS, onde são
aplicados para esclarecer posições taxonômicas de fungos do gênero Penicillium produtores
de ocratoxina (Vanittanakom et al., 2002; Mule, 2003),
Apesar de muitos autores desenvolverem sistemas de PCR específicos para a
diagnose de fungos micotoxigênicos, são poucos os trabalhos que citam o uso de um IAC.
Paterson, (2006) coloca o uso do IAC como fundamentais quando utilizados em sistemas de
PCR para diagnose de fungos, seja para diagnose de doenças ou micotoxinas, evitando-se
resultados falsos negativo e uma medida de segurança como conseqüência.
Khot et al. (2008) desenvolveram um IAC a ser utilizado em conjunto com região do
gene 18S rDNA para detectar aspergilose invasiva em fluidos broncoalveolar em um sistema
de PCR múltipla. Degola et al. (2008) desenvolveram um sistema de RT-PCR quintuplex
para a diagnose de A. flavus aflatoxigênico e IAC desenhado a partir do gene beta-tubulina.
Também desenvolvido para detecção de espécies de Fusarium produtores de fumonisinas e
tricotecenos, um sistema de RT-PCR múltiplo com IAC desenvolvido a partir de seqüências
de rDNA de Fusarium (Bluhm et al., 2004). Midorikawa et al. (2008) utiliza o IAC em um
76
sistema de PCR específico para A. flavus rDNA ITS, onde ambos os fragmentos serão
amplificados com o mesmo par de primers.
Semelhante ao sistema de PCR da região do rDNA ITS, baseado em alinhamentos de
seqüências amplificadas de 48 isolados de A. flavus pelos primers universais MS1 e MS2
(White et al., 1990) e seqüências de isolados de A. fumigatus, A. niger, A. ochraceus, A.
penicillioides, A. silvaticus e A. versicolor disponíveis no Genbank foram desenvolvidos primers
específicos para o gênero Aspergillus. O sistema de PCR da região do mtDNA SSU rDNA em
conjunto com um IAC, mostrou ser específico e com limite de detecção de até picogramas para
isolados do gênero Aspergillus. Possibilitando a sua utilização, em conjunto com o sistema de
PCR da região do rDNA ITS, na diagnose de A. flavus em programas como HACCP.
A região do mtDNA SSU rDNA têm sido utilizada como marcador de fungos por possui
um alto grau de variabilidade estrutural. Por ser de origem materna e possuir uma taxa de
mutação maior que o rDNA nuclear, o mtDNA é bastante usado para estudos de evolução.
Além de possuir grande número de cópias no genoma, o mtDNA tem mostrado possuir
grandes variações a nível intra-específico (Moody & Tyler, 1990; Juhász et al., 2007). Ferns
et al. (2002) utilizando o método de PCR específico para mtDNA de A. flavus e A. fumigatus
identificaram entre sete pacientes, seis com suspeita de infecção fúngica. Já Wang et al.
(2001), a partir do gene do citocromo b em mtDNA, determinaram amostras de Aspergillus
da sessão Flavi, onde foi possível a diferenciação de A. sojae, A. parasiticus, A. flavus, A.
oryzae, A. tamarii e A. nomius.
Em busca do desenvolvimento de um sistema de PCR múltiplo para a diagnose de A.
flavus aflatoxigênico em diferentes lavouras tem-se explorado o grupo de genes codificantes
para a biossintese de aflatoxinas (Woloshuk & Prieto, 1998; Sweeney & Dobson, 1999),
onde diversos autores relatam os números homólogos de genes biossintéticos em amostras
não aflatoxigênicos (Geisen, 1998; Criseo et al., 2001; Chen, 2002). Nosso estudo tem
analisado o potencial de 13 pares de primers específicos que tem como alvo os genes aflQ,
aflP e aflR candidatos para a via biossintética de aflatoxina, em conjunto com análises para
a presença de SNPs associados com o fenótipo para a produção de aflatoxina.
As anotações feitas para as três espécies de Aspergillus, A. flavus, A. parasiticus e
A. oryzae, mostraram que apesar dos três genes possuírem tamanhos iguais de exons e
introns foi encontrado um grande número de sítios polimórficos, 25 SNPs no gene aflR, 61
SNPs no gene aflP e 151 SNPs no gene aflQ, diferente do esperado que seria a presença
de pouco polimorfismo. As análises da diversidade nucleotídica dos três genes em A. flavus,
A. parasiticus e A. oryzae mostraram que A. flavus possui maior similaridade das
seqüências com A. oryzae do que A. parasiticus. Chang & Ehelich (2006), comparando a
filogenia de isolados de A. oryzae e esclerótia tipo-L e tipo-S de isolados de A. flavus por
meio de SNPs no gene aflP, e deleções nas regiões intergênicas de aflF-aflU, mostraram
77
que isolados de A. oryzae formaram um clado semelhante ao subgrupo de isolados de A.
flavus atoxigênico tipo-L. Todos os isolados toxigênicos tipo-L de A. flavus, ao contrário de
A. oryzae, possuem uma deleção de 1 kb na região entre os genes aflF-aflU. Embora
isolados de A. oryzae tipo-S tenham uma supressão de 1.5 kb na região entre os genes aflFaflU, isolados de A. flavus tipo-S não foram relacionados nos clados. O autor mostra que a
população de A. flavus e A. oryzae são diversas geneticamente, podendo isolados de A.
oryzae ter descendido de isolados de A. flavus atoxigênico tipo-L.
A freqüência de SNPs nos genes aflR, aflP e aflQ em A. flavus, A. parasiticus e A.
oryzae mostraram que no gene aflR possui aproximadamente a metade da freqüência de
SNPs em relação ao gene aflP e um quarto da freqüência de SNPs em relação ao gene
aflQ, sendo um gene regulador e não possuindo introns, este possui uma região mais
conservada. Chao-Zong et al. (2006) mostraram similaridade maior que 96% entre o gene
aflR de 23 espécies de Aspergillus. Já Yu et al. (1995) em comparação de seqüências de
cDNA do gene aflP de A. flavus e A. parasiticus revelaram 97% de identidade entre as
seqüências codantes.
A grande ocorrência de mutações na primeira e segunda base do códon de
aminoácidos são consideradas mais severas do que mutações na terceira base, pois
normalmente levam à mudanças de aminoácidos que podem mudar a polaridade e
hidrofobicidade do aminoácido. Essas mudanças podem atuar mudando a conformação da
proteína, e inibindo a sua função. A grande ocorrência de mutações na primeira base do
códon de aminoácidos no gene aflQ, pode ser relacionada por este ser um dos precursores
finais da via biossintética de aflatoxinas.
Tominaga et al., (2006) mostraram que apesar da similaridade de 97-99% dos
genes de A. oryzae envolvidos na biossíntese de aflatoxina em comparação com A. flavus, 3
genes compartilharam 93% ou menos de similaridade, onde deleções no genes aflT de
257pb, substituições no gene aflE e substituições no gene aflN foram encontradas em A.
oryzae. Na região promotora de aflR, 2 substituições foram encontradas em um dos três
sítios de ligação do AreA e no sitio de ligação do FacB. Foram desenhados primers para os
genes aflT, aflD, aflR, aflE, aflG, aflL, e aflK. Os resultados gerados a partir de 210 amostras
de A. oryzae foram classificadas em 2 grupos. Grupo 1 contendo 58.1% das amostras
analisadas com amplificação dos 7 genes, e grupo 2 com 36.7% das amostras
caracterizadas possuindo somente os genes aflK, aflL e aflG. Os autores descreve que a
falta de expressão dos genes aflG, aflK, aflL e aflP, que são necessários para a produção de
aflatoxinas, no grupo 1 pode estar relacionada com a pouca expressão do gene aflR. Esses
resultados sustentam a hipótese de que apesar de A. oryzae possuir genes relacionados
com a produção de aflatoxinas como aflP e aflQ, mutações ocorridas na região promotora
do gene regulador, aflR, inibe a produção da toxina pelos decorrentes genes estruturais.
78
Autores têm evidenciado que a produção ou a falta de produção da aflatoxina estão
em deleções, inserções, substituições nos genes envolvidos da via biossintética. Chang et
al. (2005) utilizaram sistemas de PCR com primers específicos para genes que induzem a
produção de aflatoxina em 38 isolados de A. flavus, onde foram formados oito
agrupamentos (A-H). Os padrões C, E, G e H, cada um contendo deleções de 40kb foram
analisadas pelos breakpoints das seqüências. O padrão C apresentou breakpoints no aflU
3’UTR e em uma região codificante do aflN. Padrão E, tem um breakpoint na região codante
do amdA e outra no aflM 5’UTR. O padrão G contém uma deleção igual ao padrão C e tem
outra deleção que se estende da região codante do aflU até o final do cromossomo. O
padrão H apresenta uma deleção de todo o conjunto de genes aflatoxigênicos, desde a
região codante hexA do conjunto de genes da via metabólica do açúcar que se estende até
a região telomérica. O autor mostra que deleções no conjunto de genes codificantes para
aflatoxina entre isolados de A. flavus não são raras, e que os padrões tendem a ser
diversos.
Carbone et al., (2007) com intuito de elucidar as forças evolutivas que atuam na via
de aflatoxinas e O-metilsterigmatocistica, seqüenciaram 21 regiões intergênicas de todo o
conjunto de genes precursores de aflatoxinas em 24 isolados de A. parasiticus. Análises de
desequilíbrio de ligação revelaram cinco blocos distintos de recombinação no conjunto de
genes de A. parasiticus. Análises filogenéticas mostraram uma história de recombinação
entre haplótipos chemotype específicos, assim como evidências de recombinação
contemporânea. Também foram realizadas simulações de coalescência nas variações dos
blocos de recombinação, onde foi encontrada uma coalescencia duas vezes mais profunda
para grupos de genealogias, comparado com genealogias não agrupadas, ou padrão interno
para evolução neutra. Esse padrão indica uma selação balanceada no grupo de genes
aflatoxigênicos de A. parasiticus.
Ehrlich et al., (2003) investigaram o gene aflR de A. nomius, A. bombycis, A.
parasiticus, A. flavus e A. pseudotamarii, onde foi encontrada variabilidade nos elementos
consenso do promotor e regiões com motivos codantes, incluindo motivos envolvidos no
desenvolvimento da regulação de AbaA, BrlA, regulação da utilização de fonte de nitrogênio
(AreA), regulação do pH (PacC), e domínios de regiões codantes de PEST. Alguns desses
elementos podem afetar a expressão do gene aflJ que é transcrito a partir do aflR.
Comparações por alinhamentos e análises filogenéticas, mostram evidencias que os sinais
regulatórios envolvidos para produção de aflatoxinas, respondem a uma variação de
estimulações ambientais sob diferentes pressões seletivas.
A partir de análises de SNPs a nível intra-específico em 63 isolados de A. flavus, e
utilizadas em conjunto com primers específicos para regiões de rDNA ITS e mtDNA SSU
desenvolvidos no presente estudo, esses marcadores moleculares poderão oferecer um
79
padrão em potencial e confiável para a diagnose para A. flavus aflatoxigênico a ser utilizado
em programas de controle de qualidade de produtos agrícolas como o HACCP no Brasil.
80
7 Conclusões
Amostras de Aspergillus flavus isoladas de castanha do Brasil e castanha de caju de
diferentes localidades caracterizaram A. flavus produtor de aflatoxina B1, incluindo produção
de aflatoxina G1 em castanha do Brasil não descrita pela literatura. Considerável
diversidade genômica dessas amostras foi analisada por meio de RAPD, sugeriram que a
técnica de RAPD SCAR não é adequada para a diferenciação de A. flavus produtor do não
produtor de aflatoxina.
Análises das regiões rDNA ITS1 e ITS2 e mtDNA SSU rDNA permitiram o desenho
de primers específicos para espécie e gênero, e a partir desses produtos de PCR foram
desenhados IACs tornando o sistema de PCR confiável para a diagnose de A. flavus com
potencial inclusão em um método de PCR múltipla ou RT-PCR de fácil amplificação, devido
ao grande número cópias no genoma e limite de detecção sensível para ambas as regiões.
Além disso, marcadores desenvolvidos com estudo de SNPs em genes como, aflR, aflP e
aflQ da via biossintética de aflatoxinas em A. flavus apresentam grande potencial de
diferenciação de isolados aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos a ser utilizado em um
sistema de PCR robusto na detecção de A. flavus aflatoxigênico em sistemas de controle de
contaminações por fungos produtores de aflatoxinas em produtos agrícolas brasileiros
baseado no HACCP, dado o acesso limitado de análises por meio de cromatografia para
produtos destinados ao mercado interno brasileiro.
81
2 Trabalhos em andamento e perspectivas futuras
Para alcançar o objetivo geral do projeto, de desenvolvimento de um sistema de
diagnose molecular de A. flavus aflatoxigênico, aplicável em HACCP nas cadeias produtivas
de grãos no país, estão em andamento análises de seqüências completas dos genes aflR,
aflP e aflQ de amostras de A. flavus isolados de castanha do Brasil, castanha de caju e
amendoim de oito localidades, onde será analisada a diversidade nucleotídica intraespecífica e inter-especifica, identificando haplótipos e desequilíbrio de ligação em relação a
aflatoxigenicidade, origem geográfica e hospedeiro.
Em conjunto com análises cromatográficas de TLC, todas as amostras serão reanalisadas por meio de HPLC tendo em vista que o HPLC detecta a presença da toxina em
níveis mais baixos que o TLC, gerando resultados mais confiáveis em relação à
discriminação de isolados aflatoxigênicos e não aflatoxigênicos, já que resultados não
detectáveis da toxina por TLC não significam que o organismo seja não produtor, o que
pode este estar produzindo a toxina em níveis baixos não detectáveis pelo TLC.
Outros marcadores em potenciais no desenvolvimento de um sistema robusto de
PCR específico para A. flavus aflatoxigênico podem ainda incluir RAPD SCAR, ou
marcadores derivados de analises por AFLP. Considerando que a via biossintética de
aflatoxinas consta hoje com 29 genes diretamente envolvidos na síntese e regulação de
produção de aflatoxinas, vários genes, além dos três estudados neste trabalho, podem
servir como candidatos. Com a disponibilidade de métodos de seqüenciamento em larga
escala como Illumina (Illimina) e SOLID (Applied Biosystems) cada vez mais accessível,
onde análises de expressão gênica diferencial entre isolados aflatoxigênicos e não
aflatoxigênicos oferecem um caminho novo para identificação de todos os genes envolvidos
na síntese e regulação de produção de aflatoxinas.
82
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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102
Apêndices
103
Apêndice A
A.1. Cladograma de aflatoxigenicidade em A. flavus
A.2. Cladograma com primer B10
A.3. Cladograma com primer B20
A.4. Cladograma com primer C10
A.5. Cladograma com primer C20
A.6. Cladograma com primer D20
A.7. Cladograma com primer E10
A.8. Cladograma com primer E20
A.9. Cladograma com primer G10
A.10. Cladograma com primer H10
A.11. Cladograma com primer J10
A.12. Cladograma com primer J20
A.13. Cladograma com primer K10
A.14. Cladograma com primer K20
A.15. Cladograma com primer M10
A.16. Cladograma com primer M20
A.17. Cladograma com primer O10
A.18. Cladograma com primer O20
A.19. Cladograma com primer OPA02
A.20. Cladograma com primer OPA04
A.21. Cladograma com primer OPF10
A.22. Cladograma com primer OPF13
A.23. Cladograma com primer P10
A.24. Cladograma com primer P20
A.25. Cladograma com primer PM04
A.26. Cladograma com primer Q20
A.27. Cladograma com primer S10
A.28. Cladograma com primer T20
A.29. Cladograma com primer U20
A.30. Cladograma com primer V10
A.31. Cladograma com primer V20
A.32. Cladograma com primer X10
104
A.1. Cladograma de aflatoxigenicidade em A. flavus
A.2. Cladograma com primer B10
A.3. Cladograma com primer B20
105
A.4. Cladograma com primer C10
A.5. Cladograma com primer C20
A.6. Cladograma com primer D20
106
A.7. Cladograma com primer E10
A.8. Cladograma com primer E20
A.9. Cladograma com primer G10
107
A.10. Cladograma com primer H10
A.11. Cladograma com primer J10
A.12. Cladograma com primer J20
108
A.13. Cladograma com primer K10
A.14. Cladograma com primer K20
A.15. Cladograma com primer M10
109
A.16. Cladograma com primer M20
A.17. Cladograma com primer O10
A.18. Cladograma com primer O20
110
A.19. Cladograma com primer OPA02
A.20. Cladograma com primer OPA04
A.21. Cladograma com primer OPF10
111
A.22. Cladograma com primer OPF13
A.23. Cladograma com primer P10
A.24. Cladograma com primer P20
112
A.25. Cladograma com primer PM04
A.26. Cladograma com primer Q20
A.27. Cladograma com primer S10
113
A.28. Cladograma com primer T20
A.29. Cladograma com primer U20
A.30. Cladograma com primer V10
114
A.31. Cladograma com primer V20
A.32. Cladograma com primer X10
115
Apêndice B
B.1. Tabela de genes candidatos para análise de SNPs em genes da via biossintética.
116
B.1. Tabela de genes candidatos para análise de SNPs em genes da via biossintética.
Gene
Sinonimo
Resultados na
Literatura
Referencia
Primers
Seqüência
AflD
Nor-1
Correlaciona via RT
PCR com producao de
aflatoxina
Scherm et al.,
2005 Int J Food
Micro 98, 201
NOR1-F
NOR1-R
ACGGATCACTTAGCCAGCAC
CTACCAGGGGAGTTGAGATCC
Correlação de
expressão gênica via RT
PCR de produção de
afla e crescimento de A.
flavus
Mayer et al 2003.
Appl Environ Micro
69, 1154-1158
Não diferenciou afla v
não afla em PCR
múltiplo
AflO
AflP
****
AflQ
omtB,
dmtA
omtA,
omt1
ordA, ord1
Shapira et al 1996
Appl Environ Micro
62, 3270
Correlaciona via RT
PCR com produção de
aflatoxina
Criseo et al 2001
Lett Appl Micro 33,
291
Scherm et al.,
2005 Int J Food
Micro 98, 201
Regula conversão de
demethylsterigmatocysti
n para
esterigmatocistina
Motomura et al
1999 Appl Environ
Micro 65, 49874994
Correlaciona via RT
PCR com produção de
aflatoxina
Scherm et al.,
2005 Int J Food
Micro 98, 201
Ausente em fungos
produtores somente de
esterigmatocistina
Paterson, 2006
Process
biochemistry 41,
1467-1474
Converte
esterigmatocistina em
precursor de afla Omethylsterigmatocystin
Shapira et al 1996
Appl Environ Micro
62, 3270
MAS - Não diferenciou
afla v não afla em PCR
múltiplo
Converte Omethylsterigmatocystin
em aflatoxina
Teoricamente especifico
para fungos
aflatoxigenicos e
ausente em produtores
de esterigmatocistina
Correlação com
produção de afla via RT
PCR em A. parasiticus
Nenhuma correlação via
RT PCR com afla em A.
flavus – mas usando
primers desenhados
para A. parasiticus –
talvez por isso
PCR
produ
ct size
(bp)
990
omtB(F)-F
omtB(F)-R
Omt1-F
Omt1-R
GCCTTGACATGGAAACCATC
CCAAGATGGCCTGCTCTTTA
GCCTTGCAAACACACTTTCA
AGTTGTTGAACGCCCCAGT
1333
1490
Paterson, 2006
Process
biochemistry 41,
1467-1474
Sweeney et al
2000. Int J Food
Micro 56, 97-103
Scherm et al 2005
Int J Food Micro
98, 201-210
Scherm et
al 2005 Int
J Food
Micro 98,
201-210
Rodrigues
et al 2007
Comm
Current
Res Edu
Topics
Trends in
Appl
Micro, 527
Scherm et
al 2005 Int
J Food
Micro 98,
201-210
Rodrigues
et al 2007
Comm
Current
Res Edu
Topics
Trends in
Appl
Micro, 527
Scherm et
al 2005 Int
J Food
Micro 98,
201-210
Rodrigues
et al 2007
Comm
Current
Res Edu
Topics
Trends in
Appl
Micro, 527
Criseo et al 2001
Lett Appl Micro 33,
291
Scherm et al 2005
Int J Food Micro
98, 201-210
referencia
Ord1(P)-F
Ord1(P)-R
CGACTGTTGGCCTTTTCATT
ATAGCGAGGTTCCAGCGTAA
1088
Scherm et
al 2005 Int
J Food
Micro 98,
201-210
117
AflR
(regul
atory
gene –
ie
transcr
iption
factor)
Necessário para
expressão de
aflatoxinas
Mutação em A. sojae
Também presente em
fungos produtores de
somente
esterigmatocistina
Diferenciação de
espécies - SNPs no
5’UTR e região codante
em A. sojae separa de
A. flavus, parasiticus e
oryzae
Não diferenciou afla v
não afla em PCR
múltiplo
Chang et al., 2007
Appl Micro &
Biotec 76, 977984
AflR-F
AflR-R
CGAGTTGTGCCAGTTCAAAA
AATCCTCGCCCACCATACTA
999
Scherm et
al 2005 Int
J Food
Micro 98,
201-210
AflJ-F
AflJ-R
GAGTCCCTGAGTGTCGGCTA
TCGGTTGTCATCGTTATCCA
1450
Scherm et
al 2005 Int
J Food
Micro 98,
201-210
Ver1-F
Ver1-R
CCGTTTAGATGGCAAAGTGG
CTTTCAGGTGACCGAACGAT
899
Scherm et
al 2005 Int
J Food
Micro 98,
201-210
Chang et al., 2007
Appl Micro &
Biotec 76, 977984
Paterson, 2006
Process
biochemistry 41,
1467-1474
Chang et al 1995
Appl
Environ Microbiol
61:40–43
Lee et al 2006
Microbiology
152:161–170
Shapira et al 1996
Appl Environ Micro
62, 3270
Criseo et al 2001
Lett Appl Micro 33,
291
Correlação com
produção de afla via RT
PCR em A. parasiticus
AflS
(coactivat
or)
Aflj
Necessário para
expressão de
aflatoxinas
Mutação em A. sojae
Também presente em
fungos produtores de
sometne
esterigmatocistina
Truncado por causa de
codon de terminação em
A. sojae
pksA
AflM
Ver1
Não diferenciou afla v
não afla em PCR
múltiplo
Também amplifica em
produtores de somente
esterigmatocistina
Sweeney et al
2000. Int J Food
Micro 56, 97-103
Chang et al., 2007
Appl Micro &
Biotec 76, 977984
Chang et al., 2007
Appl Micro &
Biotec 76, 977984
Paterson, 2006
Process
biochemistry 41,
1467-1474
Chang et al., 2007
Appl Micro &
Biotec 76, 977984
Shapira et al 1996
Appl Environ Micro
62, 3270
Criseo et al 2001
Lett Appl Micro 33,
291
118
Apêndice C
C.1. Tabela de seqüências geradas a partir dos primers dos genes aflQ, aflP e aflR.
119
C.1.
Tabela de seqüência geradas a partir dos primers dos genes aflQ, aflP e aflR.
Isolado
aflQaflQaflQaflQaflQaflP1
2
3
4
5
1
UCB001
UCB002
X
X
X
UCB003
X
X
X
UCB004
X
X
X
UCB005
X
X
X
UCB006
X
X
X
X
UCB007
X
X
X
UCB008
X
X
X
UCB009
X
X
X
X
X
UCB010
X
X
X
X
X
UCB011
X
X
X
UCB012
X
X
X
X
UCB013
X
X
X
X
X
UCB014
X
X
X
X
UCB015
X
X
X
UCB016
X
X
UCB017
X
X
X
UCB018
X
X
X
X
UCB019
X
X
X
X
UCB020
X
X
X
UCB021
X
X
X
UCB022
X
X
X
X
X
UCB023
X
X
UCB024
X
X
UCB025
X
X
X
X
UCB026
X
X
X
UCB027
X
X
X
X
UCB028
X
X
X
UCB029
X
X
X
X
UCB030
X
X
X
X
X
UCB031
X
X
UCB032
X
UCB033
X
UCB034
X
X
UCB035
X
UCB036
X
X
X
UCB037
X
X
X
UCB038
X
X
UCB039
X
X
UCB040
X
X
UCB041
X
X
UCB042
X
UCB043
X
UCB044
X
X
UCB045
X
X
X
X
UCB046
X
UCB047
X
UCB048
UCB049
X
UCB050
X
X
X
UCB051
X
UCB052
X
X
X
X
X
UCB053
X
X
X
UCB054
X
X
UCB055
X
UCB056
X
UCB057
X
X
UCB058
X
X
X
X
UCB059
X
X
UCB060
X
X
UCB061
X
X
X
X
X
UCB062
X
X
X
UCB063
X
X
X
X
, seqüência gerada; X, seqüência não-gerada; -, não seqüenciado
aflP2
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
aflP3
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
aflP4
-
aflR1
-
aflR2
-
aflR3
-
aflR4
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
120
Anexo A – Resumos de participações em congressos
53º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 53º Congresso Brasileiro de Genética • 2 a 5 de setembro de 2007
Centro de Convenções • Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Specific primer design targeting the
mitochondrial DNA small subunit rRNA
gene region for molecular detection of
aflatoxigenic strains of Aspergillus flavus
Midorikawa, GEO1; Bessa, ARS1; Freire, F2; Miller, RNG1
1
Universidade Católica de Brasília, SGAN 916, Módulo B, Brasília, DF, CEP 70790-160, Brasil;
Embrapa Agroindústria/CNPAT, Rua Dra Sara Mesquita, 2270, Planalto do Pici - Cx. Postal 3761, CEP 60511110, Fortaleza, CE
[email protected]
2
Mycotoxins are secondary metabolites produced by a number of food-borne fungi which cause the toxic response
mycotoxicosis in higher animals and humans through ingestion of contaminated foodstuffs. Aflatoxins pose the greatest
risk as carcinogenic contaminants of feed and processed foods. Brazil nut has considerable economic importance in Brazil,
with the majority of the annual production exported. Contamination of these products represents a loss of over 10%
of annual production as a result of microbial biodeterioration. The objectives of this project are to develop PCR-based
detection methods for aflatoxigenic fungi, which, applied in certification programmes, will contribute to improving
quality in agricultural products such as peanut, Brazil nut, maize and cashew nut. Sequencing of the mitochondrial
DNA small subunit rRNA gene region in over 40 isolates of Aspergillus flavus collected from contaminated Brazil nut
and cashew nut material, and alignment with equivalent Genbank sequences for additional Aspergillus species and
other associated fungal genera in Brazil, revealed conserved sequences for the design of specific primers for the genus
Aspergillus and the species A. flavus. Primer sets displayed specificities at the genus level, with a detection sensitivity
limit at 10pg of fungal DNA. Ultimately, specific primer sets will be applied in the form of a multiplex PCR system,
for molecular detection of aflatoxigenic isolates of A. flavus in contaminated material.
Supported by: PRODETAB, CNPq, FAPDF and UCB.
36
54º Congresso Brasileiro de Genética
I]kmegkÛ\gۂÃÛ:gf_j]kkgÛ9jYkad]ajgÛ\]Û>]f#la[YÛÝÛ~ƒÛYÛ~†Û\]Ûk]l]eZjgÛ\]Û‡‡…
9Y`aYÛFl`gfÛGYdY[]Û?gl]dÛÝÛJYdnY\gjÛÝÛ98ÛÝÛ9jYkad
oookZ_gj_ZjÛ¤Û@J9Eۆ„…¤…‚¤…†~‡†¤‡ƒ¤
Um sistema de detecção molecular para o
gênero Aspergillus derivado da subunidade
pequena do DNA ribossomal de DNA
mitochondrial que utiliza um controle
interno de amplificação
Midorikawa, GEO1; Freire, F2; Miller, RNG1
1
Universidade Católica de Brasília, SGAN 916, Módulo B, Brasília, DF, CEP 70790-160, Brasil
Embrapa Agroindústria/CNPAT, Rua Dra Sara Mesquita, 2270, Planalto do Pici - Cx. Postal 3761, CEP 60511110, Fortaleza, CE
[email protected]
2
Palavras-chave: Aspergillus, mtDNA SSU rDNA, IAC
Alimentos em geral são extremamente suscetíveis a contaminação por fungos produtores de micotoxinas, os quais
pertencem a diferentes classes químicas. Um grupo bastante importante são as aflatoxinas, as quais têm sido apontadas
como o grupo mais importante de micotoxinas devido a sua alta toxicidade, suas propriedades hepatocarcinogênicas e
sua ocorrência comum em diferentes alimentos. No Brasil, a contaminação desses alimentos representa uma perda anual
de mais de 10% de toda a produção de castanhas, levando o Brasil a grandes perdas econômicas. Os objetivos desse
projeto são desenvolver métodos de detecção molecular para fungos aflatoxigênicos, contribuindo assim, em programas
de monitoramento de qualidade de produtos agrícolas, como amendoim, castanha do Brasil, e castanha de caju. A técnica
de PCR, apesar de ser bem descrita nos últimos 15 anos para a identificação de fungos, não está livre de potenciais
problemas, sendo estes em geral, contaminações das amostras, amostragem não representativa, e o principal, inibição
da PCR, levando ao resultado falso negativo. Para tanto, está sendo desenvolvido um controle interno de amplificação
(IAC) para a região do mtDNA SSU rDNA específico para o gênero Aspergillus, visando a utilização de um conjunto
de primers e IACs num método de PCR multiplex para a identificação de Aspergillus flavus em alimentos.
Apoio: PRODETAB, CNPq, FAPDF e UCB.
5
123
Anexo B – Artigo publicado
Letters in Applied Microbiology ISSN 0266-8254
ORIGINAL ARTICLE
Characterization of Aspergillus flavus strains from Brazilian
Brazil nuts and cashew by RAPD and ribosomal DNA
analysis
G.E.O. Midorikawa1, M.R.R. Pinheiro1, B.S. Vidigal1, M.C. Arruda1, F.F. Costa1, G.J. Pappas Jr1,
S.G. Ribeiro4, F. Freire2 and R.N.G. Miller1,3
1
2
3
4
Postgraduate program in Genomic Science and Biotechnology, Universidade Católica de Brası́lia, Brası́lia, DF, Brazil
Embrapa Agroindústria Tropical ⁄ CNPAT, Fortaleza, CE, Brazil,
Diagene Diagnósticos Moleculares Ltda, Universidade Católica de Brası́lia, Brası́lia, DF, Brazil
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brası́lia, DF, Brazil
Keywords:
Aspergillus flavus, detection, internal
amplification control, mycotoxins, PCR, RAPD,
rDNA ITS.
Correspondence
Robert Neil Gerard Miller, Universidade
Católica de Brası́lia, CAMPUS II, SGAN Qd.
916, Módulo B, Avenida W5 Norte,
70Æ790-160, Brası́lia, DF, Brazil.
E-mail: [email protected]
2007 ⁄ 0244: received 16 February 2008,
revised 12 March 2008 and accepted
13 March 2008
doi:10.1111/j.1472-765X.2008.02377.x
Abstract
Aims: The aim of this study was to determine the genetic variability in Aspergillus flavus populations from Brazil nut and cashew and develop a polymerase
chain reaction (PCR) detection method.
Methods and Results: Chomatography analysis of 48 isolates identified 36 as
aflatoxigenic (75%). One hundred and forty-one DNA bands were generated
with 11 random amplified polymorphic DNA (RAPD) primers and analysed
via unweighted pair group analysis, using arithmetic means (UPGMA). Isolates
grouped according to host, with differentiation of those from A. occidentale
also according to geographical origin. Aspergillus flavus-specific PCR primers
ASPITSF2 and ASPITSR3 were designed from ribosomal DNA internal transcribed spacers (ITS 1 and 2), and an internal amplification control was developed, to prevent false negative results. Specificity to only A. flavus was
confirmed against DNA from additional aspergilli and other fungi.
Conclusions: RAPD-based characterization differentiated isolates according to
plant host. The PCR primer pair developed showed specificity to A. flavus, with
a detection limit of 10 fg.
Significance and Impact of the Study: Genetic variability observed in A. flavus
isolates from two Brazilian agroecosystems suggested reproductive isolation.
The PCR detection method developed for A. flavus represents progress towards
multiplex PCR detection of aflatoxigenic and nonaflatoxigenic strains in Hazard Analysis Critical Control Point systems.
Introduction
Aflatoxins are carcinogenic natural substances. The fungi
Aspergillus flavus Link, A. parasiticus Speare, A. tammarii
Kita and A. nomius Kurtzman, Horn & Hesseltime all
produce these secondary metabolites, most commonly
with A. flavus producing aflatoxins B1 (AFB1) and B2,
(AFB2) and A. parasiticus producing aflatoxins B1, B2, G1
(AFG1) and G2 (AFG2). Whilst most strains of A. parasiticus produce aflatoxins, only 40–50% of A. flavus strains
are estimated to be aflatoxigenic (Geisen 1998).
12
Cashew (Anarcardium occidentale L.) and Brazil nut
(Bertholletia excelsa Humb. & Bompl.) are important
crops in Brazil. Mycotoxigenic fungi have been reported
in cashew (Pitt and Hocking 1991; Pitt et al. 1993), with
AFG2 detected in kernels (Freire et al. 1999). Aspergillus
flavus is dominant on Brazil nuts, (Freire et al. 2000;
Arrus et al. 2005), with AFB1, AFB2 and AFG2 reported
in excess of 2Æ25 ppm (Castrillon and Purchio 1988).
Hazard Analysis Critical Control Point (HACCP) systems control risks of contamination of food products
with pathogenic micro-organisms and chemical toxins
ª 2008 The Authors
Journal compilation ª 2008 The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology 47 (2008) 12–18
A. flavus variability and detection
G.E.O. Midorikawa et al.
(Codex Alimentarius, 2003). Tools developed for detecting aflatoxigenic aspergilli (i.e. biological hazards) would
enable identification of critical control points (CCPs) in
the field, storage or transport. The need for detection
methods for mycotoxigenic fungi in Brazil is also driven
by cost and limited access to methods for mycotoxin
detection (Salay 2003).
Identification of aflatoxigenic fungi can be conducted
using specialized media for aflatoxin induction (e.g. Lin
and Dianese 1976). Limitations exist, however, with insufficient sensitivity and misidentification of compounds
during visual determination under UV radiation. Agar
plug methods, by contrast, visualize mycotoxins in colony
material via thin layer chromatography (TLC) (e.g. Singh
et al. 1991). PCR detection methods are also under development for aflatoxigenic fungi, with primers targeting
regions such as aflatoxin biosynthetic pathway genes and
ribosomal DNA (rDNA). Multiplex PCR has been
described (e.g. Chen et al. 2002), although problems have
been reported, with amplification of homologues in nonproducing fungi, and primer nonspecificity (Shapiro et al.
1996). RAPD PCR also offers potential for detection of
aflatoxigenic fungi. RAPD SCAR (sequence characterized
amplified region) markers can be designed from monomorphic amplicons, for detection across populations. This
approach has been applied for ochratoxin A-producing
aspergilli and penicillia (Niessen et al. 2005). RAPDs also
have potential in fingerprinting for both detection of aflatoxigenic fungi at CCPs and traceback investigations of
contamination incidents.
The objectives of this study were to characterize
A. flavus from A. occidentale and B. excelsa via RAPD
and analysis of rDNA internal transcribed spacers (ITS)
regions, and identify candidate sequences for PCR-based
detection. This paper describes both an analysis of
genetic variability in A. flavus on these hosts, and the
first PCR-based detection method for A. flavus to
include an internal amplification control (IAC). Specific
primers are suitable for inclusion in PCR multiplex
methods, applicable for HACCP systems.
Materials and methods
Origin, identification and preservation of isolates
Forty-eight isolates of A. flavus from A. occidentale and
B. excelsa were isolated into culture according to Freire
et al. (2000) (Table 1). Identifications to species level
were made according to Singh et al. (1991), and isolates preserved on Czapek Yeast Autolysate (CYA)
slopes (Pitt and Hocking 1997) and on sterile filter
paper at 4C.
Aflatoxin detection
Aflatoxin production was analysed in strains after 7 days
growth at 30C on Yeast Extract Sucrose (YES) (Pitt and
Hocking 1997) and CYA. Mycelial plugs were wetted with
chloroform ⁄ methanol (2:1) and placed in contact with a
TLC plate (Silica gel 60; Merck, Darmstadt, Germany) for
5 s. Aflatoxin standards AFB1, AFB2, AFG1 and AFG2
(Sigma, St Louis, MO, USA) were included for quantification. Spots were dried and plates developed in an acetone:chloroform (10:90 v ⁄ v) mobile phase. Spots were
visualized under UV light (366 nm) and toxins scored on
a presence ⁄ absence basis, after growth on either of the
media.
DNA extraction
Cultures were grown in 150 ml of CYA liquid media for
72 h at 25C, with agitation at 120 rev min)1. Mycelia
were washed with sterile distilled water, harvested by vacuum filtration and freeze dried. Extraction of DNA was
conducted according to Raeder and Broda (1985).
Ribosomal DNA amplification
Amplification of the ITS1, ITS2 and 5Æ8s rDNA gene of
the nuclear ribosomal RNA gene cluster was conducted
using primers ITS5 and ITS4 (White et al. 1990).
PCR amplifications contained 0Æ4 lmol l)1 of primer,
200 lmol l)1 dNTPs, 1Æ5 mmol l)1 MgCl2, 1Æ0 U Taq
DNA polymerase (5 U ll)1) (Invitrogen, São Paulo,
Brazil), and 20 ng of DNA. Temperature cycling was
performed on a PCT-100 thermocycler (MJ Research,
Waltham, MA, USA) as follows: Initial denaturation at
95C for 4 min, 40 cycles of denaturation at 92C for
1 min, primer annealing at 55C for 1 min, and extension at 72C for 2 min, and a final extension at 72C
for 5 min.
DNA sequencing and primer design
Twenty nanogram of PCR product were sequenced on
an ABI 377 sequencer (Applied Biosystems, Foster City,
CA, USA). rDNA ITS sequences were also included for
43 Aspergillus species in Genbank, together with 19 species across 14 fungal genera commonly associated with
B. excelsa and A. occidentale in Brazil (Freire et al. 1999,
2000). Sequence alignment was conducted using
ClustalW (Thompson et al. 1994) and primers
designed with Primer3 (Rozen and Skaletsky 2000).
Sequences were deposited in GenBank under accession
numbers EF409767–EF409814.
ª 2008 The Authors
Journal compilation ª 2008 The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology 47 (2008) 12–18
13
A. flavus variability and detection
Isolate
number
Brazilian
locality
UCB001
UCB002
UCB003
UCB004
UCB005
UCB006
UCB007
UCB008
UCB009
UCB010
UCB011
UCB012
UCB013
UCB014
UCB015
UCB016
UCB017
UCB018
UCB019
UCB020
UCB021
UCB022
UCB023
UCB024
UCB025
UCB026
UCB027
UCB028
UCB029
UCB030
UCB031
UCB032
UCB033
UCB034
UCB035
UCB036
UCB037
UCB038
UCB039
UCB040
UCB041
UCB042
UCB043
UCB044
UCB045
UCB046
UCB047
UCB048
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
Beribe County, Ceará
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
São Raimundo Nonato,
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
Amazonia
G.E.O. Midorikawa et al.
Piauı́
Piauı́
Piauı́
Piauı́
Piauı́
Piauı́
Piauı́
Piauı́
Piauı́
Piaui
Piaui
Host
Aflatoxin
(on YES media)
Aflatoxin
(on CYA media)
B
B
B
B
B
B
B
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
ND
ND
ND
AFB1
ND
ND
ND
ND
AFB1
ND
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
ND
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
ND
AFB1
AFB1
ND
AFB1
ND
ND
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
ND
ND
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
ND
ND
AFB1
ND
AFB1
ND
ND
AFB1
ND
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
ND
ND
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
ND
ND
ND
AFB1
ND
AFB1
ND
ND
AFB1
AFB1
AFB1
AFB1
ND
AFB1
AFB1
ND
AFB1
ND
AFB1
ND
ND
ND
AFB1
AFB1
AFB1
Table 1 Supporting information for
examined isolates of Aspergillus flavus
ND, not detectable; B, Bertholletia excelsa; A, Anarcardium occidentale.
Determination of primer specificity and detection limit
Amplification conditions for the specific primer pair
developed (ASPITSF2 and ASPITSR3) were as described
above, using an annealing temperature of 60C. Primers
14
were tested for specificity against DNA from Aspergillus
awamore, Aspergillus fumigatus and Aspergillus niger, as
well as isolates of Cladosporium cladosporioides,
Fusarium solani f. sp. glycines, Fusarium solani, Penicillium citrinum and Trichoderma harzianum. Isolates of
ª 2008 The Authors
Journal compilation ª 2008 The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology 47 (2008) 12–18
A. flavus variability and detection
G.E.O. Midorikawa et al.
F. solani were obtained from the Plant Pathology
Department, Universidade de Brasilia (CMUnB). Detection limit was assessed on diluted A. flavus DNA. All
experiments were conducted in duplicate, with an IAC
(see below) in each sample and a separate negative
control lacking template DNA included with PCR
amplifications.
Internal amplification control development
The specific PCR product amplified for A. flavus with
primers ASPITSF2 and ASPITSR3 was cloned into the
vector pGEMTeasy (Promega, Madison, WI, USA), and
plasmid DNA isolated according to standard protocols.
An IAC was constructed by splicing an internal
fragment from the cloned amplicon. Digestion was performed with Sma I (Invitrogen), at base pair position
36, to linearize the plasmid construct. A second digestion was performed at position 147 with Cla I (Invitrogen), excising a 111-bp fragment. Following agarose gel
electrophoresis, the large plasmid DNA fragment (3301
bp) was extracted using a Geneclean II kit (Qbiogene,
Irvine, CA, USA), and Cla I 5¢ overhangs filled using
DNA polymerase I, large (Klenow) fragment (Invitrogen). Blunt-ended fragments were ligated using T4
DNA Ligase (Promega) to produce a ligate 111 bp
smaller than the original specific amplicon. Following
cloning, the recombinant strain was stored as a glycerine culture at )80C. Plasmid DNA was isolated, and
at optimal concentration, used as an IAC template in
specific PCR reactions.
RAPD-based characterization
Following screening of 10-mer primers (Operon Technologies, Alameda, CA, USA), 11 primers were selected,
based upon number of observable bands and reproducibility: OPA04 (5¢-AATCGGGCTG-3¢), OPB10 (5¢CTGCTGGGAC-3¢), OPD10 (5¢-GGTCTACACC-3¢),
OPD20 (5¢-ACCCGGTCAC-3¢), OPF10 (5¢-GGCTGCAGAA-3¢), OPF13 (5¢-GGAAGCTTGG-3¢), OPK20 (5¢-GTGTCGCGAG-3¢), OPO20 (5¢-ACACACGCTG-3¢), OPQ20
(5¢-TCGCCCAGTC-3¢), OPT20 (5¢-GACCAATGCC-3¢)
and OPV10 (5¢-GGACCTGGTG-3¢). Amplification conditions were as described for rDNA analysis, using additional MgCl2 (2Æ5 mmol l)1), 1 mg ml)1 BSA, and a
primer annealing temperature of 36C. Experiments were
repeated twice, with only reproducible bands scored for
analyses. Combined data were analysed. Phenetic relationships were generated from combined binary data using
mvsp v3.1 (Kovach 1999). Similarities were determined
with Jaccard’s coefficient, and visualized following UPGMA clustering.
Results
Aflatoxin detection
Chromatography data revealed 36 aflatoxigenic strains
producing detectable levels of aflatoxin AFB1 (75%), from
both B. excelsa and A. occidentale (Table 1), with YES
media inducing detectable levels in a greater number of
strains.
RAPD-based characterization
Phenetic analysis of combined RAPD data (141 amplified
bands) showed each isolate to be genetically distinct
(Fig. 1). Five main clusters grouped broadly according to
host of origin (B. excelsa-derived isolates in clusters 1, 2
and 5; A. occidentale-derived isolates in clusters 3 and 4).
Three exceptions were observed, with one isolate from
B. excelsa (UCB046) grouping with others from A. occidentale, and two from A. occidentale remaining ungrouped (UCB026 and UCB028). Clusters 3 and 4 also
separated isolates from A. occidentale according to geographical origin. RAPD SCAR markers could not be identified, as no correlation was observed between RAPD
cluster and aflatoxin detection.
Ribosomal DNA sequencing and specific primer
development
Inter-species variability was observed in ITS1 and ITS2
regions, with greater variability noted in the ITS1 region.
Two sequences were identified for primer design, with
ASPITSF2
(5¢-GCCCGCCATTCATGG-3¢)
targeting
within the ITS1 region and specific for A. flavus, and ASPITSR3 (5¢-CCTACAGAGCGGGTGACAAA-3¢) targeting
within the ITS2 and specific at the genus level. The
expected PCR product size was 397 bp.
Primer specificity and limit of detection
Primers ASPITSF2 and ASPITSR3 amplified a PCR product of the predicted size from target DNA from only
A. flavus, when testing against DNA from other members
of the genus and fungi associated with B. excelsa and
A. occidentale (Fig. 2a,b). When using only fungal DNA
template, an amplification detection limit of c. 10 fg was
observed (Fig. 2c). In development of IACs, simultaneous
amplification of distinct PCR products flanked by the
same primer pair can cause inhibition or enhanced amplification of either product, according to their molar ratio.
In this study, an IAC concentration of 10 pg was
identified as optimum for simultaneous amplification of a
286-bp IAC and the 397 bp specific A. flavus amplicon.
ª 2008 The Authors
Journal compilation ª 2008 The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology 47 (2008) 12–18
15
A. flavus variability and detection
G.E.O. Midorikawa et al.
Cluster
UPGMA
0.28
0.4
0.52
0.64
32 B. excelsa (Amazonia) AFB1
34 B. excelsa (Amazonia) AFB1
29 B. excelsa (Amazonia) AFB1
26 A. occidentale (Piauí) AFB1
28 A. occidentale (Piauí) AFB1
38 B. excelsa (Amazonia) AFB1
42 B. excelsa (Amazonia) AFB1
39 B. excelsa (Amazonia) ND
37 B. excelsa (Amazonia) AFB1
36 B. excelsa (Amazonia) ND
45 B. excelsa (Amazonia) ND
41 B. excelsa (Amazonia) AFB1
48 B. excelsa (Amazonia) AFB1
44 B. excelsa (Amazonia) ND
43 B. excelsa (Amazonia) AFB1
47 B. excelsa (Amazonia) AFB1
40 B. excelsa (Amazonia) AFB1
35 B. excelsa (Amazonia) AFB1
33 B. excelsa (Amazonia) AFB1
31 B. excelsa (Amazonia) AFB1
30 B. excelsa (Amazonia) AFB1
46 B. excelsa (Amazonia) AFB1
24 A. occidentale (Piauí) AFB1
23 A. occidentale (Piauí) AFB1
20 A. occidentale (Piauí) AFB1
19 A. occidentale (Piauí) AFB1
18 A. occidentale (Piauí) ND
21 A. occidentale (Piauí) AFB1
22 A. occidentale (Piauí) AFB1
17 A. occidentale (Ceará) AFB1
16 A. occidentale (Ceará) AFB1
27 A. occidentale (Piauí) AFB1
25 A. occidentale (Piauí) AFB1
15 A. occidentale (Ceará) AFB1
14 A. occidentale (Ceará) AFB1
13 A. occidentale (Ceará) AFB1
12 A. occidentale (Ceará) AFB1
11 A. occidentale (Ceará) AFB1
10 A. occidentale (Ceará) ND
9 A. occidentale (Ceará) AFB1
8 B. excelsa (Amazonia) ND
7 B. excelsa (Amazonia) ND
6 B. excelsa (Amazonia) AFB1
5 B. excelsa (Amazonia) ND
4 B. excelsa (Amazonia) AFB1
3 B. excelsa (Amazonia) ND
2 B. excelsa (Amazonia) ND
1 B. excelsa (Amazonia) AFB1
0.76
0.88
1
2
3
4
5
1
Jaccard's coefficient
Figure 1 UPGMA phenogram showing genetic relationships between Aspergillus flavus isolates from Anarcardium occidentale and Bertholletia
excelsa, based on combined RAPD fingerprints. Aspergillus flavus isolates are divided into host of origin clusters.
Successful co-amplification of PCR products was observed
when tested across all 48 A. flavus isolates, with specificity
to only A. flavus depicted in Fig. 2b. A detection limit of
1 pg of A. flavus DNA was reached, when incorporating
10 fg of IAC plasmid DNA (data not shown).
Discussion
Despite the importance of A. flavus, its population biology remains poorly understood. Analysis of RAPD data
revealed intraspecific groupings correlating with plant
host. This may indicate either a different origin of isolates
on each host, or reproductive isolation, with selective
pressure conserving genes involved in host specificity.
Localized intraspecific variability in soil-borne A. flavus
has also been reported by Griffin et al. (2001). Our RAPD
data also distinguished based upon geographical origin in
the case of isolates from A. occidentale. RAPD fingerprinting of isolates of the human pathogen A. fumigatus has
been applied in traceback investigations (e.g. Khan et al.
1998). Given such applications, RAPDs offers potential in
HACCP for monitoring A. flavus. Although we did not
16
observe correlation between RAPDs and aflatoxin detection, as also reported in Brazilian isolates from corn and
soil (Lourenço et al. 2007), potential exists in development of RAPD SCAR approaches for aflatoxigenic strain
detection.
Interestingly, TLC analyses showed most isolates of
A. flavus from A. occidentale producing detectable levels
of AFB1. Previously, only aflatoxin G2 had been reported
in A. occidentale in Brazil (Freire et al. 1999).
Kumeda and Asao (1996) utilized rDNA ITS variability
for classification of Aspergillus section flavi into four
groups, namely A. flavus ⁄ A. oryzae, A. parasiticus ⁄ A. sojae,
A. tamarii and A. nomius. A two-step nested PCR detection
system using ITS-derived primers has been used for clinical
isolates of A. fumigatus, A. niger and A. flavus (Sugita et al.
2004). To date, PCR methods for mycotoxigenic fungi have
not included IAC systems (Paterson 2007). Analysis of
rDNA ITS regions in our isolates enabled the design of a
species- and genus-specific primer from ITS1 and ITS2
regions, respectively. Together with the developed IAC, this
primer pair for A. flavus has potential for inclusion in multiplex PCR or RT-PCR methods (e.g. Scherm et al. 2005),
ª 2008 The Authors
Journal compilation ª 2008 The Society for Applied Microbiology, Letters in Applied Microbiology 47 (2008) 12–18
A. flavus variability and detection
G.E.O. Midorikawa et al.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
(a)
397 bp
Acknowledgement
Financial support was provided by the CNPq (Rhae50Æ4601 ⁄ 2004-0), Prodetab (003-01 ⁄ 01) and FAP-DF
(PAPPE-193Æ000Æ295 ⁄ 2004).
References
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
(b)
397 bp
286 bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
(c)
397 bp
Figure 2 PCR amplification with primers ASPITSF2 and ASPITSR3 (a),
specific PCR amplification plus an internal amplification control (b)
and limit of detection with primers ASPITSF2 and ASPITSR3 (c). (a) 1:
Low DNA Mass ladder (Invitrogen); 2: negative control; 3–5: Aspergillus flavus isolates UCB024, UCB045 and UCB060; 6 and 7: Trichoderma harzianum isolates 1 and 2; 8 and 9: Aspergillus fumigatus
isolates 1 and 2; 10 and 11: Aspergillus awamore isolates 1 and 2; 12
and 13: Fusarium solani f. sp. glycines isolates CMUnB 1824 and
1848; 14: F. solani isolate CMUnB 1974. (b) 1: 1 Kb Plus DNA ladder
(Invitrogen); 2–4: A. flavus isolates UCB036, UCB040 and UCB044; 5:
A. awamore isolate 1; 6: A. fumigatus isolate 1; 7: Aspergillus niger
isolate 1; 8 and 9: F. solani f. sp. glycines isolates CMUnB 1824 and
1848; 10: F. solani isolate CMUnB 1974; 11: P. citrinum isolate 1; 12:
T. harzianum isolate 1; 13: C. cladosporioides isolate 1; 14: negative
control. (c) 1: 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen); 2–9: PCR products
amplified with 20 ng, 5 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg and
10 fg A. flavus DNA; 10: negative control.
to complement markers for aflatoxin biosynthetic pathway genes, such as aflP or aflQ (Paterson 2006). Nuclear
rDNA regions are also attractive markers because of high
copy number, facilitating PCR amplification. Indeed, the
detection limit of our specific ITS product (10 fg) was
more sensitive than obtained with primers targeting
single copy genes, which typically detect down to only
nanograms of template DNA. Uptake of a robust PCRbased system in HACCP is important in Brazil, given
limited chromatographic analyses on products for internal markets.
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