Alexandre Alves da Silva
Efeitos da Sobrecarga ou Restrição Crônica de Sal
na Dieta Durante a Gestação e Amamentação em
Ratas Wistar e Sua Repercussão Sobre a Prole
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
SÃO PAULO
2001
Alexandre Alves da Silva
Efeitos da Sobrecarga ou Restrição Crônica de Sal
na Dieta Durante a Gestação e Amamentação em
Ratas Wistar e Sua Repercussão Sobre a Prole
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de
Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Fisiopatologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Joel Claudio Heimann
SÃO PAULO
2001
Aos meus pais:
Vitor Alves da Silva
e
Maria Aparecida da Silva,
Pelo carinho, amor e liberdade que sempre me ofereceram.
À minha querida esposa Renata,
Pelo seu amor e compreensão.
Ao meu irmão Júnior,
Pelo grande incentivo.
Aos meus avós maternos (in memoriam)
e bisavós paternos (in memoriam),
Pelo ensino de cidadania aos meus queridos pais.
PAGE
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Joel Claudio Heimann, pela paciência e orientação
científica.
A todos os colegas do Laboratório de Hipertensão Experimental da Faculdade de
Medicina da Universidade de São Paulo, pelas brincadeiras e auxílio mútuo.
À Profa. Dra. Zuleica Bruno Fortes, pela minha primeira orientação científica e
iniciação no estudo da Hipertensão Arterial.
A todas as Professoras dos Cursos Primário e Secundário que sempre
acreditaram em meu amor pela Ciência, em especial às Professoras:
Hansclevina Maria da Silva Campos,
Zumar Calixto Pedroso de Souza,
Maria Tereza de Souza e
Emília Francisco Ângelo Janini.
Aos meus tios maternos: Luiz Justino e Arcelina Francisco Justino e seus filhos
Fernanda, André e Rodrigo, pela calorosa acolhida nos momentos de necessidade.
À FAPESP pela concessão de bolsa e financiamento deste projeto de pesquisa.
ÍNDICE
Resumo
1
Abstract
3
Introdução
5
Objetivo
11
Método
Animais
12
Protocolo experimental
13
Peso
16
Pressão arterial caudal
16
Pressão arterial direta
17
Fluxo sangüíneo renal
18
Teste de sensibilidade ao sal
18
Dosagem de colesterol e triglicérides
19
Dosagem da atividade de renina plasmática
19
Massa renal
19
Massa ventricular esquerda
20
Densidade e diâmetro glomerular
20
Imunohistoquímica para angiotensina II
21
Análise estatística
22
Resultados
Maternos até o acasalamento
23
Maternos durante a gestação
24
Da prole
26
Discussão
39
Conclusões
47
Referências bibliografia
48
Apêndice
55
Artigo completo “Paper” submetido para publicação
100
RESUMO
Alguns estudos têm procurado avaliar os efeitos de variações no consumo de
sal no período perinatal sobre o sistema cardiovascular da prole na idade adulta. No
entanto, várias questões ainda estão em aberto e merecem estudos adicionais.
Neste trabalho, o OBJETIVO foi estudar os efeitos da sobrecarga ou restrição crônica
de sal na dieta de ratas Wistar, durante a gestação e amamentação, sobre o ganho
de peso, a pressão arterial, a sensibilidade da pressão arterial ao sal (SENS), a
atividade do sistema renina-angiotensina, o conteúdo renal de angiotensina II (AII) e
a densidade glomerular da prole na idade adulta.
Foram utilizadas fêmeas Wistar recém desmamadas divididas em 3 grupos:
dieta hipo (HO - 0,15% NaCl - n=8), normo (NR - 1,27% NaCl - n=9) ou hipersódica
(HR – 7,94% NaCl - n=8). A quantidade de dieta oferecida as ratas foi ajustada de
forma a manter o peso semelhante entre os grupos. A fecundação ocorreu na 12a
semana de idade. Após o parto, apenas 8 recém-nascidos (4 machos e 4 fêmeas)
permaneceram com suas mães. Após o desmame, todos os animais da prole
receberam apenas a dieta NR. O peso materno foi medido diariamente até a
fecundação e semanalmente até uma semana após o parto. O peso da prole foi
medido no dia do parto e semanalmente após o desmame. A PA caudal materna foi
medida desde uma semana antes da fecundação até uma semana após o parto
(PAc-M) e na prole entre a 8a e a 12a semana de idade (PAc-P). Ao completar 12
semanas de idade, a prole foi submetida a um teste de sensibilidade da pressão
arterial ao sal (1 semana em dieta HO seguido por 1 semana em dieta HR ou viceversa). A atividade de renina plasmática (ARP) foi medida ao final de cada semana
1
do teste. O conteúdo renal de AII foi avaliado por imunohistoquímica e a densidade
glomerular através de um método histológico apropriado para a contagem dos
glomérulos.
Durante a gestação, a PAc-M foi maior no grupo HR (p<0,05) comparado aos
grupos HO e NR. Na prole: 1) o ganho de peso foi menor (p<0,05) no grupo HR; 2) a
PAc-P foi maior (p<0,05) no grupo HR, 3) a SENS foi menor (p<0,05) nas fêmeas do
grupo HR, 4) uma semana de sobrecarga salina reduziu a ARP (p<0,05 vs. ARP
após uma semana de restrição salina) nos grupos HO e NR, mas não no HR, 5) o
conteúdo de AII renal foi maior no grupo HR (p<0,05) e 6) não foram observadas
diferenças na densidade glomerular entre os grupos.
Sobrecarga crônica de sal na dieta durante a gestação e amamentação,
aumenta a pressão arterial materna e leva a um distúrbio na modulação do sistema
renina-angiotensina sistêmico e renal da prole, o que pode explicar os maiores
níveis pressóricos e a menor sensibilidade ao sal da prole do grupo HR na idade
adulta e também acarreta um menor ganho de peso destes animais.
2
ABSTRACT
Former studies that evaluated the association between a high salt
environment during the perinatal period and the adult offspring health conditions
disclosed some effects on the cardiovascular and endocrine systems. However,
several questions in this issue remain unanswered. The OBJECTIVE of this study was
to verify in Wistar rats the effects of salt overload or restriction during pregnancy and
lactation on blood pressure, salt sensitivity, renin-angiotensin system activity and
glomerular density of the adult offspring. Female Wistar rats received one of the
following diets: LSD (0.15% NaCl - n=8), NSD (1.27% NaCl - n=9) or HSD (7.94%
NaCl - n=8) since weaning. Diet consumption was controlled to avoid weight
differences between groups. Matting occurred at 12 weeks of age. After delivery,
only 8 newborns (4 males and 4 females) stayed with their dams. After weaning, the
offspring received only NSD. Weekly maternal tail-cuff blood pressure (Mat-TcBP)
was measured since one week before pregnancy until one week after delivery. In the
offspring, weekly evaluations of the body weight were done until 12 weeks of age,
and tcBP (Off-TcBP) was measured from 8 to 12 weeks of age. At 12 weeks of age,
a salt sensitivity test was done (1 week on LSD followed by 1 week on HSD, or viceversa). Plasma renin activity (PRA) was measured at the end of each week of the
salt sensitivity test. Kidney angiotensin II (AII) content was evaluated by
imunohystochemistry and glomerular density by an hystological method to count
glomeruli.
During pregnancy, the HSD Mat-TcBP was higher (p<0.05) compared to LSD
and NSD groups. In the offspring: 1) weight gain was lower (p<0.05) in the HSD
3
group compared to the other groups. 2) Off-TcBP was higher (p<0.05) and salt
sensitivity was lower (a tendency in males and p<0.05 in females) in the HSD
compared to the other 2 groups. 3) During the salt sensitivity test, PRA was lower
(p<0.05) at the end of the week on HSD compared to LSD in LSD and NSD but not
in the HSD group where PRA did not change. 4) The weight gain was lower (p<0.05)
in the HSD group compared to LSD and NSD. 5) Kidney AII content was higher in
the HSD group. 6) No difference was observed in the glomerular density between
groups.
Salt overload during pregnancy increases maternal blood pressure, reduces
offspring growth rate after delivery, and leads to a disturbance in the modulation of
the systemic and/or kidney renin-angiotensin system that could explain the higher
blood pressure and the lower salt sensitivity of the offspring of the HSD dams.
4
INTRODUÇÃO
A hipertensão arterial é conseqüência da interação entre mecanismos
genéticos e ambientais. Entre os fatores ambientais, vem sendo dado importância
àqueles que ocorrem no período perinatal, naquilo que diz respeito às repercussões
sobre variáveis estudadas na vida adulta.
Durante a vida intra-uterina, os tecidos corpóreos crescem durante períodos
de rápida divisão celular, chamados de períodos "críticos"1. O crescimento depende
de nutrientes e oxigênio e quando não há um suprimento adequado destes, a
principal adaptação fetal é diminuir sua taxa de divisão celular, especialmente nos
tecidos em períodos "críticos". Esta diminuição na taxa de divisão celular, devido a
má nutrição, pode ser causada tanto por efeito direto ou por alterações na
concentração de fatores de crescimento e de hormônios.
Em animais, mostrou-se que mesmo breves períodos de má nutrição durante
momentos "críticos" podem reduzir permanentemente o número de células em um
determinado órgão1. Este é um dos mecanismos pelo qual a má nutrição durante o
período fetal pode causar alterações permanentes em órgãos e tecidos. Outra
conseqüência da má nutrição seria a modificação na distribuição dos diferentes tipos
de células, nos padrões de secreção hormonal, nas atividades metabólicas e na
estrutura dos órgãos1. Recentes descobertas em humanos sugerem que estes
efeitos se traduzem em doenças cardiovasculares na vida adulta, o que talvez não
seja muito surpreendente já que numerosos trabalhos em animais demonstram que
má nutrição “in utero” pode levar a mudanças na pressão arterial, no metabolismo de
colesterol, na sensibilidade à insulina e em muitos outros parâmetros metabólicos,
5
endócrinos e imunológicos2.
Os primeiros estudos epidemiológicos que apontaram para uma possível
importância da programação intra-uterina da doença coronariana foram baseados
em análises de homens e mulheres acima de 40 anos, cujas medidas corpóreas ao
nascimento tinham sido registradas3. Este estudo mostrou que há uma relação entre
peso ao nascimento e pressão arterial. Quanto menor a razão entre o peso ao
nascimento e o peso da placenta, maior a pressão arterial na vida adulta. Outros
estudos epidemiológicos posteriores também encontraram correlação entre o baixo
peso ao nascimento e níveis elevados de pressão arterial na infância e na idade
adulta e maior número de mortes por complicações cardiovasculares4-10.
Brenner e colaboradores11,12 propuseram que os rins de recém-nascidos, que
apresentaram baixo peso ao nascer, têm um número reduzido de néfrons ao nascer,
resultando em uma filtração glomerular diminuída e mantida durante o crescimento,
dando início a um ciclo repetido de retenção de sódio, elevação da pressão arterial e
em casos extremos, perda acelerada de néfrons com a idade, resultando em
nefrosclerose hipertensiva na vida adulta.
Uma visão similar é proposta por Weder e Schork13, que propõem ser a
hipertensão primária um fenômeno recente na evolução humana, refletindo a
inabilidade do sistema renal em se manter passo a passo com o rápido ganho de
massa corpórea dos humanos modernos. Em resumo, Brenner e associados
sugerem que na hipertensão primária, os rins são pequenos demais, enquanto
Weder e Schork propõem que a massa corpórea é muito grande.
6
Em seres humanos, a massa renal aumenta exponencialmente durante a
segunda metade da gestação e a nefrogênese está virtualmente terminada até o
nascimento14.
Durante
este
período,
a
filtração
glomerular
correlaciona-se
positivamente com a idade gestacional mas também com a massa renal e corpórea.
A proporção entre a massa renal e a massa corpórea continua mantida após o
nascimento. As hipóteses acima propõem que em indivíduos susceptíveis à
hipertensão, tais como crianças com baixo peso ao nascer, o crescimento renal não
acompanharia o crescimento do corpo durante o período pós natal. Resultando
numa desproporção entre a massa renal e a massa corpórea.
Um tamanho reduzido da placenta e um aumento da concentração de
glicocorticóides são conseqüências de desnutrição em animais durante a gravidez e
que podem interferir na determinação dos níveis de pressão arterial na prole na
idade adulta15,
16
. O aumento de glicocorticóides deve-se a uma redução na
atividade da 11β-hidroxiesteróide desidrogenase na placenta. Esta enzima converte
glicocorticóides em seus metabólitos inativos16. Na placenta, esta enzima protege o
feto dos altos níveis de glicocorticóides da circulação materna. O mau
funcionamento desta enzima na placenta submete o feto a um ambiente com
elevada concentração deste hormônio, sendo várias as repercussões sobre o feto.
Uma delas é o retardo no crescimento fetal16, cujas possíveis conseqüências já
foram objeto de comentários.
Outras características nutricionais do período perinatal podem eventualmente
interferir nos níveis de pressão arterial da prole. O excesso de sal na dieta é um dos
fatores ambientais que acredita-se ser hipertensinogênico. Em muitas sociedades
primitivas o consumo de sal é muito baixo e a prevalência de hipertensão arterial
7
nestas populações é próxima de zero. Além disso, a pressão arterial não aumenta
com a idade, permanecendo a mesma durante toda a vida. Em sociedades
industrializadas que possuem um consumo de sal entre 4 e 20 g/dia, a pressão
arterial aumenta com a idade, assim como a prevalência de hipertensão e de
complicações cardiovasculares17-19. No entanto, o papel do excesso de sal na dieta
materna como possível evento iniciador de hipertensão, na presença ou ausência de
predisposição hereditária, continua pouco conhecido. Pouco se sabe também sobre
os efeitos do sal durante os primeiros estágios de desenvolvimento da vida,
particularmente em relação à determinação de níveis de pressão arterial. Diversos
estudos avaliaram a relação entre a quantidade de sal ingerida pela mãe durante a
gestação e os seus efeitos, seja na determinação dos níveis de pressão arterial da
prole20-25, na preferência da prole à ingestão salina23,26-28 ou na determinação do
sexo da prole29.
Grollman e Grollman30 demostraram que a exposição a um excesso de sódio
na dieta durante a gestação em ratas normotensas influenciava a pressão arterial da
ninhada, sendo o mesmo observado por Schachter et al31 em crianças nascidas de
mães que se alimentaram de dieta rica em sal e que apresentaram níveis de
pressão arterial e do volume do fluido extracelular elevados quando estudadas aos 6
meses de idade. No estudo de Hazon et al.25, ratas Brattleboro grávidas eram
submetidas a dietas normossódica (0,43% NaCl - controle) ou hipersódica (8,53% NaCl). Os autores observaram que as ratas submetidas a sobrecarga salina
apresentaram maior pressão arterial que o grupo controle, apesar da pressão
arterial ter diminuído ao longo da gestação. No grupo controle, a pressão arterial
não variou ao longo da gestação. A prole foi submetida a diferentes períodos de
8
sobrecarga salina: durante a gestação, durante a amamentação, após o desmame
ou na vida adulta. Observou-se então que a suplementação salina após o desmame
resultou em elevação dos níveis de pressão arterial, sendo os machos mais
susceptíveis que as fêmeas. O grau de elevação da pressão arterial era maior se a
suplementação estava presente durante a amamentação e era máxima quando esta
ocorria tanto durante a gestação quanto após o desmame. Porém, se os ratos eram
submetidos à sobrecarga salina durante a gestação e amamentação e após o
desmame e durante toda a vida adulta recebiam uma dieta normossódica, tais ratos
não elevavam sua pressão arterial. Karr-Dullien e Bloomquist32 verificaram que a
sobrecarga de sal na dieta durante a gestação e amamentação, e não apenas
durante a amamentação, aumentou a hipertensão sal - induzida na ninhada de ratos
SHR quando adultos. Como conclusão, sugerem os autores que sobrecarga de
sódio
durante
a
gestação
e
durante
a
amamentação
podem
afetar
o
desenvolvimento dos mecanismos de regulação da pressão arterial da prole.
Numa abordagem abrangente e complexa, Azar et al.20 estudaram os efeitos
da sobrecarga salina em ratas SHR e Wistar-Kyoto e nas respectivas proles. Os
resultados permitiram aos autores concluir que durante a amamentação tanto
fatores ambientais quanto os hereditários são importantes na determinação dos
níveis de pressão arterial. Por exemplo, a prole SHR quando amamentada por ratas
SHR, que recebiam dieta rica em sódio, teve sua pressão arterial reduzida em 15%,
enquanto que quando amamentada por ratas WKY, também sob dieta rica em
sódio, teve um aumento da pressão arterial da mesma magnitude. Sugerindo que
dieta rica em sódio estimularia a produção de fator vasodepressor e/ou supressão
9
de um fator vasopressor liberado no leite de ratas SHR, enquanto que em ratas
WKY o efeito seria inverso.
O consumo de sal no período pós natal precoce também pode influenciar os
níveis pressóricos na vida adulta. Hofman et al33 mostraram que a pressão arterial
de recém-nascidos que receberam dieta hipossódica nos primeiros 6 meses de vida,
foi menor ao final do 6o mês que a pressão dos recém-nascidos que receberam
dieta nomossódica pelo mesmo período. Sendo importante ressaltar que 15 anos
depois essas crianças foram avaliadas novamente e divididas em 2 subgrupos de
acordo com a freqüência cardíaca. Entre aquelas que possuíam freqüência cardíaca
mais alta, as que receberam dieta hipossódica nos primeiros 6 meses de vida,
apresentaram menores níveis de pressão sistólica e diastólica comparados aos das
que receberam dieta normossódica34.
Alguns trabalhos, no entanto, não conseguiram encontrar correlação entre o
consumo de sal durante a gestação e pressão arterial elevada nos filhos. Myers et
al23 expuseram ratas Munich-Wistar e Sprague-Dawley a dietas normo e
hipersódicas durante a gestação, alimentando as mães e a ninhada após o
nascimento com dieta normossódica. A ninhada foi exposta a uma sobrecarga salina
aguda aos 2, 6 ou 12 meses de idade. A resposta natriurética e da pressão arterial à
sobrecarga salina aguda não diferiu entre os animais submetidos a dieta normo e
hipersódica no período perinatal.
Vários estudos na literatura se dedicam a correlacionar a dieta e pressão
arterial materna durante a gestação com o peso ao nascimento, pressão arterial e
preferência ao sal da prole quando adulta. Porém, os resultados são controversos,
havendo necessidade de novas pesquisas para estudar a participação de eventos
10
pré-natais e ou pós-natais precoces (da primeira infância) no desenvolvimento,
maturação e determinação de doenças, como a hipertensão no indivíduo adulto.
OBJETIVOS
Estudar os efeitos de diferentes intensidades de consumo de sódio durante a
gestação e lactação sobre o peso, pressão arterial e hematócrito de ratas Wistar
prenhes e a repercussão sobre a pressão arterial, o desenvolvimento ponderal, a
sensibilidade ao sal, a modulação do sistema renina-angiotensina e a densidade
glomerular da prole na idade adulta.
11
MÉTODOS
Todos os experimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê
de Ética do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo.
ANIMAIS
Ratas Wistar com 3 semanas de idade (recém desmamadas), provenientes
do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, foram
divididas em três grupos de acordo com a dieta (Harlan Teklad, Madison-WI/USA) a
que foram submetidas:
Dieta hipossódica: 0,15% de NaCl + 25% de proteínas
(n=08)
Dieta normossódica: 1,27% de NaCl + 25% de proteínas
(n=09)
Dieta hipersódica: 7,94% de NaCl + 25% de proteínas
(n=08)
As ratas foram acondicionadas em gaiolas individuais em ambiente mantido a
25°C, com ciclos noite-dia fixos (12/12 horas), recebendo água ad libitum. A
quantidade de dieta fornecida para cada animal foi controlada com o intuito de
igualar o peso corpóreo entre os grupos durante o estudo.
Ao completarem 3 meses de idade, as ratas foram acasaladas com ratos
Wistar machos, que receberam a dieta normossódica desde o desmame. Após o
nascimento, apenas 8 recém-nascidos (4 machos e 4 fêmeas) permaneceram com
suas mães.
12
As dietas com os diferentes conteúdos de sal foram mantidas até o desmame
da ninhada que passou a receber apenas dieta normossódica.
PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Para
a
realização
deste
trabalho
foram
utilizados
dois
protocolos
experimentais ligeiramente diferentes (detalhes ver figuras 1 e 2).
As medidas da pressão arterial caudal (PAc) materna foram realizadas na 11a
semana de vida (pré-gestação), durante a gestação (12a, 13a e 14a semanas de
vida) e uma semana após a gestação (15a semana de vida). Hematócrito (Ht) e peso
foram medidos nos mesmos momentos. Antes da fecundação, colesterol e
triglicérides plasmáticos foram dosados.
No dia do nascimento foram avaliados o tamanho, peso, número de
natimortos e a relação macho/fêmea da prole. Como já mencionado anteriormente,
apenas 8 recém-nascidos (4 machos e 4 fêmeas) permaneceram com suas mães e
foram acompanhados durante o restante do estudo.
Ocorrido o desmame (3 semanas de vida), machos e fêmeas receberam
apenas dieta normossódica.
Na prole, foram avaliados semanalmente o peso desde o desmame, a
pressão arterial caudal entre a 8a e a 12a semana de idade e ao completar 3 meses
de idade, mediu-se o fluxo sangüíneo renal (FSR), a sensibilidade da pressão
arterial ao sal (SENS), a atividade de renina plasmática (ARP), a massa renal
(Mrenal) e ventricular esquerdas (MVE), a pressão arterial direta (PA), a densidade e
o
diâmetro
glomerular
(DDG),
e
o
número
(imunohistoquímica) para angiotensina II na córtex renal.
13
de
glomérulos
positivos
Figura 1- Protocolo experimental 1
Desmame
fêmeas
(3 sem.)
fecundação
(12 sem.)
desmame
parto
prole
(15 sem.) (3 sem.)
PAcaudal, Ht
(semanalmente)
peso (semanalmente)
14
prole
(12 sem.)
PA(direta), FSR,
MRenal, MVE
Figura 2- Protocolo experimental 2
desmame
prole
(3 sem.)
prole
(12 sem.)
prole
(14 sem.)
Teste sens.
ao sal, ARP
15
prole
(15 sem.)
PA(direta), MVE
MRenal, DDG,
Angiotensina II
PESO
Nas mães, o peso foi avaliado diariamente, desde o desmame até a
fecundação, pois como havia controle da quantidade de dieta oferecida, na tentativa
de evitar diferenças no peso entre os grupos, precisávamos saber o ganho de peso
diário de cada animal. Após a fecundação, o peso foi avaliado semanalmente até
uma semana após o parto.
Na prole, o peso foi avaliado ao nascimento (no dia do parto) e
semanalmente após o desmame.
PRESSÃO ARTERIAL CAUDAL
A pressão arterial caudal foi medida pelo método oscilométrico35, em animais
acordados. Os valores obtidos correspondem à pressão arterial média
Nas mães as medidas de pressão arterial foram realizadas semanalmente
desde a 11a semana de vida (pré-gestação), durante a gestação (12a, 13a e 14a
semanas de vida) e uma semana após a gestação (15a semana de vida). Após a
medida da pressão arterial caudal materna, coletou-se amostras de sangue, por
meio de uma incisão na cauda, em tubos heparinizados para determinação do
hematócrito.
Na prole, medidas de pressão arterial caudal semanais foram realizadas
entre a 8a e a 12a semana de idade.
16
PRESSÃO ARTERIAL NA CARÓTIDA
A medida de pressão arterial direta na artéria carótida foi realizada somente
na prole.
Um cateter de polietileno (PE-50, Intramedic Inc., USA) foi introduzido na
artéria carótida esquerda sob anestesia com éter. O cateter foi exteriorizado entre as
escápulas e preenchido com uma solução salina com heparina 500U/ml (Produtos
Roche Químicos e Farmacêuticos S/A, São Paulo, Brasil).
Após um período de recuperação de 24 horas (período de recuperação
utilizado em uma primeira parte dos animais, resultados apresentados somente nas
tabelas A37 e A38) ou de 4-6 dias (período de recuperação utilizado em uma
segunda parte dos animais) após a cirurgia, os ratos foram colocados em gaiolas
individuais, havendo total liberdade à movimentação. Em seguida, o cateter era
conectado a um transdutor de pressão (marca Gould Sthatan Instruments Inc.,
modelo P23DB, Hato Rey, Puerto Rico – USA) acoplado a um amplificador
(Stemtech Inc, GPA-4 modelo 2, Wisconsin – USA) que fornecia um sinal analógico.
Este sinal analógico era digitalizado utilizando-se um sistema computadorizado
(DATAQ Instruments Inc., Ohio – USA). A coleta de dados da pressão arterial
carotídea foi realizada durante 30 minutos, sendo que as médias dos valores obtidos
em amostras de 15 segundos a cada 3 minutos foram usadas para os cálculos.
17
FLUXO SANGÜÍNEO RENAL
Após a medida da pressão arterial na carótida, um subgrupo de animais foi
anestesiado (tionembutal 50 mg/kg) e uma incisão mediana abdominal foi feita para
permitir o acesso à artéria renal. Terminada a limpeza da artéria renal de seus
tecidos adjacentes, um sensor ultrassônico acoplado a um fluxômetro (modelo
T106, Transonic System Inc., Bethesda – USA) foi acondicionado à artéria renal
para medida do fluxo sangüíneo renal. As medidas foram realizadas após um
período de 20 minutos para estabilização.
TESTE DE SENSIBILIDADE DA PRESSÃO ARTERIAL AO SAL
Ao completar 3 meses de idade, uma parte dos animais da prole foi
submetida ao teste de sensibilidade da pressão arterial ao sal.
Durante 7 dias os animais receberam dieta hipossódica ou hipersódica e ao
final do 7o dia tiveram sua pressão arterial caudal medida. Ao final desta semana, a
dieta foi invertida por mais 7 dias, ou seja, os que haviam recebido dieta hipossódica
nos primeiros 7 dias, passaram a receber dieta hipersódica e vice-versa por mais
um período de 7 dias. Ao final do segundo período de 7 dias, os animais tiveram sua
pressão arterial caudal medida novamente.
A sensibilidade a sal foi considerada como sendo a variação percentual da
pressão arterial caudal medida ao final das duas. Consideramos a pressão arterial
caudal medida ao final do período da dieta hipossódica como basal, ou seja (100%).
18
DOSAGEM DE TRIGLICÉRIDES E COLESTEROL MATERNOS
Na semana precedente à fecundação, ou seja, na 11a semana de idade,
coletou-se 0,5 mL de sangue pela cauda em tubos plásticos heparinizados que
foram centrifugados a 4o C por 10 minutos a 3.000 rpm. O plasma foi utilizado para
dosagem de triglicérides e colesterol maternos utilizando-se um “kit” enzimático
comercial (Merck Diagnostic, Alemanha).
DOSAGEM DA ATIVIDADE DE RENINA PLASMÁTICA
Após as medidas da pressão arterial caudal no 7o e 14o dias do teste de
sensibilidade ao sal, foram coletados 1,0 mL de sangue pela cauda em tubos
plásticos preenchidos com 16 µL de EDTA 10% e que foram centrifugados a 4 oC
por 10 minutos a 3.000 rpm. O plasma foi utilizado para a dosagem da atividade de
renina plasmática por “kit” de radioimunoensaio (CIS Bio International, França).
MASSA RENAL
O rim esquerdo foi retirado sob anestesia (tionembutal 50 mg/kg). A cápsula
renal foi removida e os rins foram pesados em balança de precisão. Ao término da
pesagem, o rim foi fixado utilizando-se uma solução de Dubosque-Brasil (imersão
por 1 hora). Após a fixação, o rim foi colocado em uma solução de formol
tamponado (10%) e guardado em geladeira.
19
MASSA VENTRICULAR ESQUERDA
O coração foi retirado sob anestesia (tionembutal 50 mg/kg). Utilizando-se
uma tesoura pequena, o ventrículo esquerdo foi separado das outras câmaras
cardíacas e pesado em balança de precisão. O ventrículo esquerdo foi colocado em
uma solução de formol tamponado (10%) e guardado em geladeira.
PREPARO DOS RINS PARA HISTOMORFOMETRIA E IMUNOHISTOQUÍMICA
Após a fixação dos rins, estes foram cortados sagitalmente ao meio,
embebidos em parafina, cortados em fatias de 5 µm e corados com hematoxilinaeosina.
DENSIDADE E DIÂMETRO GLOMERULAR
Utilizou-se
uma
técnica
já
descrita
por
Lucas
e
colaboradores36.
Sucintamente, com o auxílio de um microscópio óptico, cuja ocular estava acoplada
a uma rede de área conhecida, foi possível contar o número de glomérulos que
ficavam dentro desta área nos diversos campos analisados e calculou-se a
densidade glomerular utilizando-se a fórmula: n = G/F x A x (D+T), onde n, número
de glomérulos (/mm-3); G, número de glomérulos contados em 30 campos; F,
número de campos contados; A, área da rede utilizada (372.100,00 µm2); D,
diâmetro médio dos glomérulos; T, espessura do corte (5 µm).
O diâmetro glomerular médio foi calculado a partir da área glomerular média
(ĀG) pelo método de contagem de pontos de Weibel37. A ĀG foi calculada para cada
animal, fazendo-se uma média dos valores obtidos em pelo menos 30 glomérulos,
20
escolhidos ao acaso, contando-se os pontos que ficavam dentro da área do
glomérulo. Para isso, os glomérulos foram examinados sob uma rede ocular de 100
pontos a um aumento final de 320 vezes. O campo visual do microscópio neste
aumento cobria uma área de 133.932 µm2.
Um observador que desconhecia de qual grupo eram as lâminas, realizou
todas as medidas de densidade e diâmetro glomerular.
IMUNOHISTOQUÍMICA PARA ANGIOTENSINA II NA CÓRTEX RENAL
O conteúdo de angiotensina II na córtex renal foi medido conforme descrito
previamente37. Em resumo, os cortes foram desparafinizados (aquecimento a 60oC
por 30 minutos) e imersos em xylol (3 períodos de 9 minutos). Em seguida, os cortes
foram reidratados em etanol 100% (2 períodos de 5 minutos) seguido de tratamento
com etanol 96% (2 períodos de 3 minutos). Para se identificar a presença de
angiotensina II no tecido utilizou-se um anticorpo policlonal de coelho (Penninsula,
CA – USA) marcado pelo método da streptavidina/biotina- fosfatase alcalina.
Assim como no item anterior, um observador que desconhecia de qual grupo
eram as lâminas realizou a quantificação das áreas positivas para angiotensina II.
Somente as marcações positivas presentes nas arteríolas aferentes foram
consideradas. Foram contados pelo menos 30 campos com área de 0,13 mm2
O conteúdo de angiotensina II na córtex renal foi expresso em porcentagem
de glomérulos positivos.
21
ESTATÍSTICA
Os valores são expressos como média ± desvio padrão da média ou como
média ± erro padrão da média (utilizado em alguns gráficos para facilitar a
visualização).
Utilizou-se a análise de variância de dois fatores (2-way ANOVA) para
verificar os efeitos decorrentes do tempo e do conteúdo de sal na dieta sobre
variáveis como o peso corpóreo, hematócrito, pressão arterial materna no decorrer
da gestação e evolução do peso corpóreo e da pressão arterial caudal medidos
longitudinalmente na prole.
Análise de variância de um fator (one-way ANOVA) foi utilizada para avaliar o
efeito do conteúdo de sal na dieta sobre variáveis como o peso ao nascimento,
tamanho da ninhada, massa renal, massa ventricular esquerda, fluxo sangüíneo
renal, pressão arterial e freqüência cardíaca da prole aos 3 meses de idade.
Erro α menor do que 5% foi aceito para rejeitar a hipótese de nulidade.
22
RESULTADOS
Todas as tabelas identificadas com a letra “A” seguida de um número
encontram-se no apêndice. As demais tabelas, bem como as figuras estão inseridas
no capítulo resultados.
RESULTADOS MATERNOS ATÉ O ACASALAMENTO
Esses resultados foram obtidos no período correspondente entre a chegada
das ratas recém-desmamadas até a fecundação aos 3 meses de idade.
Não houve diferença entre os grupos com relação ao ganho de peso (figura 3,
tabelas A1 – A3) e ao consumo alimentar (tabela A62) do desmame até o dia da
fecundação quando as ratas passaram a receber dieta ad libitum.
HO (n=8)
NR (n=9)
300
(média ± DP)
g
HR (n=8)
200
de smame
fe cundação
100
0
0
2
4
6
8
10
12
Semanas
Figura 3- Evolução do peso materno do desmame até a fecundação.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
23
Não houve diferença de triglicérides plasmáticos, mas o grupo HR apresentou
menor colesterol circulante comparado aos grupos HO e NR (tabelas 1 e A4 – A6).
Tabela 1: Triglicérides e colesterol plasmáticos maternos (mg/dL) uma
semana antes da fecundação, dos grupos dieta hipossódica (HO),
dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO (5)
NR (5)
HR (4)
Triglicérides
56,0 ± 6,7
53,4 ± 6,5
50,2 ± 9,2
Colesterol
65,8 ± 8,3
62,9 ± 14,3
44,9 ± 7,9 #
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
# = p<0,05 – HR vs HO e NR.
RESULTADOS MATERNOS DURANTE A GESTAÇÃO
Houve um acentuado ganho de peso durante a gestação nos três grupos
(p<0,05 comparado ao peso antes da fecundação). Uma semana após o parto, o
peso ainda mantinha-se maior que o peso no dia da fecundação (tabelas 2 e A7 –
A9). Não houve diferença entre os grupos.
Tabela 2: Evolução do peso materno (g) durante a gestação dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
Tempo de gestação
(semanas)
Fecundação
1a semana
2a semana
3a semana
Pós-parto
HO (8)
209 ± 12,9
247 ± 17,6 *
293 ± 18,2 *
363 ± 14,4 *
297 ± 12,6 *
NR (9)
217 ± 18,6
247 ± 19,8 *
296 ± 16,4 *
375 ± 26,8 *
302 ± 22,5 *
HR (8)
212 ± 12,8
242 ± 10,1 *
289 ± 15,1 *
360 ± 13,2 *
289 ± 10,4 *
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
* P<0,05 comparado à fecundação.
24
O hematócrito caiu significantemente (p<0,05) a partir da segunda semana de
gestação, atingindo a queda máxima na terceira semana (tabelas 3 e A10 – A12).
Uma semana após o parto, os valores do hematócrito já tinham retornado aos
valores iniciais medidos na semana em que ocorreu a fecundação. Não houve
diferença entre os grupos.
Houve uma importante queda da pressão arterial (figura 4, tabelas A13 –
A15) a partir da segunda semana de gestação em todos os grupos. Mas o grupo
que recebeu sobrecarga salina apresentou valores de pressão arterial maiores que
os outros dois grupos durante todo o período de avaliação (p<0,001 – two way
ANOVA – efeito dieta).
Tabela 3: Hematócrito materno (%) dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta
normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR) durante a gestação.
Tempo de gestação
(semanas)
HO (8)
NR (9)
HR (8)
Fecundação
46 ± 1,3
45 ± 1,0
46 ± 0,7
1a semana
46 ± 1,2
45 ± 0,7
45 ± 0,6
2a semana
43 ± 1,2 *
43 ± 0,9 *
43 ± 1,0 *
3a semana
41 ± 1,6 *
41 ± 0,8 *
40 ± 0,9 *
Pós-parto
43 ± 1,2 *
43 ± 1,0 *
44 ± 1,2 *
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
* p<0,05 comparado à fecundação.
Os resultados obtidos durante a gestação (aumento de peso, queda do
hematócrito e da pressão arterial) nos permitem concluir que todos os grupos
utilizados neste projeto apresentaram alterações compatíveis com um padrão de
gestação dentro da normalidade.
25
(média ± DP)
mmHg
140
130
HO (n=8)
120
NR (n=9)
HR (n=8)
110
fecundação
período gestacional
100
0
1
2
3
4
Semanas
Figura 4 – Evolução da pressão arterial materna durante a gestação.
Tempo 0 (fecundação).
P<0,001 (two-way ANOVA – efeitos dieta e tempo).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
RESULTADOS DA PROLE
Os dados da prole referem-se aos dados que puderam ser medidos logo após
o parto, tais como o tamanho da ninhada e o peso ao nascimento da prole, ao longo
do desenvolvimento dos animais do desmame até 3 meses de idade, como o ganho
de massa corpórea e a pressão arterial caudal e os dados obtidos ao completarem 3
meses de idade, como a massa renal esquerda, a massa ventricular esquerda, o
fluxo sangüíneo renal, o teste de sensibilidade ao sal, a atividade de renina
plasmática, o conteúdo renal de angiotensina II e a densidade glomerular.
A intensidade de consumo de sódio durante a gestação e a amamentação
não influenciou o tamanho da ninhada, o peso dos recém-nascidos ou a proporção
entre machos e fêmeas da prole (tabelas 4 e A16 – A18).
26
Tabela 4: Tamanho da ninhada, peso e proporção entre machos e fêmeas
da prole dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica
(NR) e dieta hipersódica (HR) no dia do parto.
HO (8)
NR (9)
HR (8)
Tamanho da ninhada
12,4 ± 1,3
12,8 ± 1,7
12,1 ± 2,2
Peso da ninhada
5,4 ± 0,3
5,5 ± 0,3
5,5 ± 0,4
Proporção m/f
1,2 ± 0,6
1,3 ± 0,7
1,3 ± 0,9
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
m=machos, f=fêmeas.
Os animais cujas mães foram submetidas à dieta hipersódica (grupo HR)
apresentaram um desenvolvimento ponderal menor que os animais cujas mães
forma submetidas à dieta hipossódica ou normossódica (p<0,001 – Two way
ANOVA – efeito dieta) (tabelas 5, 6 e A19 – A24). Aos três meses de idade, o peso
dos machos do grupo HR foi menor do que o peso nos grupos HO e NR (p<0,05)
(figura 5) e o peso das fêmeas do grupo HR foi somente menor do que o peso no
grupo HO (p<0,05) (figura 6).
Para uma análise mais detalhada da evolução ponderal da prole dos 3
grupos, já que aos 3 meses de idade a prole do grupo HR é menos pesada que os
outros grupos e não houve diferença no peso ao nascimento, foi calculada a
velocidade de crescimento (crescimento percentual diário) dos grupos em três
períodos distintos (tabelas 7 e A25 – A30):
-
do nascimento até o desmame,
-
da 4a até a 6a semana de idade,
-
da 7a até 12a semana de idade,
27
Tabela 5: Evolução do peso (g) dos machos da prole, do desmame (3 semanas
de idade) até 3 meses de idade, dos grupos dieta hipossódica (HO),
dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
Idade (semanas)
HO (30)
NR (32)
HR (32) #
3
51,8 ± 5,8
53,3 ± 6,4
42,0 ± 6,5
4
96,5 ± 9,8
103,6 ± 12,5
80,7 ± 13,9
5
152,8 ± 14,1
155,0 ± 26,6
132,9 ± 14,1
6
199,6 ± 10,7
203,2 ± 21,7
184,1 ± 14,3
7
248,2 ± 14,9
263,3 ± 32,1
236,4 ± 21,3
8
298,4 ± 26,2
305,8 ± 27,4
279,4 ± 23,1
9
342,4 ± 25,7
345,4 ± 23,4
315,6 ± 25,1
10
372,0 ± 30,2
380,9 ± 25,9
340,9 ± 28,0
11
405,5 ± 29,2
415,7 ± 28,0
379,2 ± 21,0
12
430,0 ± 33,1
439,6 ± 31,7
399,5 ± 23,5
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
# p<0,05 (two-way ANOVA – efeito dieta) versus HO e NR.
Tabela 6: Evolução do peso (g) das fêmeas da prole, do desmame (3 semanas
de idade) até 3 meses de idade, dos grupos dieta hipossódica (HO),
dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR)
Idade (semanas)
HO (32)
NR (30)
HR (32) #
3
50,7 ± 7,6
51,4 ± 7,8
40,4 ± 4,8
4
87,9 ± 11,1
93,5 ± 11,2
73,4 ± 10,0
5
131,2 ± 13,2
135,4 ± 15,2
114,2 ± 12,7
6
161,2 ± 13,4
168,5 ± 13,2
151,4 ± 10,9
7
184,9 ± 13,7
193,1 ± 11,8
177,8 ± 11,1
8
202,3 ± 15,3
212,7 ± 16,8
198,8 ± 14,1
9
219,7 ± 20,6
236,5 ± 19,4
213,0 ± 18,3
10
235,4 ± 22,8
253,6 ± 20,9
226,3 ± 20,2
11
254,1 ± 25,6
273,5 ± 23,6
245,8 ± 19,7
12
273,2 ± 28,5
283,3 ± 23,4
258,6 ± 20,5
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
# p<0,05 (two-way ANOVA – efeito dieta) versus HO e NR.
28
500
(n=31)
(média ± DP)
g
(n=30)
#
450
(n=28)
400
350
300
HO
NR
HR
Dieta materna
Figura 5 – Peso dos machos da prole aos 3 meses de idade.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
n = número de animais.
# p<0,05 vs HO e NR.
(média ± DP)
g
350
(n=30)
(n=31)
300
#
(n=28)
250
200
HO
NR
HR
Dieta materna
Figura 6 – Peso das fêmeas da prole aos 3 meses de idade.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
N = número de animais.
# p<0,05 vs NR.
29
Tabela 7: Valores da velocidade de crescimento (percentual diário) da prole dos
grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR).
Idade (semanas)
HO (26)
NR (29)
HR (32)
0a3
40.0 ± 4.9
39.2 ± 5.1
30.0 ± 5.1 *
4a6
7.7 ± 1.2
7.3 ± 1.0
9.4 ± 2.1 *
7 a 12
2.0 ± 0.3
2.0 ± 0.5
1.9 ± 0.4
0a3
40.8 ± 6.9
40.0 ± 6.8
31.8 ± 6.6 *
4a6
6.0 ± 1.5
6.1 ± 1.6
7.9 ± 1.7 *
7 a 12
1.4 ± 0.4
1.3 ± 0.3
1.3 ± 0.3
Machos
Fêmeas
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
* p<0,001 vs HO e NR.
A prole do grupo HR apresentou uma menor velocidade de crescimento do
que a dos grupos HO e NR (p<0,001) entre o nascimento e o desmame. No período
entre a 4a e a 6a semana de idade houve uma inversão. A prole do grupo HR passa
a apresentar uma maior velocidade de crescimento (p<0,001) do que a dos grupos
HO e NR. Entre a 7a e a 12a semana de idade não houve diferenças de velocidades
de crescimento entre os três grupos.
O menor peso corpóreo da prole do grupo HR deve ser um reflexo da menor
velocidade de crescimento durante o período de amamentação.
Os animais cujas mães receberam sobrecarga salina apresentaram maior
pressão arterial caudal, avaliada entre a 8a e a 12a semana de idade, em
comparação aos outros dois grupos (p<0,05 – two way ANOVA – efeito dieta), tanto
30
para os machos (figura 7, tabelas A31 – A33) quanto para as fêmeas (figura 8,
tabelas A34 – A36).
Embora tenhamos encontrado diferenças na pressão arterial caudal na prole
entre a 8a e a 12a semana de idade, esta não alcançou significância estatística
quando analisada isoladamente na 12a semana de idade [machos: HO - 135±9
(n=18), NR - 135±8 (n=21), HR - 138±11 mmHg (n=9); fêmeas: HO - 130±5 (n=18),
NR - 132±7 (n=19), HR - 134±7 mmHg (n=7)].
(média ± DP)
mmHg
145
140
135
130
125
120
7
8
9
10
11
12
Semanas
HO (n=18)
NR (n=21)
HR (n=09)
Figura 7 – Pressão arterial caudal dos machos da prole no período
a
a
entre a 8 e a 12 semana de idade.
Dados expressos como média ± erro padrão.
N = número de animais.
# p<0,05 (two-way ANOVA – efeito dieta) vs HO e NR
31
#
(média ± DP)
mmHg
140
135
130
125
120
115
7
8
9
10
11
12
Semanas
HO (n=18)
NR (n=19)
HR (07) #
Figura 8 – Pressão arterial caudal das fêmeas da prole no período
a
a
entre a 8 e a 12 semana de idade.
Dados expressos como média ± erro padrão.
N = número de animais.
# p<0,05 (two-way ANOVA) vs HO e NR.
A pressão arterial direta medida na carótida aos três meses de idade não
diferiu entre os grupos [machos: HO - 122±12 (n=5), NR - 128±8 (n=11), HR 128±13 mmHg (n=5); fêmeas: HO - 113±7 (n=5), NR - 121±16 (n=10), HR - 116±6
mmHg (n=5)] (tabelas A50 e A51).
32
A quantidade de cloreto de sódio consumida pelas mães não influenciou o
fluxo sangüíneo renal da prole, pois não se verificou diferenças entre os grupos
(tabelas 8 e A39 – A40).
As fêmeas do grupo HR apresentaram menor sensibilidade da pressão
arterial ao sal (p<0,05) quando comparadas às fêmeas do grupo NR. No entanto,
podemos dizer que ao se observar os valores absolutos, tanto os machos quanto as
fêmeas da prole do grupo HR apresentam menor sensibilidade que os grupos HO e
NR (figuras 9 e 10, tabelas A41 – A46.
(média ± EPM)
∆ % mmHg
10.0
(n=15)
(n=12)
7.5
5.0
(n=09)
2.5
0.0
HO
NR
HR
Dieta materna
Figura 9 – Sensibilidade ao sal dos machos da prole.
Dados expressos como média ± erro padrão.
N = número de animais.
A atividade de renina plasmática, medida durante o teste de sensibilidade ao
sal, variou como o esperado nos grupos HO e NR, ou seja, maior atividade (p<0,05)
ao final da dieta hipossódica comparada à atividade no final da dieta hipersódica. No
entanto, os animais do grupo HR apresentaram uma modulação deficiente do
sistema renina-angiotensina em resposta a variações no consumo de sal, ou seja,
33
não houve diferença entre a atividade de renina plasmática medida após sete dias
de dieta hipossódica comparado a sete dias de dieta hipersódica (figura 11, tabelas
A47 – A49).
(média ± EPM)
∆ % mmHg
15
(n=11)
10
(n=13)
#
5
(n=07)
0
-5
-10
HO
NR
HR
Dieta materna
Figura 10 – Sensibilidade ao sal das fêmeas da prole.
Dados expressos como média ± erro padrão.
N = número de animais. # p<0,05 vs HO e HR.
Tabela 8: Fluxo sangüíneo renal (ml/min/100g de peso corpóreo) da prole dos
grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR) aos 3 meses de idade.
Machos
Fêmeas
HO
NR
HR
5,2 ± 0,6
5,0 ± 0,6
5,5 ± 0,9
(8)
(7)
(7)
4,9 ± 0,7
5,3 ± 0,9
5,0 ± 1,2
(8)
(7)
(7)
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
34
(média ± DP)
ng AI/mL/h
15
10
*
5
#
*!
0
HO
HO
NR
NR
HR
HR
Grupos
Figura 11 – Atividade de renina plasmática da prole durante o teste de
sensibilidade ao sal.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
Barra vazia = dados obtidos ao final da semana em dieta
hipossódica; barra cinza = dados obtidos ao final da semana
em dieta hipersódica.
Número de animais: HO (6), NR (6) e HR (6).
# p<0,05 vs dieta hipossódica. ∗ p<0,05 vs grupo HO.
♦ p<0,05 vs grupo HR.
Tanto a massa do ventrículo esquerdo quanto a massa renal esquerda não
apresentaram diferenças entre os grupos (tabelas 9 e A52 – A55).
O consumo de sódio materno não afetou a densidade ou o diâmetro
glomerular da prole. Observamos porém, que há uma diferença entre os sexos. Os
machos apresentaram uma densidade glomerular menor (p<0,05) comparado às
fêmeas (figura 12, tabelas A56 e A57), enquanto que as fêmeas apresentaram um
diâmetro glomerular menor (p<0,05) que os machos (figura 13, tabelas A58 e A59).
35
Tabela 9: Massa renal e massa ventricular esquerda (MVE) (g/100g de peso
corpóreo) da prole dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta
normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR) aos 3 meses de idade.
HO
NR
HR
0,34 ± 0,07
0,34 ± 0,04
0,33 ± 0,03
(21)
(21)
(21)
0,35 ± 0,04
0,35 ± 0,04
0,34 ± 0,05
(15)
(19)
(20)
0,18 ± 0,01
0,18 ± 0,02
0,19 ± 0,02
(18)
(24)
(15)
0,21 ± 0,02
0,19 ± 0,03
0,19 ± 0,02
(16)
(17)
(17)
Rim esquerdo
Machos
Fêmeas
MVE
Machos
Fêmeas
(média ± DP)
Glomérulos/mm3
Dados expressos como média ± DP. Número de animais entre parênteses.
250
200
#
#
#
NRm
HRm
150
100
HOm
HOf
NRf
Dieta materna
Figura 12 – Número de glomérulos da prole.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
m = machos: HO (8), NR (10), HR (8);
f = fêmeas: HO(7), NR(8), HR (5).
# p<0,05 vs fêmeas do mesmo grupo.
36
HRf
(média ± DP)
mm
0.13
0.12
#
#
0.11
0.10
HOm
NRm
HRm
HOf
NRf
HRf
Dieta materna
Figura 13 – Diâmetro glomérular da prole.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
m = machos: HO (8), NR (10), HR (8);
f = fêmeas: HO(7), NR(8), HR (5).
# p<0,05 vs fêmeas do mesmo grupo.
A prole cujas mães receberam sobrecarga salina apresentaram maior número
de glomérulos positivos para angiotensina II (p<0,05) do que os outros dois grupos
(figura 14, tabelas A60 e A61).
Este resultado associado à uma modulação deficiente do sistema reninaangiotensina, evidenciada durante o teste de sensibilidade da pressão arterial ao
sal, talvez sejam um dos mecanismos responsáveis pela maior pressão arterial
verificada nestes animais.
37
#
(média ± DP)
Glomérulos
Positivos (%)
40
*
30
20
10
0
HOm
NRm
HRm
HOf
NRf
HRf
Dieta materna
Figura 14 – Número de glomérulos positivos para angiotensina II.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
m = machos: HO(6), NR(8), HR (7);
f = fêmeas: HO(8), NR(7), HR (6).
* p<0,05 vs machos dos grupos HO e NR.,
# p<0,05 vs fêmeas do grupo HO.
38
DISCUSSÃO
No presente estudo foi verificado que em ratas Wistar, sobrecarga crônica de
sal na dieta eleva a pressão arterial e diminui o colesterol plasmático sem alteração
dos triglicérides circulantes. A menor concentração plasmática de colesterol
associada ao consumo de dieta hipersódica não é devida à diferença de peso
corpóreo entre os grupos, uma vez que a quantidade de dieta oferecida aos grupos
HO e NR foi ajustada de forma a manter o peso destes grupos semelhante ao peso
do grupo HR. Apesar de não haver diferença entre o peso corpóreo dos grupos de
animais estudados, há a necessidade de se excluir diferenças na massa de tecido
adiposo que podem ocorrer na vigência de pesos corpóreos semelhantes. Em
estudo prévio realizado no nosso Laboratório38 foi constatado em ratos Wistar
machos que o controle da oferta de ração visando o pareamento de peso resultou
também no pareamento de massa de tecido adiposo. A confirmação deste
fenômeno em fêmeas necessita de estudos adicionais. Outro estudo realizado pelo
nosso grupo39 constatou que ratos Wistar machos que recebem dieta hipossódica
apresentam triglicérides plasmáticos maiores do que aqueles que recebem dieta
hipersódica, sem, no entanto, ter-se verificado efeito da intensidade do consumo de
sal sobre o colesterol circulante. Para esclarecer os mecanismos responsáveis pelos
diferentes efeitos da restrição de sal na dieta sobre os lípides circulantes entre
machos e fêmeas, outros estudos precisam ser realizados.
Durante a gestação, os resultados obtidos estão de acordo com o esperado
para gestações normais. Houve uma redução do hematócrito e da pressão arterial
ao longo da gravidez, atingindo valores mínimos na 3a semana, próximo ao dia do
39
parto. O peso comportou-se inversamente ao da pressão arterial e do hematócrito,
aumentando ao longo dos 21 dias de gestação.
A pressão arterial caudal das ratas submetidas à sobrecarga salina crônica foi
maior que a pressão arterial caudal dos outros grupos durante a gestação (p<0,05 –
two way ANOVA). Há alguma controvérsia sobre o aumento da pressão arterial em
decorrência de um alto consumo de sal em indivíduos normais, já que alguns
estudos populacionais mostram uma correlação significativa entre quantidade de
ingestão de sal e pressão arterial40, 41 e alguns não verificaram esta correlação42, 43.
Estudos prévios realizados em nosso laboratório têm mostrado sistematicamente
que ratos Wistar machos submetidos a uma dieta hipersódica apresentam maior
pressão arterial quando comparados aos ratos submetidos a uma dieta
hipossódica38,
44
. No entanto, é preciso salientar que no presente estudo e em
trabalhos anteriores do nosso laboratório, a quantidade de sal na dieta hipersódica é
muito elevada e iniciada desde o desmame dos animais e mantida por um período
longo, ou seja, até a idade adulta.
Em um estudo realizado em ratos Sprague-Dawley, os autores encontraram
variação na proporção entre machos e fêmeas da prole em resposta à modificação
do consumo de sal das mães29. Outros estudos observaram um menor peso ao
nascimento quando o consumo de proteínas durante a gestação e amamentação
era reduzido45. No presente trabalho nenhuma diferença foi encontrada entre as
proles dos três grupos, tanto no peso ao nascimento quanto na proporção entre
machos e fêmeas e no tamanho da ninhada. Portanto, a variação do consumo de
sal utilizada em nosso protocolo não influenciou o desenvolvimento ponderal da
prole na vida intra-uterina. Estes dados também permitem afirmar que o ajuste da
40
quantidade de dieta ofertada aos grupos HO e NR para que o ganho de peso fosse
semelhante ao do grupo HR não proporcionou quaisquer alterações que pudessem
resultar em desnutrição das ratas.
Neste trabalho também foi mostrado que os machos e as fêmeas da prole de
ratas submetidas à sobrecarga salina apresentaram maior pressão arterial caudal,
menor peso corpóreo e nas fêmeas observou-se também uma menor sensibilidade
da pressão arterial frente a uma variação no consumo de sal. Além disso, um
conteúdo maior de angiotensina II na córtex renal e uma ausência de modulação do
sistema renina-angiotensina durante o teste de sensibilidade da pressão arterial ao
sal foram vistos neste grupo. Estes resultados indicam que o consumo elevado de
sal durante a gestação e amamentação pode exercer efeitos a longo prazo sobre o
ganho de peso, a pressão arterial e o sistema renina-angiotensina da prole.
A maior pressão arterial observada na prole do grupo HR comparada à dos
outros dois grupos foi pequena. Sabe-se, no entanto, que uma pequena diminuição
na pressão arterial em uma população está associada a uma importante redução na
incidência de eventos cardiovasculares46. Portanto, a diferença encontrada entre os
nossos grupos é biologicamente importante. Os resultados de trabalhos de outros
laboratórios que procuraram estudar os efeitos do consumo elevado de sal durante
a gestação não são uniformes, alguns mostrando elevação na pressão arterial da
prole21, 22, enquanto outros não encontrando efeito algum23, 47. A quantidade de sal
contida na dieta e/ou o tempo que esta dieta é oferecida aos animais pode ser uma
possível explicação para a falta de uniformidade nos resultados observados. Neste
trabalho, como já mencionado anteriormente, as mães receberam as dietas hipo,
normo ou hipersódica desde o seu desmame até o desmame da prole.
41
O maior peso corpóreo observado na prole dos grupos HO e NR na idade
adulta não pode ser explicado por diferenças no peso ao nascimento, uma vez que
este não diferiu entre os três grupos. Estudos prévios de nosso laboratório, também
têm mostrado que ratos Wistar machos submetidos à dieta hipossódica desde o
desmame até a vida adulta tem maior peso corpóreo38,
44
e também apresentam
maior massa de tecido adiposo (epididimal e retroperitonieal) e maior conteúdo de
gordura na carcaça do que ratos que receberam a dieta hipersódica38. No entanto,
neste trabalho todos os animais da prole receberam apenas a dieta normossódica
após o desmame, sendo a intervenção feita apenas durante a gestação e a
amamentação.
Os mecanismos que mantém o peso dentro de limites considerados normais
ainda não estão totalmente compreendidos. Um destes mecanismos é a regulação
do apetite. Alguns estudos consideram que na gênese da obesidade, mecanismos
que regulam o apetite podem estar alterados, fazendo com que o consumo de
alimentos seja maior do que as necessidades metabólicas requeridas48. No presente
estudo, o consumo de ração da prole do desmame até a 12ª semana de idade não
foi medido. A maior diferença observada no peso entre os grupos ocorreu entre o
nascimento e o desmame, o que dificulta a averiguação do consumo alimentar dos
ratos neste período. Um possível mecanismo responsável pelo menor peso
corpóreo da prole do grupo HR seria uma alteração no metabolismo energético
destes animais decorrente de vários mecanismos, por exemplo: alterações nos
níveis e função de hormônios anabólicos e/ou catabólicos, além de modificações na
atividade física e na termogênese.
42
É descrito na literatura que ratos jovens com maior ingestão calórica do que a
requerida, aumentam a taxa metabólica e o excesso energético é liberado na forma
de calor (termogênese), funcionando como um mecanismo de compensação que o
organismo lança mão na tentativa de manter o peso corpóreo dentro de limites
estreitos49,
50
. Este mecanismo talvez esteja ativado na prole do grupo de ratas
submetidas à sobrecarga crônica de sal, uma vez que estes animais têm peso
corpóreo menor do que o observado na prole dos outros grupos.
Os dados da velocidade de crescimento também indicam que a prole do
grupo HR apresenta uma variação no seu crescimento, com menor velocidade nas
primeiras três semanas de vida e maior velocidade entre a 4a e a 6a semana de
idade quando comparado às velocidades de crescimento observadas nos grupos
HO e NR. Uma possível explicação para este fenômeno seria a de que o período de
amamentação é o momento mais importante para a determinação do peso na idade
adulta, pois é durante a amamentação que se estabelecem as diferenças de peso
corpóreo entre os grupos e mesmo com as velocidades de crescimento maiores
entre a 4a e 6a semanas de vida, o grupo HR não consegue emparelhar-se com os
outros grupos. Sabe-se também, que o peso na idade adulta em seres humanos
correlaciona-se com o peso ao final do primeiro ano de vida e não com o peso ao
nascimento51. Portanto, o leite materno pode ser um dos fatores preponderantes na
determinação do peso corpóreo da prole. O conteúdo de sódio na dieta materna não
altera o conteúdo de sódio no leite materno20, mas estudos anteriores verificaram
que o consumo de dieta hipersódica durante a amamentação reduz a quantidade de
leite produzida ou alguma mudança no comportamento materno que leve as mães a
amamentarem um número menor de vezes ou por períodos de menor duração,
43
fornecendo assim menos leite à prole21,
27
podendo resultar em alterações
metabólicas e assim influenciar o desenvolvimento. Os resultados obtidos neste
trabalho sugerem que a quantidade de sal na dieta, durante a gestação e
amamentação, pode influenciar o ganho de peso corpóreo da prole em ratos Wistar.
No entanto, outros estudos são necessários para a melhor compreensão dos
mecanismos envolvidos.
Importantes alterações funcionais do sistema renina-angiotensina foram
verificadas na prole do grupo HR. Primeiro, durante o teste de sensibilidade da
pressão arterial ao sal, o período de restrição salina induziu um aumento na
atividade de renina plasmática comparada ao período de sobrecarga salina, o que é
esperado e considerado como resposta normal do sistema renina-angiotensina, nos
grupos HO e NR. Na prole do grupo HR entretanto, a atividade de renina plasmática
não se modificou entre os períodos de restrição e sobrecarga salina. Segundo, estes
mesmos animais apresentaram um conteúdo maior de angiotensina II na córtex
renal. Podemos suspeitar que essas alterações observadas no sistema reninaangiotensina devem ter sido provocadas por mudanças morfológicas e/ou funcionais
dos rins, como uma das conseqüências da sobrecarga de sal durante o período
perinatal. Novos estudos também são necessários para melhor entendermos os
mecanismos destas alterações. No entanto, é possível conjecturar que fatores
hormonais, neurais, metabólicos e/ou hemodinâmicos das mães devem ser os
responsáveis pelos efeitos da sobrecarga de sal, durante a gestação e
amamentação, sobre os diversos efeitos observados na prole na idade adulta.
Além da maior pressão arterial e de menores níveis de colesterol plasmático
observados nas ratas do grupo HR antes da gestação, outros estudos têm mostrado
44
que: o sistema nervoso simpático52, o sistema renina-angiotensina52, a sensibilidade
à insulina38,
44
, os níveis de lipídeos plasmáticos39,
53
, a atividade da via L-
arginina/óxido nítrico54, etc. podem ser modificados por variações no consumo de
sódio. Um ou mais destes fatores poderiam influenciar o desenvolvimento renal
durante a vida intra-uterina e/ou durante os primeiros dias de vida, resultando em
alterações na função do sistema renina-angiotensina renal.
Sabe-se da literatura que todos os componentes do sistema reninaangiotensina são expressos no rim em desenvolvimento55 e as ações e o padrão de
distribuição dos receptores da angiotensina II (AT1 e AT2) ao longo da morfogênese
renal são muito importantes na diferenciação e maturação dos néfrons56. Logo,
podemos supor que a inibição do sistema renina-angiotensina materno em resposta
à sobrecarga de sal poderia, durante os períodos de gestação e amamentação,
afetar o sistema renina-angiotensina renal do feto e/ou a distribuição dos receptores
AT1 e AT2 no rim fetal. Mais uma vez, estudos adicionais devem ser realizados para
melhor esclarecer os mecanismos responsáveis pelas alterações encontradas no
sistema renina-angiotensina da prole das ratas submetidas à sobrecarga crônica de
sal.
O conteúdo de sódio da dieta materna não afetou a densidade e o diâmetro
glomerular, havendo somente diferenças entre machos e fêmeas. Não temos uma
explicação para a maior densidade e menor diâmetro glomerular encontrado nas
fêmeas. Talvez esta seja uma característica normal do gênero.
Uma possível explicação para a menor sensibilidade ao sal da prole do grupo
HR seria a de que esta menor sensibilidade seja apenas uma resposta homeostática
ao elevado consumo de sal. Portanto, esta menor sensibilidade seria um
45
mecanismo protetor, cujo objetivo seria prevenir grandes aumentos da pressão
arterial ao se aumentar a ingestão de sódio.
Finalmente, a prole das mães que receberam sobrecarga salina crônica
durante a gestação e a amamentação, apresentou maior pressão arterial, menor
sensibilidade da pressão arterial frente a uma modificação do consumo de sal, maior
conteúdo renal de angiotensina II e menor peso corpóreo na idade adulta.
46
CONCLUSÕES
1) Sobrecarga crônica de sal na dieta eleva a pressão arterial de ratas Wistar,
confirmando resultados anteriores de nosso laboratório obtidos em machos
Wistar.
2) Sobrecarga crônica de sal na dieta materna durante a gestação e amamentação,
aumenta a pressão arterial e o conteúdo renal de angiotensina II e diminui o
ganho de peso e a sensibilidade da pressão arterial frente a uma variação do
conteúdo de sal na dieta da prole na idade adulta.
3) Uma disfunção da modulação do sistema renina-angiotensina, observado na
prole do grupo HR, pode ser a responsável pela maior pressão arterial e menor
sensibilidade ao sal encontrada neste grupo.
4) O conteúdo de sal nas dietas utilizadas neste estudo não influenciou o tamanho
da ninhada, o peso dos recém-nascidos, a proporção entre machos/fêmeas, o
fluxo sangüíneo renal, a massa renal e a massa ventricular esquerdas e também
não alterou a densidade glomerular da prole na idade adulta.
“A quantidade de sal na dieta materna pode ser responsável por efeitos
a longo prazo sobre a prole em ratos Wistar.”
47
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54
APÊNDICE
55
A1: Evolução do peso materno (g) do grupo dieta hipossódica (HO), do desmame (3 semanas de idade) até a
fecundação (12 semanas de idade).
Idade
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
(semanas)
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
51
36
26
30
34
26
33
34
84
70
56
72
70
68
70
78
120
110
102
88
85
87
85
94
145
134
131
125
125
124
122
132
Média
DP
33,8
7,9
71,0
8,1
96,4
13,1
129,8
7,5
148
153
143
138
145
146
163
165
175
170
153
148
160
156
169
173
186
180
170
165
175
175
185
195
202
190
172
178
182
185
190
210
213
186
192
190
201
195
215
225
222
213
195
191
206
200
220
148,0
8,0
162,0
9,3
176,1
7,2
186,8
9,6
200,3
11,2
209,0
12,9
DP = desvio padrão.
56
A2: Evolução do peso materno (g) do grupo dieta normossódica (NR), do desmame (3 semanas de idade) até a
fecundação (12 semanas de idade)
Idade
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
(semanas)
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
30
44
46
33
30
36
35
35
28
60
73
83
66
65
95
86
86
80
86
124
115
107
100
96
65
97
94
106
135
140
127
140
125
105
129
130
130
145
157
167
170
158
133
151
151
168
145
178
190
175
163
155
154
153
190
165
196
200
185
177
168
165
168
200
186
210
210
198
190
183
185
188
210
205
220
220
218
194
185
193
199
222
225
240
235
235
200
190
196
210
Média
DP
35,2
6,2
77,1
11,7
98,2
16,9
126,3
12,9
151,3
13,7
164,6
14,5
179,3
13,8
194,4
10,5
204,9
12,9
217,0
18,6
DP = desvio padrão
57
A3: Evolução do peso materno (g) do grupo dieta hipersódica (HR), do desmame (3 semanas de idade) até a
fecundação (12 semanas de idade).
Idade
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
(semanas)
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
48
36
43
43
36
42
36
36
51
62
80
65
70
67
57
59
107
96
117
112
115
103
96
95
120
116
125
142
138
122
123
120
138
127
Média
DP
40,0
4,6
63,9
8,9
105,1
8,9
125,8
9,2
168
165
157
148
147
165
146
154
183
185
180
160
158
178
162
179
196
190
196
170
175
186
183
196
207
206
210
188
200
195
186
210
220
218
220
195
210
202
197
215
225
226
224
195
208
150,0
14,6
166,4
14,6
180,8
12,3
197,0
10,4
206,8
13,1
211,5
12,8
DP = desvio padrão.
58
A4: Triglicérides e colesterol plasmáticos maternos (mg/dL) do grupo dieta
hipossódica (HO) uma semana antes da fecundação.
Triglicérides
Colesterol
1
2
3
4
5
52,1
49,5
61,4
52,1
64,9
59,0
57,3
70,3
64,7
72,1
Média
DP
56,0
6,7
65,8
8,3
Animais
DP = desvio padrão.
A5: Triglicérides e colesterol plasmáticos maternos (mg/dL) do grupo dieta
normossódica (NR) uma semana antes da fecundação.
Triglicérides
Colesterol
1
2
3
4
5
52,1
48,2
46,3
59,8
60,4
53,6
76,6
42,5
69,8
72,1
Média
DP
53,4
6,5
62,9
14,3
Animais
DP = desvio padrão.
59
A6: Triglicérides e colesterol plasmáticos maternos (mg/dL) do grupo dieta
hipersódica (HR) uma semana antes da fecundação.
Triglicérides
Colesterol
1
2
3
4
50,8
46,9
62,4
40,5
42,7
38,2
56,4
42,2
Média
DP
50,2
9,2
44,9
7,9
Animais
DP = desvio padrão.
A7: Evolução do peso materno (g) do grupo dieta hipossódica (HO) durante a
gestação.
fecundação 1a semana
2a semana
3a semana
pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
225
222
213
195
191
206
200
220
275
268
246
226
230
245
233
249
313
325
285
281
278
296
272
293
379
382
348
348
376
355
351
365
312
305
298
287
300
279
283
311
Média
DP
209
12,9
247
17,6
293
18,2
363
14,4
297
12,6
DP = desvio padrão.
60
A8: Evolução do peso materno (g) do grupo dieta normossódica (NR)
durante a gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
222
225
240
235
235
200
190
196
210
254
268
276
255
258
235
225
220
231
300
313
322
298
308
278
276
280
289
389
412
420
350
376
355
345
362
368
312
342
326
298
281
275
278
302
301
Média
DP
217
18,6
247
19,8
296
16,4
375
26,8
302
22,5
DP = desvio padrão.
A9: Evolução do peso materno (g) do grupo dieta hipersódica (HR) durante a
gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
202
197
215
225
226
224
195
208
240
231
245
255
255
243
227
238
298
285
296
301
310
278
265
276
365
360
349
375
381
344
359
348
294
299
291
293
302
283
278
272
Média
DP
212
12,8
242
10,1
289
15,1
360
13,2
289
10,4
DP = desvio padrão.
61
A10: Hematócrito materno (%) do grupo dieta hipossódica (HO) durante a
gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana
pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
45
45
48
48
47
47
45
46
46
45
46
48
47
46
46
44
43
43
45
44
45
42
42
43
41
40
42
43
44
41
39
41
42
43
44
45
45
43
42
43
Média
DP
46
1,3
46
1,2
43
1,2
41
1,6
43
1,2
DP = desvio padrão.
A11: Hematócrito materno (%) do grupo dieta normossódica (NR) durante a
gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana
pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
45
45
44
43
46
46
45
44
45
45
45
44
45
44
45
45
45
43
43
44
43
44
43
42
45
44
43
41
40
42
41
40
40
42
41
40
44
43
42
44
42
43
45
43
43
Média
DP
45
1,0
45
0,7
43
0,9
41
0,8
43
1,0
DP = desvio padrão.
62
A12: Hematócrito materno (%) do grupo dieta hipersódica (HR) durante a
gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana
pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
46
45
46
47
45
46
46
45
45
45
44
46
45
45
44
45
44
44
43
42
45
43
42
43
41
40
40
42
41
40
39
40
44
43
45
45
44
43
42
42
Média
DP
46
0,7
45
0,6
43
1,0
40
0,9
44
1,2
DP = desvio padrão.
A13: Pressão arterial caudal materna (mmHg) do grupo dieta hipossódica (HO)
durante a gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana
pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
124
121
123
108
127
125
130
123
118
119
108
123
117
123
122
120
116
115
110
125
112
119
119
115
111
114
102
121
108
119
104
117
118
120
111
121
116
120
114
Média
DP
123
7,0
119
5,1
117
4,8
112
6,8
117
3,4
DP = desvio padrão.
63
A14: Pressão arterial caudal materna (mmHg) do grupo dieta normossódica (NR)
durante a gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana
pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
124
123
123
125
126
125
126
121
128
123
124
125
123
125
124
119
118
117
122
122
121
121
103
121
105
114
122
115
115
117
113
111
115
104
110
119
120
123
123
123
115
120
113
119
120
Média
DP
125
2,1
122
3,1
117
7,7
113
4,4
120
3,5
DP = desvio padrão.
A15: Pressão arterial caudal materna (mmHg) do grupo dieta hipersódica (HR)
durante a gestação.
fecundação 1a semana 2a semana 3a semana
pós-parto
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
122
129
125
126
128
127
137
136
127
107
125
127
128
128
137
134
107
122
123
128
123
123
129
121
121
105
122
122
119
119
130
122
139
121
129
127
126
125
130
124
Média
DP
129
5,2
127
8,9
122
6,7
120
7,0
128
5,4
DP = desvio padrão.
64
A16: Tamanho da ninhada dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta
normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
Mães
HO
NR
HR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12
13
11
14
11
13
11
14
13
11
15
14
14
10
11
13
14
13
10
8
13
12
13
15
13
12,8
1,7
12,1
2,2
Média
12,4
DP
1,3
DP = desvio padrão.
A17: Peso (g) da prole ao nascimento dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta
normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
Mães
HO
NR
HR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
5,4
5,5
5,7
5,4
5,1
5,9
5,4
5,2
5,5
4,7
5,4
5,9
5,4
5,4
5,6
5,6
4,6
5,8
5,7
5,7
5,9
5,5
5,5
Média
5,4
DP
0,3
DP = desvio padrão.
5,5
0,3
65
5,5
0,4
A18: Proporção entre machos e fêmeas da prole dos grupos dieta hipossódica
(HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
Mães
HO
NR
HR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1,5
1,6
0,6
1,0
1,2
0,2
1,2
2,3
0,4
0,8
2,0
1,3
0,9
0,7
2,7
1,2
1,5
1,6
0,7
0,6
0,9
1,0
1,6
3,3
0,9
Média
1,2
DP
0,6
DP = desvio padrão.
1,3
0,7
1,3
0,9
66
A19: Evolução do peso (g) dos machos da prole do grupo dieta hipossódica (HO), do
desmame (3 semanas de idade) até 3 meses de idade.
Idade (semanas)
3
4
5
6
222
193
195
200
202
195
212
195
183
197
199
179
193
178
184
195
205
198
200
195
221
217
202
208
208
201
195
206
207
203
199,6
10,7
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
47
40
42
45
57
58
65
59
52
55
56
47
45
49
46
51
54
50
48
54
51
58
54
59
58
55
43
52
53
51
118
122
110
105
90
92
85
86
88
95
90
95
95
90
88
90
111
103
96
100
101
95
89
93
93
88
145
124
130
135
160
160
177
162
130
140
153
126
144
146
142
154
160
151
152
151
178
173
159
165
167
160
152
155
158
158
Média
DP
51,8
5,8
96,5
9,8
152,2
14,1
7
8
9
10
11
12
400
330
327
336
378
370
390
347
315
325
305
295
350
305
329
347
360
335
334
315
260
255
249
255
248
260
255
259
319
255
263
253
340
327
356
317.
275
280
289
268
300
260
270
308
310
296
295
284
325
331
298
315
285
322
292
310
319
289
338
330
370
365
338
342
369
343
465
355
350
315
400
398
412
365
340
355
340
320
360
358
363
377
398
365
358
348
410
402
370
364
390
389
367
371
395
359
500
389
375
400
425
410
456
385
368
380
382
353
409
393
395
411
430
396
400
375
443
439
394
400
416
419
394
408
428
391
555
423
406
455
440
432
480
410
395
415
455
412
424
413
412
430
445
400
412
386
469
468
406
413
432
430
406
419
450
408
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14,9
298,4
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372,0
30,2
405,5
29,2
430,0
33,1
262
250
275
243
219
236
235
211
258
243
251
240
DP = desvio padrão.
67
A20: Evolução do peso (g) dos machos da prole do grupo dieta normossódica (NR), do
desmame (3 semanas de idade) até 3 meses de idade.
Idade (semanas)
3
4
5
6
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
7
43
49
48
40
44
45
42
42
50
48
54
56
53
51
52
59
60
60
53
64
61
63
60
62
53
50
55
51
63
56
60
58
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100
98
92
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108
133
128
92
83
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111
110
110
112
111
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114
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95
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103
100
102
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156
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107
109
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175
190
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113
122
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170
170
183
184
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185
175
148
142
145
150
175
170
160
168
193
205
205
195
163
176
175
177
236
225
235
230
187
174
189
208
210
200
201
230
235
216
240
217
195
189
188
196
238
250
252
245
310
296
305
305
242
220
240
260
359
252
245
268
274
255
289
249
248
236
234
246
Média
DP
53,3
6,9
103,6
12,5
155,0
26,6
203,2
21,7
263,3
32,1
DP = desvio padrão.
68
8
9
10
11
257
268
280
257
351
341
357
354
290
276
286
302
310
296
295
324
336
315
300
300
302
293
290
295
338
320
307
321
320
333
335
325
297
315
317
305
386
365
376
335
335
325
342
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370
345
365
371
381
364
345
343
345
330
330
340
390
359
344
360
359
348
370
370
320
342
336
328
410
402
405
368
395
386
398
397
407
390
411
398
402
388
379
385
373
374
360
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396
383
396
350
373
375
355
432
445
428
400
430
415
425
438
455
428
446
424
426
413
418
405
419
405
390
404
470
418
412
441
305,8
27,4
345,4
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380,9
25,9
415,7
28,0
12
405
406
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411
380
407
415
395
460
478
465
437
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458
502
472
502
448
471
440
445
425
430
428
439
420
418
431
489
430
420
439,6
31,7
A21: Evolução do peso (g) dos machos da prole do grupo dieta hipersódica (HR), do
desmame (3 semanas de idade) até 3 meses de idade.
Idade (semanas)
3
4
5
6
7
8
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
34
31
35
32
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44
41
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44
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46
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45
53
40
40
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40
50
47
51
53
43
22
41
36
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40
45
44
42
74
60
63
65
64
66
66
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130
120
127
120
121
123
123
118
120
128
127
145
139
144
125
131
134
123
138
148
97
143
140
160
139
147
157
155
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210
223
210
200
215
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265
245
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270
271
250
245
257
225
227
246
245
223
255
185
248
240
240
235
242
256
257
257
251
280
257
236
247
247
250
96
97
95
103
95
90
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93
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92
91
169
164
175
166
165
180
177
172
185
196
195
187
172
185
193
195
189
204
171
191
195
183
198
193
137
189
188
200
185
191
200
200
Média
DP
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80,7
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132,9
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184,1
14,3
236,4
21,3
DP = desvio padrão.
69
9
10
11
12
305
280
316
311
298
292
307
270
265
290
290
285
300
241
289
295
291
278
285
279
312
270
283
294
295
307
310
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326
356
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305
295
315
315
300
337
262
336
334
328
311
318
342
353
295
290
322
293
308
305
322
323
342
335
315
386
350
380
382
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348
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358
345
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355
340
360
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359
359
330
342
370
375
355
351
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369
386
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370
358
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370
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400
400
391
323
388
385
382
350
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398
393
380
380
388
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420
415
410
427
383
385
433
395
395
425
400
416
435
423
425
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327
395
388
394
365
376
410
405
279,4
23,1
315,6
25,1
340,9
28,0
379,2
21,0
399,5
23,5
A22: Evolução do peso (g) das fêmeas da prole do grupo dieta hipossódica (HO), do
desmame (3 semanas de idade) até 3 meses de idade.
Idade (semanas)
3
4
5
6
175
156
162
180
167
173
172
150
159
147
160
153
140
136
142
166
169
185
146
185
158
168
160
170
146
161
150
150
149
176
180
166
161,2
13,4
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
41
35
42
63
68
55
61
44
47
49
50
51
42
47
44
48
47
52
46
63
55
53
54
50
50
58
57
54
56
57
38
44
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110
103
105
76
78
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85
91
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71
80
85
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74
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87
91
91
97
84
95
86
86
92
92
70
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117
110
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144
110
123
117
123
136
116
118
122
129
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146
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150
140
138
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125
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127
128
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152
120
135
Média
DP
50,7
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131,2
13,2
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9
10
11
12
198
196
195
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205
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216
198
198
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200
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190
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214
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200
198
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203
206
244
230
239
250
220
238
235
230
238
215
218
234
216
214
218
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252
261
268
234
252
243
260
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235
245
242
225
233
237
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280
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280
245
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260
300
302
290
290
258
231
247
255
179
165
170
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200
203
186
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188
200
220
207
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212
185
195
188
193
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216
232
226
239
200
212
245
220
199
234
195
215
205
213
203
272
256
275
240
259
208
232
237
240
217
260
211
225
219
228
213
286
274
308
256
270
217
253
278
257
229
281
253
238
225
244
226
306
292
336
276
278
221
275
304
276
253
318
258
249
232
253
230
306
293
338
184,9
13,7
202,3
15,3
219,7
20,6
235,4
22,8
254,1
25,6
273,2
28,5
205
190
195
197
175
185
170
182
195
198
171
DP = desvio padrão.
70
A23: Evolução do peso (g) das fêmeas da prole do grupo dieta normossódica (NR), do
desmame (3 semanas de idade) até 3 meses de idade.
Idade (semanas)
3
4
5
6
7
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
42
45
47
43
44
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37
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58
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50
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59
59
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48
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59
57
59
63
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91
89
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83
78
79
95
93
95
82
91
93
91
91
90
94
81
94
100
100
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128
128
135
103
100
98
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130
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127
126
123
130
140
150
151
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134
150
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138
142
130
143
156
152
143
160
170
175
175
145
140
140
166
165
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167
165
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188
170
168
174
178
178
169
180
163
192
183
182
191
190
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226
189
184
186
200
169
204
203
198
189
186
192
203
186
199
186
Média
DP
51,4
7,8
93,5
11,2
135,4
15,2
168,5
13,2
193,1
11,8
DP = desvio padrão.
71
8
9
10
11
12
196
209
195
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213
203
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257
205
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205
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228
221
204
210
189
226
210
220
207
228
237
236
221
213
226
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215
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223
217
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210
235
280
225
215
230
255
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230
260
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260
262
256
265
217
245
253
240
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223
255
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243
240
250
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230
257
271
297
248
250
231
273
255
278
248
268
272
270
271
268
250
243
228
238
268
305
265
260
268
300
250
271
294
302
268
267
243
300
270
306
259
302
289
299
297
253
254
305
263
288
270
262
230
243
290
314
285
297
280
310
273
284
313
311
274
276
245
311
281
315
280
304
288
298
302
212,7
16,8
236,5
19,4
253,6
20,9
273,5
23,6
283,3
23,4
A24: Evolução do peso (g) das fêmeas da prole do grupo dieta hipersódica (HR), do desmame
(3 semanas de idade) até 3 meses de idade.
Idade (semanas)
3
4
5
6
7
8
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
36
32
34
34
44
42
39
44
42
43
43
44
45
39
45
38
45
33
38
34
36
44
47
49
50
41
38
39
40
42
42
42
67
63
70
67
59
61
59
64
125
104
105
108
104
107
103
109
106
105
100
103
105
115
125
116
120
106
110
111
95
130
135
137
128
144
144
144
180
165
170
160
185
165
156
177
170
186
170
176
180
190
210
193
196
168
185
183
172
175
186
178
170
176
179
185
169
180
180
180
201
190
190
182
199
185
187
196
90
96
88
92
63
75
68
70
70
74
75
73
79
74
80
75
85
85
85
155
141
138
140
157
153
125
158
145
140
135
145
155
151
167
151
150
140
157
154
142
156
160
160
143
161
164
173
154
168
168
168
Média
DP
40,4
4,8
73,4
10,0
114,2
12,7
151,4
10,9
177,8
11,1
DP = desvio padrão.
72
9
10
11
12
211
236
225
210
181
200
195
195
195
200
190
185
204
200
225
198
203
203
203
209
196
188
205
200
213
215
210
210
225
260
240
220
184
203
200
201
210
210
200
190
222
220
255
223
227
227
227
209
205
208
195
225
215
205
215
218
230
240
236
237
240
275
253
248
194
215
215
210
224
248
215
205
230
228
265
249
238
238
238
257
232
220
245
238
244
260
244
248
250
292
254
253
208
225
230
220
248
270
238
225
247
239
276
278
255
255
255
255
250
223
255
245
260
270
269
283
258
300
278
265
220
240
242
235
265
290
265
260
260
249
296
267
257
257
257
198,8
14,1
213,0
18,3
226,3
20,2
245,8
19,7
258,6
20,5
A25: Velocidade de incremento ponderal (%/dia) dos machos da prole do grupo
dieta hipossódica (HO).
Idade (semanas)
0a3
4a6
7 a 12
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
35,9
29,9
31,6
34,2
43,5
44,3
50,3
45,2
36,5
38,9
39,7
32,5
41,2
37,8
36,1
41,2
39,4
45,5
40,4
44,5
43,7
41,2
35,4
43,8
44,7
42,9
5,1
4,3
6,6
6,1
7,4
8,2
9,6
7,7
8,5
6,2
7,5
7,5
8,3
8,6
9,1
8,3
7,1
7,9
7,9
7,7
7,6
8,0
8,5
8,7
8,8
9,3
1,9
2,1
2,1
2,0
2,3
2,2
2,7
2,7
2,1
1,9
1,8
1,7
1,6
1,8
2,1
2,0
1,8
1,8
2,2
1,6
Média
40,0
DP
4,9
DP = desvio padrão.
7,7
1,2
2,0
0,3
73
A26: Velocidade de incremento ponderal (%/dia) dos machos da prole do grupo
dieta normossódica (NR).
Idade (semanas)
0a3
4a6
7 a 12
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
32,5
37,7
36,8
29,9
37,1
38,1
35,2
35,2
34,3
32,7
37,4
39,0
38,5
39,2
39,2
34,1
49,7
47,1
48,8
46,3
48,0
38,0
35,6
39,6
36,4
45,2
39,7
42,9
41,3
8,0
7,5
7,8
8,0
7,1
7,7
5,5
5,7
7,4
7,8
10,2
6,4
6,4
5,8
5,9
7,5
8,0
7,1
7,9
7,2
7,2
8,4
7,3
7,6
1,7
1,8
1,9
1,8
1,4
1,8
1,5
1,2
2,9
3,1
3,1
2,3
1,1
2,2
2,6
1,8
1,8
1,9
1,4
2,1
2,2
2,2
2,3
2,2
Média
39,2
DP
5,1
DP = desvio padrão.
7,3
1,0
2,0
0,5
74
A27: Velocidade de incremento ponderal (%/dia) dos machos da prole do grupo
dieta hipersódica (HR).
Idade (semanas)
0a3
4a6
7 a 12
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
24.0
21.5
24.9
22.3
31.6
30.7
33.3
30.7
33.1
32.3
35.6
33.9
33.1
33.1
39.8
27.9
27.9
28.7
27.9
34.1
31.8
34.9
36.4
30.5
13.3
28.9
24.8
31.4
28.1
32.2
31.4
29.7
9.2
12.4
12.7
11.1
11.3
12.3
12.0
13.0
6.8
5.5
6.8
6.2
7.5
7.9
9.4
8.1
7.5
9.0
9.4
9.7
9.1
12.8
9.7
11.3
8.2
9.0
7.9
8.4
8.6
2.6
2.2
2.3
2.6
2.0
1.6
1.9
1.8
1.8
1.2
1.7
1.7
1.8
1.9
2.2
2.4
2.2
2.1
2.6
1.5
2.2
1.7
1.8
1.8
1.6
1.7
1.6
1.7
Média
30,0
DP
5,1
DP = desvio padrão.
9,4
2,1
1,9
0,4
75
A28: Velocidade de incremento ponderal (%/dia) das fêmeas da prole do grupo
dieta hipossódica (HO).
Idade (semanas)
0a3
4a6
7 a 12
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
32,4
27,0
33,3
50,8
55,2
43,7
49,0
32,9
35,4
37,1
38,0
36,1
35,2
39,5
34,4
49,8
42,9
41,1
42,0
38,5
38,5
45,5
44,6
42,0
43,7
55,6
35,5
41,8
4,3
3,7
4,9
4,6
7,0
7,4
6,0
6,3
4,9
7,1
4,9
7,1
7,7
7,1
7,4
7,0
6,5
5,8
6,0
5,4
5,4
5,3
5,0
5,3
5,3
4,4
6,5
11,2
6,0
1,1
0,8
1,1
0,9
2,0
1,8
2,0
1,7
1,2
1,2
0,8
1,1
1,2
1,4
1,2
1,5
1,3
2,3
Média
40,8
DP
6,9
DP = desvio padrão,
6,0
1,5
1,4
0,4
76
A29: Velocidade de incremento ponderal (%/dia) das fêmeas da prole do grupo
dieta normossódica (NR).
Idade (semanas)
0a3
4a6
7 a 12
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
32,8
35,4
37,2
33,7
35,8
30,3
29,3
44,6
44,6
43,7
48,0
39,5
37,8
37,8
29,3
47,2
46,3
46,3
35,7
39,3
38,4
31,2
48,3
46,5
48,3
51,9
5,8
6,4
6,6
6,9
3,6
4,1
3,6
4,1
7,4
7,2
8,0
8,5
4,4
6,7
7,0
7,7
6,0
6,2
6,8
6,8
3,3
6,5
7,2
1,4
1,4
1,3
0,6
0,8
1,1
1,1
1,5
1,8
1,4
1,6
1,8
1,1
1,6
1,6
1,3
1,4
0,8
1,5
1,5
1,7
1,4
Média
40,0
DP
6,8
DP = desvio padrão.
6,1
1,5
1,3
0,3
77
A30: Velocidade de incremento ponderal (%/dia) das fêmeas da prole do grupo
dieta hipersódica (HR).
Idade (semanas)
0a3
4a6
7 a 12
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
25,9
22,5
24,2
24,2
47,6
45,2
41,7
47,6
29,7
30,5
30,5
31,4
32,2
27,7
32,7
26,9
32,7
23,8
28,1
24,7
26,4
32,7
35,2
36,9
37,8
30,7
28,1
29,0
29,9
37,8
33,7
29,7
9,4
8,8
6,9
7,8
11,9
10,8
8,0
10,5
4,8
5,3
5,1
4,5
8,7
7,8
9,0
7,4
8,8
8,3
8,1
6,9
7,4
8,7
8,3
7,5
7,0
8,1
7,8
1,1
1,5
1,2
1,3
1,3
1,1
1,7
1,5
1,6
1,0
1,2
1,3
1,0
0,9
0,9
0,9
1,1
1,5
1,6
1,4
1,5
1,4
1,1
1,7
1,7
1,2
1,2
0,9
Média
31,8
DP
6,6
DP = desvio padrão,
7,9
1,7
1,3
0,3
78
A31: Pressão arterial caudal (mmHg) dos machos da prole do grupo dieta
hipossódica (HO) entre a 8a e a 12a semana de idade.
8a semana
9a semana
10a semana 11a semana 12a semana
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
128
125
125
126
132
136
132
120
116
112
134
140
142
140
126
138
136
126
130
124
124
128
134
136
134
122
107
116
136
142
138
138
124
138
136
126
132
125
128
132
128
140
132
122
118
116
132
138
144
134
126
140
134
128
134
125
132
135
134
140
130
124
114
114
138
140
144
138
124
142
134
124
134
126
135
137
136
142
136
126
120
116
140
144
146
146
128
146
136
128
Média
DP
130
8,5
130
9,0
131
7,5
131
8,9
135
9,0
Animais
DP = desvio padrão.
79
A32: Pressão arterial caudal (mmHg) dos machos da prole do grupo dieta
normossódica (NR) entre a 8a e a 12a semana de idade.
8a semana
9a semana
10a semana 11a semana 12a semana
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
132
125
140
126
130
134
118
140
140
134
134
136
132
138
124
120
138
126
132
126
118
136
128
132
128
120
134
124
138
138
132
132
136
134
140
124
120
142
122
134
128
124
134
132
135
124
128
134
124
136
142
132
128
134
134
136
124
120
138
126
132
125
122
136
128
132
126
126
126
128
126
142
136
128
134
136
134
124
120
136
128
136
128
124
149
137
147
128
137
140
120
144
140
138
136
138
138
136
126
122
140
130
134
127
122
Média
DP
131
7,1
131
6,6
130
5,9
130
5,5
135
8,1
Animais
DP = desvio padrão.
80
A33: Pressão arterial caudal (mmHg) dos machos da prole do grupo dieta
hipersódica (HR) entre a 8a e a 12a semana de idade.
8a semana
9a semana
10a semana 11a semana 12a semana
1
2
3
4
5
6
7
8
9
128
130
136
144
142
134
126
138
132
126
130
142
140
140
134
124
140
128
128
134
142
142
140
138
130
140
128
130
132
144
148
144
142
126
146
130
126
134
146
152
146
140
124
150
126
Média
DP
134
6,1
134
7,0
136
5,9
138
8,4
138
11,0
Animais
DP = desvio padrão.
A34: Pressão arterial caudal (mmHg) das fêmeas da prole do grupo dieta
hipersódica (HR) entre a 8a e a 12a semana de idade.
8a semana
9a semana
10a semana 11a semana 12a semana
1
2
3
4
5
6
7
140
132
132
134
136
132
124
138
134
136
136
124
130
124
136
136
134
136
124
132
126
138
132
132
138
130
134
128
140
140
142
136
126
128
126
Média
DP
133
4,9
132
5,8
132
5,0
133
3,8
134
7,1
Animais
DP = desvio padrão.
81
A35: Pressão arterial caudal (mmHg) das fêmeas da prole do grupo dieta
hipossódica (HO) entre a 8a e a 12a semana de idade.
8a semana
9a semana
10a semana 11a semana 12a semana
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
124
128
124
114
130
124
126
128
124
136
128
136
130
134
124
136
132
132
138
130
122
129
122
112
126
124
126
135
125
139
127
134
136
134
124
138
128
132
136
128
128
130
122
116
128
126
128
132
124
132
128
Média
DP
127
5,7
127
7,2
Animais
DP = desvio padrão.
82
135
136
123
122
134
130
128
128
122
138
128
134
138
132
134
135
120
118
130
130
132
136
128
130
127
134
128
132
120
142
130
132
140
130
127
4,5
129
5,4
130
5,2
136
126
130
129
125
134
126
140
134
136
140
132
A36: Pressão arterial caudal (mmHg) das fêmeas da prole do grupo dieta
normossódica (NR) entre a 8a e a 12a semana de idade.
8a semana
9a semana
10a semana 11a semana 12a semana
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
126
126
122
134
124
136
120
140
128
120
136
132
134
128
126
128
134
134
142
124
124
124
140
128
118
134
122
132
134
122
128
126
136
134
130
118
124
120
126
130
120
132
124
128
132
126
128
136
134
138
Média
DP
130
6,4
128
6,4
128
5,6
Animais
126
124
134
120
DP = desvio padrão.
83
126
124
122
134
128
138
120
136
130
120
134
130
128
126
128
132
134
138
126
126
124
136
138
140
122
144
132
122
136
126
128
130
128
128
138
136
140
129
5,7
132
6,7
A37: Pressão arterial direta (mmHg) (24h p/ recuperação) dos machos da prole
dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR).
HO
NR
HR
129
100
125
110
110
120
135
125
112
125
110
125
113
110
130
110
105
100
110
125
125
100
115
112
135
115
108
125
127
135
128
113
117,8
8,2
117,4
11,4
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
Média
118,7
DP
12,1
DP = desvio padrão.
84
A38: Pressão arterial direta (mmHg) (24h p/ recuperação) das fêmeas da prole
dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR).
HO
NR
HR
120
120
115
90
120
132
125
90
105
128
110
90
128
108
125
118
85
110
90
115
110
100
100
105
110
118
125
113
110,8
15,8
108,7
9,6
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Média
114,0
DP
15,6
DP = desvio padrão.
A39: Fluxo sangüíneo renal (mL/min/100g) dos machos da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
5,7
5,0
4,4
5,0
6,3
5,5
5,1
5,0
4,3
4,1
5,3
5,4
5,3
5,5
5,4
4,0
6,5
6,3
5,8
5,9
5,3
4,7
Média
5,2
DP
0,6
DP = desvio padrão.
5,0
0,6
5,5
0,9
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
85
A40: Fluxo sangüíneo renal (mL/min/100g) das fêmeas da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
3,7
3,9
5,3
5,7
5,0
5,0
5,0
5,2
3,6
5,7
5,4
5,7
6,6
4,7
5,6
5,6
6,7
3,5
3,8
4,5
5,9
4,7
Média
4,9
DP
0,7
DP = desvio padrão.
5,3
0,9
5,0
1,2
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
A41: Pressão arterial caudal (mmHg) dos machos do grupo dieta hipossódica
(HO), medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
∆ % (hipo – hiper)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
122
112
116
123
140
128
118
136
144
158
158
130
128
131
132
140
134
138
132
136
142
137
152
154
146
130
136
148
133
130
14,8
19,6
19,0
7,3
-2,9
10,9
16,1
11,8
6,9
-7,6
-17,7
4,6
15,6
1,5
-1,2
Média
DP
132,3
13,4
139,2
7,7
6,6
10,6
Animais
DP = desvio padrão.
86
A42: Pressão arterial caudal (mmHg) dos machos do grupo dieta normossódica
(NR), medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
∆ % (hipo – hiper)
158
140
136
139
131
134
134
128
127
118
120
130
149
140
138
172
130
122
130
128
134
136
144
135
-5,7
0,0
1,5
23,7
-0,8
-9,0
-3,0
0,0
5,5
15,3
20,0
3,9
138,2
12,9
4,3
10,2
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Média
132,9
DP
10,4
DP = desvio padrão.
A43: Pressão arterial caudal (mmHg) dos machos do grupo dieta hipersódica
(HR), medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
∆ % (hipo – hiper)
138
124
138
148
144
134
142
136
144
144
140
155
148
136
136
124
138
140
4,4
12,9
12,3
0,0
-5,6
1,5
-12,7
1,5
-2,8
140,1
8,6
1,3
8,1
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Média
138,7
DP
7,1
DP = desvio padrão.
87
A44: Pressão arterial caudal (mmHg) das fêmeas do grupo dieta hipossódica
(HO), medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
∆ % (hipo – hiper)
140
123
126
130
127
138
134
127
144
134
138
125
132
141
127
127
130
129
132
142
142
145
136
142
140
158
0,7
3,3
0,8
0,0
1,6
-4,3
6,0
11,8
0,7
1,5
2,9
12,0
19,7
137,8
8,8
4,4
6,5
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Média
131,8
DP
6,4
DP = desvio padrão.
A45: Pressão arterial caudal (mmHg) das fêmeas do grupo dieta normossódica
(NR), medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
∆ % (hipo – hiper)
128
121
125
140
112
124
119
120
120
118
118
130
129
126
142
130
140
132
134
138
120
128
1,6
6,6
0,8
1,4
16,1
12,9
10,9
11,7
15,0
1,7
8,5
131,7
6,5
7,9
5,8
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Média
122,3
DP
7,2
DP = desvio padrão.
88
A46: Pressão arterial caudal (mmHg) das fêmeas do grupo dieta hipersódica
(HR), medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
∆ % (hipo – hiper)
142
138
122
144
126
142
130
147
142
136
148
122
128
120
3,5
2,9
11,5
2,8
-3,2
-9,9
-7,7
134,7
11,6
0,0
7,4
Animais
1
2
3
4
5
6
7
Média
134,9
DP
8,8
DP = desvio padrão.
A47: Atividade de renina plasmática (ng/mL/h) do grupo dieta hipossódica (HO),
medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
4,0
10,6
16,9
9,0
5,4
6,1
1,0
0,3
1,0
2,8
7,7
3,8
3,9
8,7
4,7
2,9
2,5
Animais
1
2
3
4
5
6
7
Média
DP
DP = desvio padrão.
89
A48: Atividade de renina plasmática (ng/mL/h) do grupo dieta normossódica
(NR), medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
1,7
5,1
5,5
3,3
2,2
4,7
0,1
1,2
1,1
0,9
0,3
1,0
3,8
1,6
0,8
0,4
Animais
1
2
3
4
5
6
Média
DP
DP = desvio padrão.
A49: Atividade da renina plasmática (ng/mL/h) do grupo dieta hipersódica (HR),
medida durante o teste de sensibilidade ao sal.
7o dia em dieta hipo
7o dia em dieta hiper
7,0
7,5
4,8
7,3
1,1
6,8
2,9
8,4
10,1
5,1
7,6
3,4
1,5
4,5
5,7
2,5
5,4
3,0
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
Média
DP
DP = desvio padrão.
90
A50: Pressão arterial direta (4-6 dias p/ recuperação) dos machos da prole dos
grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR).
HO
NR
HR
116
132
114
137
108
119
121
129
139
139
122
116
126
134
129
127
126
122
150
117
124
127,9
7,7
128,3
12,9
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Média
122,0
DP
12,3
DP = desvio padrão.
A51: Pressão arterial direta (4-6 dias p/ recuperação) das fêmeas da prole dos
grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR).
HO
NR
HR
118
119
114
108
104
142
120
143
124
128
121
107
97
100
121
112
111
118
113
125
120,7
15,5
116,2
5,9
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Média
112,8
DP
6,6
DP = desvio padrão.
91
A52: Massa renal esquerda (g/100g) dos machos da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
0,34
0,36
0,37
0,30
0,32
0,37
0,34
0,36
0,31
0,32
0,30
0,30
0,26
0,29
0,27
0,43
0,51
0,50
0,28
0,31
0,34
0,40
0,40
0,34
0,38
0,36
0,37
0,35
0,36
0,31
0,33
0,37
0,36
0,33
0,32
0,29
0,32
0,29
0,30
0,29
0,30
0,31
0,36
0,36
0,35
0,40
0,33
0,35
0,32
0,32
0,33
0,35
0,32
0,32
0,35
0,39
0,27
0,30
0,29
0,30
0,30
0,27
0,31
Média
0,34
DP
0,07
DP = desvio padrão.
0,34
0,04
0,33
0,03
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
92
A53: Massa renal esquerda (g/100g) das fêmeas da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
0,37
0,35
0,37
0,35
0,36
0,34
0,41
0,42
0,38
0,33
0,36
0,29
0,33
0,29
0,32
0,35
0,42
0,35
0,38
0,33
0,34
0,33
0,34
0,37
0,42
0,38
0,30
0,34
0,35
0,30
0,29
0,31
0,37
0,46
0,40
0,39
0,38
0,34
0,38
0,34
0,35
0,34
0,32
0,39
0,35
0,31
0,35
0,32
0,34
0,36
0,23
0,26
0,36
0,22
Média
0,35
DP
0,04
DP = desvio padrão.
0,35
0,04
0,34
0,05
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
93
A54: Massa ventricular esquerda (g/100g) dos machos da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
0,18
0,18
0,19
0,20
0,21
0,19
0,19
0,17
0,18
0,19
0,17
0,18
0,20
0,19
0,17
0,15
0,17
0,17
0,19
0,21
0,22
0,21
0,19
0,17
0,23
0,19
0,18
0,16
0,15
0,21
0,16
0,16
0,17
0,16
0,17
0,17
0,16
0,16
0,15
0,16
0,16
0,17
0,21
0,21
0,21
0,18
0,18
0,17
0,18
0,20
0,22
0,17
0,18
0,17
0,18
0,16
0,18
Média
0,18
DP
0,01
DP = desvio padrão.
0,18
0,02
0,19
0,02
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
94
A55: Massa ventricular esquerda (g/100g) das fêmeas da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
0,22
0,23
0,19
0,20
0,23
0,23
0,22
0,22
0,22
0,22
0,20
0,19
0,18
0,20
0,17
0,17
0,20
0,18
0,21
0,20
0,24
0,22
0,21
0,20
0,21
0,19
0,19
0,16
0,15
0,16
0,17
0,16
0,17
0,19
0,18
0,19
0,20
0,18
0,23
0,18
0,20
0,21
0,19
0,21
0,23
0,21
0,17
0,17
0,16
0,16
Média
0,21
DP
0,02
DP = desvio padrão.
0,19
0,03
0,19
0,02
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
95
3
A56: Densidade glomerular (glomérulos/mm ) dos machos da prole dos grupos
dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
132,7
158,6
131,6
106,5
158,1
114,2
141,0
166,4
146,0
140,2
145,5
127,2
170,4
163,2
137,8
180,0
171,1
162,1
169,1
162,2
153,6
176,1
141,6
142,8
164,6
145,7
Média
138,6
DP
21,6
DP = desvio padrão.
154,4
17,3
157,0
13,0
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3
A57: Densidade glomerular (glomérulos/mm ) das fêmeas da prole dos grupos
dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
152,9
210,1
191,5
217,0
205,8
193,4
200,6
177,6
184,1
188,2
170,8
170,9
193,6
174,8
189,0
149,1
168,7
207,1
176,0
194,7
Média
195,9
DP
21,0
DP = desvio padrão.
181,1
8,8
179,1
22,6
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
96
A58: Diâmetro glomerular (mm) dos machos da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
0,110
0,111
0,118
0,120
0,109
0,123
0,112
0,108
0,112
0,110
0,112
0,114
0,108
0,113
0,114
0,111
0,113
0,116
0,109
0,113
0,109
0,104
0,115
0,117
0,110
0,108
Média
0,114
DP
0,006
DP = desvio padrão.
0,112
0,002
0,111
0,004
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
A59: Diâmetro glomerular (mm) das fêmeas da prole dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
0,112
0,109
0,109
0,104
0,100
0,104
0,099
0,107
0,109
0,107
0,105
0,104
0,105
0,110
0,107
0,107
0,111
0,107
0,108
0,102
Média
0,105
DP
0,005
DP = desvio padrão.
0,107
0,002
0,107
0,003
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
97
A60: Número de glomérulos positivos (%) para angiotensina II dos machos da
prole dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR).
HO
NR
HR
2,60
5,30
20,93
12,50
19,55
13,87
24,43
16,33
7,41
17,60
34,26
11,11
11,29
7,76
26,88
25,29
13,22
17,70
29,57
31,08
32,37
Média
12,46
DP
7,38
DP = desvio padrão.
16,27
9,21
25,16
7,16
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
A61: Número de glomérulos positivos (%) para angiotensina II das fêmeas da
prole dos grupos dieta hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta
hipersódica (HR).
HO
NR
HR
15,79
16,99
10,96
12,33
10,26
17,82
23,74
22,86
15,83
25,64
21,95
13,56
34,07
24,28
14,18
17,91
38,82
20,77
26,97
21,71
36,88
Média
16,34
DP
7,44
DP = desvio padrão.
21,36
5,10
27,17
8,79
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
98
A62: Consumo de ração (g) do desmame até a fecundação dos grupos dieta
hipossódica (HO), dieta normossódica (NR) e dieta hipersódica (HR).
HO
NR
HR
681,50
537,50
627,00
546,00
561,00
542,00
718,00
492,50
691,0
537,0
615,0
531,5
552,0
541,0
675,5
495,0
748,50
633,00
691,50
553,00
576,00
565,50
709,00
521,50
Média
588,2
DP
78,8
DP = desvio padrão.
579,8
72,1
624,8
83,4
Animais
1
2
3
4
5
6
7
8
99
ARTIGO SUBMETIDO PARA PUBLICAÇÃO
100
Title: Perinatal salt overload leads to a lower weight gain, higher blood pressure and
changes in the function of the renin-angiotensin system.
Authors: Alexandre Alves da Silva, Irene de L. Noronha, Ivone B. de Oliveira, Denise
M. C. Malheiros, Joel C. Heimann
Former studies that evaluated the association between a high salt environment
during the perinatal period and the adult offspring health conditions disclosed
conflicting results. In the present study, female Wistar rats received a low (LSD-0.15%
NaCl, n=8), normal (NSD-1.30%, n=9) or high (HSD-8.00%, n=8) salt diet. Mating
occurred on the 12th week of age. After weaning, the offspring received NSD. Weekly
tail-cuff blood pressure (tcBP) and body weight measurements were performed during
pregnancy and in the offspring. Salt sensitivity (SENS) of the BP was evaluated and
plasma renin activity (PRA) determinations were performed in the 12-week-old
offspring. Immunohistochemistry for angiotensin II was also performed in the kidneys
of the offspring. During pregnancy, tcBP was higher (p<0.0001) on HSD. Lower body
weight (p<0.001), higher tcBP (<0.0001), lower SENS (<0.05), and increased kidney
angiotensin II content were observed in the offspring of HSD dams. In conclusion, salt
overload during pregnancy and/or lactation has long-term effects on body weight and
blood pressure of the offspring. It seems also that high salt diet during the perinatal
period might induce functional changes of the renin-angiotensin system of the offspring.
Key words: Diet, pregnancy, offspring, sodium
101
Introduction
During the last twenty years, several studies have shown that the perinatal
environment might influence the adult health status. Undernourishment (14, 2), high salt
intake (6, 22), obesity (10), and low birth weight (18) are some of the maternal and
offspring conditions that were evaluated. Among the offspring conditions, the low birth
weight is the most frequently studied (9, 13, 18).
The few studies that evaluated the degree of salt consumption during pregnancy
and/or early life and its effects on adult blood pressure disclosed conflicting results. Di
Nicolantonio and co-workers (21, 22) showed that hypertension exacerbation was
present in adult SHR born from mothers that were fed with a high salt diet during
pregnancy. In these studies, an attenuated natriuretic response to an acute salt overload
was observed. Similar results were obtained by Hazon et al. (14) in Brattleboro rats
without diabetes insipidus and by Contreras (6) in Sprague-Dawley rats. In a study in
humans performed in The Netherlands, it was shown that children who received a low
salt diet during the first 6 months of age, have lower BP compared to the control group
(16), and, interestingly, fifteen years later, this difference was still apparent (12). In a
study using Dahl salt-sensitive rats no effect was shown in response to changes in the
degree of maternal sodium chloride intake on the offspring's blood pressure (7).
The present study was undertaken in order to better understand the influence of
salt overload or restriction during pregnancy and lactation on the weight gain, blood
pressure and renin-angiotensin system function of adult offspring Wistar rats.
102
Methods
Animals: all experiments reported herein were approved by the Committee on
Ethics of the School of Medicine of the University of São Paulo, Brazil.
From the day of weaning, female Wistar rats received low (LSD - 0.15% NaCl,
n=8), normal (NSD - 1.30%, n=9), or high (HSD - 8.00%, n=8) salt diet (Harlan Teklad,
Madison-WI/USA) and tap water. In a previous study from our laboratory, increased
weight gain was observed in male Wistar rats on low compared to HSD (24). Therefore,
in the present study, the amount of diet offered to the groups was adjusted in order to
provide similar weight gain. The animals were kept in individual cages in a controlled
temperature environment (25ºC), with light on/off cycling (lights on at 6 AM). In 11week-old animals, blood samples were taken by tail incision for triglyceride and
cholesterol determinations.
On completing 12 weeks of age, mating occurred by putting the female rats
together with males fed with NSD. The male rats were kept with the females during
three days. After birth, only 4 males and 4 females were maintained with each dam. The
offspring were weaned 21 days after birth and all were fed with normal salt diet for the
rest of the observational period.
Experimental protocol: the dams weight was measured every day from
weaning until fecundation and every week thereon until 7 days after pregnancy. Weekly
measurements of the offspring weight were performed from birth until the 12th week of
age. Tail-cuff blood pressure (tcBP) was measured by an oscilometric method (27) in
conscious animals. An observer that was not aware to which group the animals
belonged, performed the tcBP determinations. Weekly tcBP measurements in the dams
103
were performed from one week before until one week after pregnancy, and tcBP was
measured every week from the 8th until the 12th week of age in the offspring. At the 12th
week of age the offspring received HSD and LSD during one week each in random
order, for determination of the salt sensitivity of the blood pressure. The salt sensitivity
of the blood pressure was considered as the percentage change of the tail-cuff blood
pressure from the end of the week on LSD to HSD. Blood samples for plasma renin
activity (PRA) determination were obtained by a tail incision on the 7th day of each diet.
Renal blood flow was measured under anesthesia (thionembutal - 50mg/kg i.p.) with an
ultrasonic flowmeter (T106, Transonic System Inc., Bethesda, USA). Afterwards, the
left kidney was excised and prepared for angiotensin II immunohistochemistry and for
histological analysis.
Analytic methods:
Triglyceride and cholesterol were measured with a commercial enzymatic kit
(Merck Diagnostic, Germany) and PRA was measured with a commercial
radioimmunoassay kit (CIS Bio International, France).
Angiotensin II immunohistochemistry was performed as previously described
(11). Briefly, the left kidneys were rapidly removed and fixed. The fixed kidneys were
dehydrated in ethanol and xylene and embedded in paraffin. Longitudinal/coronal
sections (5 µm) were cut and placed on glass slides. The paraffin embedded sections
were deparaffinized by heating the sections at 60oC during 30 minutes, followed by
immersion in xylene during three periods of nine minutes each. Afterwards, the tissues
sections were rehydrated with ethanol 100%, for two periods of five minutes, followed
by treatment with ethanol 96% for 2 periods of 3 minutes. In order to identify
104
angiotensin II in the kidney tissue, a polyclonal rabbit antibody (Penninsula, CA, USA)
was used, and the method of the streptavidin/biotin-alkaline phosphatase was employed.
A blinded observer performed the quantification of positive areas for angiotensin II.
Only angiotensin II in the afferent arterioles was considered for analysis. The
quantification of angiotensin in the kidney was expressed as the percentage of positive
glomeruli for angiotensin II. For each section, a mean of 30 fields was examined, each
corresponding to an area of 0.13 mm2. Additional tissues sections were stained with
PAS for histological evaluation.
Statistical analyses: all values are expressed as the mean and SD except for
mean and SEM used in figure 2. For comparison of three or more means, one-way or
two-way analyses of variance was considered as appropriate. An α error less than 0.05
was considered as significant.
Results
Dams before pregnancy: in accordance with the adjusted diet offer, no weight
differences were observed during the period between weaning and mating among the
three groups (weight on the 12th week of age: LSD - 209±13, NSD - 217±19, HSD 212±13 g). Cholesterol levels were lower in the HSD group - 45±7.9 mg/dL (n=4)
compared to LSD - 66±8.3 mg/dL (n=5) and NSD - 63±14.3 mg/dL (n=5) (p<0.05). No
difference was observed in the serum triglyceride levels: LSD - 56±6.7 (n=5), NSD 53±6.5 (n=5), and HSD - 50±9.2 (n=4) mg/dL.
105
Dams during pregnancy: body weight increased during pregnancy with no
difference (p>0.05) between the groups (body weight at the 3rd week of gestation: LSD 363±14, NSD - 375±27, and HSD - 360±13 g). Hematocrit decreased (p<0.05) from the
second week on, achieving the lowest values at the 3rd week of gestation, in the three
dietary groups. One week after delivery, hematocrit was not different from the values
observed before pregnancy. Blood pressure decreased during pregnancy in the three
groups, but in the HSD group, blood pressure levels were always higher (p<0.0001) than
in the other two groups – table 1.
Offspring: No differences (p>0.05) were observed in the litter size (LSD –
12.4±1.3, NSD – 12.8±1.7, and HSD – 12.1±2.2) and birth weight (LSD – 5.4±0.3 g,
NSD – 5.5±0.3 g, and HSD – 5.5±0.4 g).
A lower (p<0.0001) weight gain was observed from birth until the 12th week of
age in the offspring from the high salt dams (HSDoff), both in males and in females –
figure 1. The weight gain rates of the male and female HSDoff from the day of birth
until weaning was lower (p<0.001) than in the other two groups. An opposite result was
observed between the 4th and the 6th week of age (p<0.001), and no differences were
present between the 7th and the 12th week of age – table 2.
Tail-cuff blood pressure was higher in male (p=0.0003) and female (p<0.0001)
HSDoff than in the other two groups from the 8th until the 12th week of age– figure 2.
However, tcBP was not different between groups when analyzed only at the 12th week
of age [males: LSDoff - 135±9 (n=18), NSDoff - 135±8 (n=21), HSDoff - 138±11
mmHg (n=9); females: LSD - 130±5 (n=18), NSD - 132±7 (n=19), HSD - 134±7 mmHg
(n=7)].
106
The degree of sodium intake during pregnancy and lactation apparently did not
affect (p>0.05) the renal blood flow of the offspring: [males: LSDoff - 5.2±0.6 (n=8),
NSDoff - 5.0±0.6 (n=7), HSDoff - 5.1±1.2 (n=7) ml.min-1.100g-1; females: LSDoff 4.9±0.7 (n=8), NSDoff - 5.3±0.9 (n=7), HSDoff - 5.0±1.2 (n=7) ml.min-1.100g-1].
Salt sensitivity of the blood pressure was lower in HSDoff, both in males and in
females. However, in the male offspring the differences in salt sensitivity between
groups did not reach statistical significance [male: LSDoff - 6.6±10.6, NSDoff 4.4±10.2, HSDoff - 1.3±8.1% (p>0.05); females: LSDoff - 4.3±6.5, NSDoff - 8.0±5.9,
HSDoff - 0.0±7.4% (p<0.05 HSDoff vs. NSDoff)]. PRA measured during the salt
sensitivity test is shown in figure 3 – panel A. PRA decreased, as expected, with salt
overload in the LSDoff and NSDoff (males plus females). Surprisingly, it did not occur
in the HSDoff, where PRA was not modulated by the degree of salt intake.
In figure 3 – panel B, the immunohistochemical studies showed that there is a
higher (p<0.05) angiotensin II presence in the kidneys of the offspring from HSD dams
compared to the other groups, both in males and in females. No histological structural
abnormalities were observed in the kidneys from the three groups.
Discussion
The present study showed that adult offspring of dams submitted to high salt diet
during pregnancy and lactation have higher blood pressure, lower body weight, and in
females, a lower salt sensitivity of blood pressure. These results indicate that salt
overload during pregnancy and lactation has long-term effects. In addition, a higher
presence of angiotensin II in the kidney tissue and an absence of modulation of the
107
renin-angiotensin system by changes in salt intake was also detected. The difference
between the blood pressure of the offspring from the salt overloaded dams and the other
two groups is only a few mmHg. However, it is known that a small decrease of blood
pressure in a population is possibly associated with a significantly lower incidence of
cardiovascular events (26). Studies from other laboratories disclosed conflicting results,
with some showing higher blood pressure in the offspring of dams on high salt diet (5)
and some showing no effect at all (20). One possible explanation for these opposite
results might be the degree of salt overload offered during gestation, and the duration of
that intervention. In the present study, dams were fed high, normal, or low salt diet from
weaning.
There is no reason to believe that the control of the diet offered to the LSD and
NSD groups until mating could have some deleterious effect on the dams development.
The difference in the body weight of the offspring from salt overload dams compared to
the other groups cannot be explained by differences in the weight at birth. We believe
that the lactation period, where the difference becomes apparent, is the most important
one. Although the degree of salt intake does not alter the sodium content of the milk (1),
the amount of milk given to the offspring or another substance present in the milk could
influence the offspring development.
Important functional alterations of the renin-angiotensin system were observed in
the offspring that were salt supplemented during the perinatal period. First, a period of
salt restriction in the adult offspring induced a normal response of the renin-angiotensin
system in the groups from the low and normal salt dams, with an expected increase in
plasma renin activity. However, in the group from the high salt dams, plasma renin
activity did not change between the weeks of salt overload and restriction. Second, a
108
higher presence of angiotensin II was verified in the kidneys from the offspring of the
high salt dams. It is highly suspicious that these alterations in the renin-angiotensin
system are due to kidney anatomical and/or functional changes induced during early life
by the high salt environment. To elucidate the mechanisms of these alterations,
additional studies are needed. However, it is conceivable that hormonal, neural,
metabolic, and/or hemodynamic factors in the dams may be responsible for the effects
of salt overload during the perinatal period on the adult offspring. Besides the higher
blood pressure during pregnancy and the decreased cholesterol levels observed before
pregnancy in the high salt dams reported here, other studies have shown that the
sympathetic nervous system (8), the renin-angiotensin system (8), insulin sensitivity (19,
24), plasma lipids (3, 25), the L-arginine nitric oxide pathway activity (4), etc. can be
influenced by the degree of salt intake. One or more of these factors may influence
kidney development during intra-uterine or early life period with consequences on the
function of the renal renin-angiotensin system. In addition, all the components of the
renin-angiotensin system are expressed in the developing kidney (15) and the actions
and the distribution of the AT1 and AT2 angiotensin II receptor subtypes are very
important in renal morphogenesis (23). It is conceivable that stimulation or inhibition of
the maternal renin-angiotensin system in response to changes in salt intake during
pregnancy and suckling periods may affect this system in the developing kidneys
leading to a permanent altered renal renin-angiotensin system function of the offspring.
Additional studies are needed to confirm or not this hypothesis. Therefore, the observed
alterations in salt sensitivity of the blood pressure and the higher blood pressure levels
in the offspring of salt overloaded dams can be a consequence of disturbances in the
pressure-natriureses mechanism induced by an inadequate function of the renal renin-
109
angiotensin system. An additional possible explanation for the lower SENS in the
offspring of the HSD dams may be that this is a homeostatic response to salt overload.
Lower SENS can be a protective mechanism to prevent increases in blood pressure in
the presence of high salt intake. Again, additional studies are needed to confirm or not
this hypothesis. In summary, adult offspring from dams that received a high salt diet
during pregnancy and lactation have higher blood pressure levels, decreased salt
sensitivity of the blood pressure, and lower body weight.
110
Acknowledgements
The Authors are grateful for the technical assistance of Luciana Faria de
Carvalho, who was responsible for the preparations of the kidneys for histological
evaluation.
111
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115
Figure 1. Body weight in 12-week-old male and female offspring from dams submitted
to chronic low (LSD), normal (NSD), or high (HSD) salt diet. Number of animals:
males – LSD=30, NSD=32, HSD=32; females - LSD=30, NSD=32, HSD=32.
Figure 2. Tail-cuff blood pressure (tcBP) in male (panel A) and female (panel B)
offspring of dams submitted to chronic low-LSD (
(
), normal-NSD (
), or high-HSD
) salt diet. Two-way anova: diet factor – p=0.0003 (males), p<0.0001 (females); time
factor – p=0.059 (males), p=0.1764 (females). Number of animals: males – LSD=18,
NSD=21, HSD=9; females - LSD=20, NSD=18, HSD=7.
Figure 3. Panel A: plasma renin activity in offspring of dams submitted to low (LSD –
n=5), normal (NSD – n=4) or high (HSD – n=6) salt diet, after one week on salt
restriction (open bars) and salt overload (closed bars) – * p<0.05 vs. salt restriction.
Panel B: positive glomeruli for immunohistochemistry for angiotensin II. Number of
animals: males – LSD=6, NSD=8, HSD=7; females - LSD=8, NSD=7, HSD=6.
116
Table 1: Maternal tail-cuff blood pressure before, during and after pregnancy (mmHg).
LSD (8)
NSD (9)
HSD (8) *
Week prior to mating
123 ± 7
125 ± 2
129 ± 5
1st week of gestation
119 ± 5
122 ± 3
127 ± 9
2nd week of gestation
117 ± 5
117 ± 8
122 ± 7
3rd week of gestation
112 ± 7
113 ± 4
120 ± 7
Week after delivery
117 ± 3
120 ± 4
128 ± 5
Data given as mean ± SD. Number of dams between parenthesis. LSD, NSD, and HSD:
dams submitted to low, normal, and high salt diet, respectively. * p<0.0001 (two-way
ANOVA - treatment effect) vs. LSD and NSD
117
Table 2: percentage daily weight increase of the offspring of dams submitted to chronic
low, normal, or high salt diet.
Age (weeks)
LSDoff (26)
NSDoff (29)
HSDoff (32)
0–3
40.0 ± 4.9
39.2 ± 5.1
30.0 ± 5.1 *
4–6
7.7 ± 1.2
7.3 ± 1.0
9.4 ± 2.1 *
7 – 12
2.0 ± 0.3
2.0 ± 0.5
1.9 ± 0.4
0–3
40.8 ± 6.9
40.0 ± 6.8
31.8 ± 6.6 *
4–6
6.0 ± 1.5
6.1 ± 1.6
7.9 ± 1.7 *
7 – 12
1.4 ± 0.4
1.3 ± 0.3
1.3 ± 0.3
Males
Females
Data given as mean ± SD. Number of animals between parenthesis. LSDoff, NSDoff,
and HSDoff: offspring from dams submitted to low, normal, and high salt diet,
respectively. * p<0.001 vs. LSDoff and NSDoff.
118
p<0.001
p<0.001
g (mean ± SD)
500
400
p<0.001
300
200
LSDm
NSDm
HSDm
Male offspring
LSDf
NSDf
Maternal diet
119
HSDf
Female offspring
A
(me an±SEM)
tcBP (mmHg)
145
140
135
130
125
7
8
9
10
11
12
11
12
Age (weeks)
B
(me an±SEM)
tcBP (mmHg)
140
135
130
125
120
7
8
9
10
Age (weeks)
120
A
mean ± SD
PRA (ngAI.mL-1 .h-1 )
15
10
*
5
*
0
LSD
LSD
NSD
NSD
HSD
HSD
Maternal diet
B
40
(mean ± SD)
% positivity
p<0.05
p<0.05
p<0.05
30
20
10
0
LSD
NSD
HSD
Male offspring
LSD
Maternal diet
121
NSD
HSD
Female offspring
ABBREVIATIONS
BP
=
Blood pressure
HSD
=
High salt diet
HSDoff
=
Offspring of dams on HSD
LSD
=
Low salt diet
LSDoff
=
Offspring of dams on LSD
NSD
=
Normal salt diet
NSDoff
=
Offspring of dams on NSD
PRA
=
Plasma renin activity
SD
=
Standard deviation
SEM
=
Standard error of the mean
SENS
=
Salt sensitivity of the blood pressure
SHR
=
Spontaneously hypertensive rat
tcBP
=
Tail-cuff blood pressure
122