Prof. Adriane Martins Dias
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Muitas técnicas de laboratório baseiam-se no
uso de anticorpos.
O método laboratorial que utiliza anticorpos
têm grande importância por ser possível
produzir anticorpos contra qualquer tipo de
molécula e composto químico.
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Principais técnicas que utilizam anticorpos
para identificação clínica:
A) Imunoensaios
◦ Radioimunoensaios e Ensaio de imunoabsorção por
Ligação Enzimática.
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B)Purificação e Identificação de Proteínas
◦ Imunoprecipitação e Cromatografia por afinidade.
◦ Western Blot
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C) Marcação e Detecção de Antígenos em
células/tecido
◦ Citometria de Fluxo
◦ Imunoflorescência e Imuno-histoquímica
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D) Medição de Interação Antígeno/Anticorpo
E) Técnicas que fazem análise da estrutura e
da expressão gênica.
◦ PCR
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Imunofluorescência:
Primeira
técnica
utilizada
foi
a
Imunofluorescência Direta. Nesta técnica se
pesquisa um antígeno em uma reação com
anticorpo preparado com fluorocromo.
São
utilizados
anticorpos
purificados
específicos para um determinado antígeno ou
grupo de antígenos conjugados com um
fluorocromo.
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Imunofluorescência Direta
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É chamada de técnica de camada simples.
Imunofluorescência Indireta (dupla camada):
Antígenos são fixados em uma lâmina, onde
se aplica primeiro um anticorpo específico
não fluorescente e por isso coloca-se um
anticorpo fluorescente com especificidade
marcada contra determinantes antigênicos do
primeiro anticorpo utilizado para reagir com
o antígeno.
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Nesta técnica pode-se trabalhar com vários
anticorpos primários para diferentes tipos de
antígenos.
Nesta técnica o antígeno fica entre dois
anticorpos.
Técnica é aplicada para estudar tecidos
linfoides e descobrir que tipo de anticorpos
está sendo produzido.
Imunofluorescência Indireta
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Imunoenzimático: ELISA
Se baseia na identificação de anticorpos e ou
antígenos, por anticorpos marcados com uma
enzima. Essa enzima irá agir sobre um
substrato e a reação faz com que o
cromógeno mude de cor.
Produto da reação, além de colorido, é
insolúvel para não difundir no local da
formação.
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) –
Ensaio de Imunoabsorção ligado a enzima)
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Reação é desenvolvida, frequentemente, em
microplacas contendo vários poços onde são
depositados os reagentes.
Método Direto ou Sanduiche
Usado para identificação de antígenos, e esse
antígeno fica entre dois anticorpos.
O anticorpo de um antígeno particular é
inicialmente adsorvido a placa.
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Posteriormente o antígeno (soro, urina ou
solução contendo o antígeno), é adicionado, e
se liga ao anticorpo.
Seguidamente um segundo e diferente
anticorpo ligado a enzima é adicionado.
A intensidade da reação é proporcional a
quantidade de antígeno presente, permitindo
se mensurar até pequenas quantidades de
antígeno.
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ELISA (Método Indireto) – Utilizado para
detecção de anticorpos.
O antígeno fica aderido aos poços da
microplaca.
Em seguida, coloca-se o soro problema e
posteriormente um anticorpo marcado com
uma enzima que reage com o substrato
fazendo com que o cromógeno mude de cor.
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A presença de cor nos poços indica a
presença do anticorpo, e os poços que não
mudarem de cor confirma a ausência do
anticorpo em questão.
Enzimas:
São elas que convertem um substrato sem
cor em um produto de cor.
Enzima mais utilizada é a peroxidase, que
catalisa a reação de desdobramento de H2O2
em H2O mais O2.
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Interpretação dos resultados:
A intensidade da cor desenvolvida pelo
substrato é proporcional a quantidade de
anticorpos (específicos para o antígeno)
presentes no soro.
A intensidade pode ser analisada por um
espectrofotômetro
(Leitor
de
Elisa)
permitindo uma análise quantitativa.
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ELISA ( Método Indireto)
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ELISA
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Radioimunoensaio:
Pequenas quantidades de anticorpos ou
antígenos podem ser detectadas depois de
marcadas com isótopos radioativos.
É uma reação de imunológica onde temos um
aumento da especificidade.
Não ocorre perda de características físicas,
químicas
e
biológicas
das
moléculas
marcadas com os compostos radioativos.
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Citometria de Fluxo:
É uma técnica que tem como particularidade
a
análise
rápida,
quantitativa
e
multiparamétrica de uma célula individual
(viva ou morta), entre diversas células de uma
população.
É frequentemente empregado para investigar
a
expressão
de
certas
moléculas
intracelulares ou moléculas de membrana.
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São utilizados anticorpos marcados com
fluorocromo e a análise dos parâmetros é
mensurada por meio da intensidade de
fluorescência
produzida
por
esses
marcadores.
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Citômetro