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Método de Ensaio – MET
Determinação de histamina em pescados por eletroforese capilar de zona
1 Escopo
Este método tem por objetivo determinar a concentração de histamina em amostras de pescado,
utilizando eletroforese capilar de zona (ECZ).
2 Fundamentos
A histamina é uma amina biogênica formada pela descarboxilação microbiana do aminoácido
histidina, presente no músculo do peixe. As aminas biogênicas são compostos não voláteis,
normalmente presentes em baixas concentrações nos alimentos proteicos, mas que podem ser
progressivamente produzidas e acumuladas durante o armazenamento desses alimentos.
O presente método baseia-se na extração da histamina e sua determinação por eletroforese
capilar de zona, com tempo de separação do analito inferior a um minuto, simples preparo de
amostra e mínima geração de resíduos e consumo de reagentes.
Os limites de detecção (LOD) e quantificação (LOQ), limite de decisão (CCα) e a capacidade de
detecção (CCβ), definidos em procedimentos de validação intralaboratorial, bem como o limite
máximo de resíduo (LMR), estão listados na tabela 1.
Tabela 1. Limites de detecção (LOD), limite de quantificação (LOQ), limite máximo de resíduo (LMR) e
valores de limite de decisão (CCα) e capacidade de detecção (CCβ) definidos em validação
intralaboratorial do método “Determinação de histamina em pescados por eletroforese capilar de zona”.
LMR
LOD
LOQ
CCα
α
CCβ
β
(mg.kg-1)
(mg.kg-1)
(mg.kg-1)
(mg.kg-1)
(mg.kg-1)
Histamina
100,0
15,0
25,0
118,8
137,7
3 Reagentes, padrões e materiais
Todos os reagentes são de grau analítico (p.a.), exceto quando especificado. Toda a água
utilizada nos procedimentos deve ser de grau ultra-puro.
3.1 Reagentes
Hidróxido de sódio (NaOH) p.a.;
Metanol (MeOH) grau HPLC.
3.2 Padrões
Ácido α-hidroxi-isobutírico (HIBA);
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Histamina;
Metil-imidazol (padrão interno).
3.3 Materiais
- Estantes para tubos tipo “falcon”;
- Micropipetas e ponteiras para faixas de volume de 20-200 µL e de 100-1000 µL;
- Pipetador de repetição ou similar;
- Tubos tipo “falcon” de 15 e 50 mL;
- Vials para eletroforese capilar.
4 Equipamentos
- Agitador orbital;
- Balança analítica, com precisão mínima de quatro casas decimais;
- Centrifuga de tubos com refrigeração;
- Processador de alimentos;
- Sistema de eletroforese capilar;
- Triturador;
- Ultra-turrax.
5 Precauções analíticas
Este método emprega substâncias químicas nocivas e procedimentos que podem representar
risco ao operador. Todos os procedimentos devem ser realizados com uso de equipamentos de
proteção individual e uniforme apropriado. O preparo das soluções reagentes deve ser feito em
capela de exaustão. Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco
biológico, evitando-se o contato direto com pele e mucosas.
6 Procedimentos
Todos os procedimentos devem ser registrados no formulário “Dados brutos”, anexo A do POP
POA/SLAV/15.
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6.1 Preparo de soluções
6.1.1 Solução de hidróxido de sódio 1,0 mol.L-1
Pesar 4,0 g de NaOH em um balão volumétrico de 100 mL e diluir em água ultra-pura, em
quantidade suficiente para (q.s.p.) preparar 100 mL de solução. Identificar e conservar em
temperatura ambiente, em frasco de plástico.
6.1.2 Solução de hidróxido de sódio 100 mmol.L-1
Pesar 0,515 g de NaOH em um balão volumétrico de 100 mL, diluir em água ultra-pura, em
q.s.p. preparar 100 mL de solução. Identificar e conservar em temperatura ambiente.
6.1.3 Solução de ácido α-hidroxi-isobutírico (HIBA) 100 mmol.L-1
Pesar 1,041 g de HIBA em um balão volumétrico de 100 mL e diluir em água ultra-pura, em
q.s.p. preparar 100 mL de solução. Identificar e conservar sob refrigeração.
6.1.4 Eletrólito de corrida
No momento do uso, tomar uma alíquota de 1500 µL de HIBA de uma solução-estoque de HIBA
100 mmol.L-1, 250 µL de uma solução-estoque de 100 mmol.L-1 de NaOH, 500 µL de MeOH e
250 µL de água ultra-pura, obtendo-se assim a solução tampão de uso diário.
6.1.5 Solução-padrão de metil-imidazol 10000 ppm
Pesar 100,0 mg de padrão de metil-imidazol em um balão volumétrico de 10 mL, diluir em água
ultra-pura, em q.s.p. preparar 10 mL de solução. Identificar e conservar sob refrigeração.
6.1.6 Solução-padrão de metil-imidazol 1000 ppm
Pesar 10,0 mg de padrão de metil-imidazol em um balão volumétrico de 10 mL, diluir em água
ultra-pura, em q.s.p. preparar 10 mL de solução. Identificar e conservar sob refrigeração.
6.1.7 Solução-padrão de histamina 1000 ppm
Pesar 10,0 mg de padrão de histamina em um balão volumétrico de 10 mL, diluir em MeOH, em
q.s.p. preparar 10mL de solução. Identificar e conservar sob refrigeração.
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6.1.8 Solução-padrão de histamina 10000 ppm
Pesar 100,0 mg de padrão de histamina em um balão volumétrico de 10 mL, diluir em MeOH,
em q.s.p. preparar 10 mL de solução. Identificar e conservar sob refrigeração.
6.2 Preparo do branco de análise
Amostras previamente analisadas, isentas de histamina, serão selecionadas como amostras
brancas. Pesar 2,0 ± 0,1 g da amostra branca em quatro tubos tipo “falcon”. Reservar um tubo
para o “branco de análise” e três tubos para a preparação do tissue standard. Proceder à
extração.
6.3 Preparo da curva de calibração
Pesar 2,0 ± 0,1 g de amostra branca em tubos tipo “falcon” de 50 mL, adicionar os volumes de
solução-estoque de histamina e metil-imidazol (padrão interno), conforme tabela 2. Submeter à
extração.
Tabela 2. Volumes (em µL) de solução-estoque de histamina e do padrão interno (metil-imidazol) para
preparo da curva de calibração para determinação de histamina em pescados por eletroforese capilar de
zona.
Volume de
Volume de
Concentração
solução-estoque
solução-estoque de
Ponto
-1
(mg.kg )
de histamina (µ
µL)
metil-imidazol 10000 ppm (µ
µL)
Branco
0
0
0
C0
C25
C50
C100
C150
C200
0
25
50
100
150
200
0
50 (1000 ppm)
100 (1000 ppm)
20 (10000 ppm)
30 (10000 ppm)
40 (10000 ppm)
40
40
40
40
40
40
6.4 Controle de recuperação (matriz branca fortificada - MBF)
Preparar três amostras brancas adicionando os volumes de solução-estoque de histamina e
metil-imidazol (padrão interno), conforme tabela 2 (ponto C100) e submeter à extração.
6.5 Tissue standard (TS) ou extrato de matriz branca fortificada (EMBF)
Reservar três amostras brancas e seguir a extração sem adição de nenhum padrão. Após a
extração (item 6.6), transferir 200 µL de sobrenadante dos três tubos de “branco de análise”
reservados como tissue standard para vials, adicionar 200 µL de uma solução-estoque (20 µL
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de uma solução-estoque de histamina de 1000 ppm; 40 µL de uma solução-estoque de metilimidazol 1000 ppm e 940 µL de água ultra-pura). Adicionar 200 µL de água ultra-pura e
homogeneizar.
6.6 Extração
•
Fortificam-se as amostras com as soluções apropriadas.
•
Adicionar 10 mL de MeOH em cada tubo, homogeneizar amostras e solvente usando o
ultra-turrax, lavando cuidadosamente a haste entre uma amostra e outra, com passagem
da haste por água e metanol.
•
Agitar em agitador orbital por 10 minutos.
•
Centrifugar por 10 minutos a 4ºC a 4000 rpm.
•
Adicionar ao vial 400 µL de água ultra-pura.
•
Transferir 200 µL de sobrenadante do pescado in natura ou 50 µL do pescado enlatado
para o vial; evitar a aspiração de películas e resíduos aderidos ao tubo.
•
Homogeneizar as amostras.
6.7 Condições instrumentais
As amostras são analisadas em sistema de eletroforese capilar sob as condições especificadas
na tabela 3.
Tabela 3. Condições instrumentais para determinação de histamina em pescado por eletroforese capilar
de zona.
Sistema de eletroforese capilar
Sistema automático, com detector de arranjo de diodos e
controlador de temperatura.
Operado por software de controle e aquisição de dados.
Capilar
32 cm (Ltot) x 23,5 cm (Ldet) x 75 µm
210 nm
Comprimento de onda (λ)
Injeção amostra
50 mbar/ 5s
Voltagem separação
30 kV
Temperatura
25°C
Condicionamento capilar
15 min NaOH / 15 min H2O / 15 min eletrólito
Pré-condicionamento
30 s H2O / 40 s eletrólito
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7 Resultados
7.1 Cálculos e expressão dos resultados
A concentração do analito nas amostras é calculada conforme a seguinte equação, obtida pela
injeção da curva de calibração:
Onde:
y = concentração do analito em mg.kg-1;
x = razão da área do histamina/metil-imidazol;
a = coeficiente angular;
b = coeficiente linear.
Amostras com áreas inferiores ao limite de quantificação do método, não são quantificadas e
seus resultados são expressos como “N.Q.” (não quantificáveis). Já as amostras com picos de
áreas maiores que o limite de quantificação do método, são quantificadas e os resultados
expressos em mg.kg-1.
Amostras que apresentem resultados superiores a 118,8 mg.kg-1 (CCα) deverão ser
reanalisadas em triplicata e, nesses casos, o resultado é a média aritmética das concentrações
encontradas.
7.2 Cálculo da recuperação
O fator de recuperação (frec) é calculado pela seguinte equação:
Recuperação (
Onde:
MBF = concentração da matriz branca fortificada no LMR;
EMBF = concentração do extrato da matriz branca fortificada no LMR;
7.3 Aceitabilidade dos resultados
Os resultados são aceitos quando o coeficiente de correlação (r) da curva de calibração é
≥ 0,95. Caso contrário, a curva deve ser repetida.
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A faixa de aceitação do recuperado é de -20 a +10%.
8 Arquivamento dos registros
Os formulários de dados brutos serão arquivados conforme descrito no POA POA/SLAV/15
“Procedimentos de rotina na análise físico-química de produtos de origem animal”. Os
eletroferogramas gerados serão mantidos protegidos na pasta eletrônica “Resultados” da
unidade. Os eletroferogramas das amostras que violarem o limite regulatório são impressos e
arquivados junto do formulário de dados brutos correspondente.
9 Referências
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n°185, de 13
de maio de 1987 Aprova o regulamento técnico de identidade e qualidade de peixe fresco
(inteiro e eviscerado). Brasília: 1987.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa n°25, de 2 de
junho de 2011. Aprova os Métodos oficiais físico-químicos para controle de pescado e
seus derivados. Brasília: 2011.
VITALI, L. et al. Development of a fast and selective separation method to determine histamine
in tuna fish samples using capillary zone electrophoresis. Talanta, n. 106, p.181-185, 2012.
10 Anexos
Não aplicável.
11 Alterações
Item 6: registro de procedimentos alterado de “Dados brutos – Determinação de histamina em
pescados por eletroforese capilar de zona” para ““Dados brutos” do POP POA/SLAV/15 (Anexo
A)”;
Item 6.2 excluído “Preparo das amostras de pescado. O ensaio de histamina requer um lote
composto de nove unidades embaladas separadamente, em quantidade igual ou superior a 500
g por unidade para pescado in natura e nove unidades (latas) de um mesmo lote para pescado
enlatado. Cada unidade deverá ser analisada individualmente.”
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Item 6.2.1 excluído “Pescado in natura. Deixar a amostra atingir aproximadamente 10ºC,
somente o tempo necessário até adquirir consistência de corte. Retirar as aponeuroses,
gorduras e ossos. Retirar porções da musculatura de várias regiões do pescado e cortar a
amostras em pedaços menores para processar e homogeneizar em triturador. Pesar 2,0 ± 0,1 g
de amostra em tubos tipo “falcon” de 50 mL e submeter à extração. “
Item 6.2.2 excluído “Pescado enlatado. Triturar e homogeneizar todo o conteúdo da lata (líquido
+ parte sólida) em triturador. Pesar 2,0 ± 0,1 g de amostra em tubos tipo “falcon” de 50 mL e
submeter à extração.”
Item 6.2 incluído “Preparo do”;
Item 6.5: substituída a quantidade de solução-estoque de histamina de “10 µL” por “20 µL” e
ajustado o novo volume de água ultrapura adicionado de “950 µL” para “940 µL”;
Item 7.1: excluído “duplicata”, incluído “triplicata”;
Item 8: excluído “são arquivados na pasta “Dados brutos””, incluído “serão arquivados
conforme descrito no POA POA/SLAV/15 - Procedimentos de rotina na análise físico-química de
produtos de origem animal. ”
Anexo A: excluído
Não há necessidade de complemento de relatório de confirmação de desempenho em
função das alterações realizadas.
12 Responsabilidades
O Responsável pelo POA/SLAV deve garantir a elaboração, aprovação, emissão, distribuição de
cópias, implementação, treinamento do pessoal para utilização, capacitação de analistas,
gerenciamento de não conformidades, análise crítica e revisão deste MET.
A UGQ é responsável pela verificação deste MET.
Elaboração/Revisão:
Ana Paula Melo – POA/SLAV
Andressa C. Valese – POA/SLAV
Data: 07/07/2014
Aprovação:
Verificação:
Cristhiane Cattani – POA/SLAV
Rosane Carlessi – UGQ
Data: 08/07/2014
Data: 09/07/2014