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Método de Ensaio – MET
Detecção de β-lactoglobulina em queijos por eletroforese em gel de
poliacrilamida
1 Escopo
O presente método tem por finalidade avaliar a presença da proteína β-lactoglobulina em
amostras de queijos (Minas Frescal, Mussarela e Prato), utilizando a técnica de eletroforese
em gel de poliacrilamida.
2 Fundamentos
Neste método, é utilizada a acrilamida, que através de co-polimerização com a bisacrilamida e na presença de catalisadores de polimerização como o persulfato de amônio e o
N,N,N’,N’-tetrametiletilenodiamina (TEMED), forma gel, meio no qual ocorre a separação das
proteínas.
O sistema descontínuo utilizado consiste de dois géis, o gel de separação e o gel de
empilhamento. Enquanto no gel de empilhamento as moléculas de proteínas concentram-se
numa banda estreita e compacta, no gel de separação elas se separam de acordo com as
respectivas massas moleculares.
As condições desnaturantes, através da utilização de dodecil-sulfato de sódio (SDS) e
de 2-mercaptoetanol (2-ME), facilitam a solubilização e auxiliam na separação das proteínas.
O SDS se liga às moléculas de proteínas, gerando um aumento de cargas negativas,
tornando-as praticamente indistinguíveis do ponto de vista de carga. O 2-ME age no
rompimento das pontes dissulfeto das proteínas e facilita o acesso do SDS. Dessa forma, há
uma normalização das cargas e das formas das proteínas que o elemento de distinção entre
essas passa a ser as suas massas moleculares. Na eletroforese, uma maior distância de
migração é observada para as proteínas com menor massa molecular, e vice versa.
A β-lactoglobulina (β-LG) é uma proteína do soro de leite com massa molecular de
aproximadamente 18 kDa. A presença da banda de β-LG nos perfis eletroforéticos de
amostras de queijo Minas Frescal, Mussarela e Prato, identificada por comparação da sua
mobilidade eletroforética com padrão de β-LG, é um marcador de adulteração, indicando a
utilização de soro de leite na elaboração desses produtos lácteos.
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3 Reagentes, padrões e materiais
Todos os reagentes são de grau analítico, exceto quando especificado. A água utilizada nos
procedimentos deve ser de grau ultrapuro e recém-obtida.
3.1 Reagentes
- 2-mercaptoetanol;
- Ácido acético;
- Ácido clorídrico (HCl) 6 M;
- Acrilamida;
- Azul de bromofenol;
- Azul de Coomassie R-250;
- Bis-acrilamida;
- Glicerol;
- Glicina;
- Metanol;
- Persulfato de amônio;
- SDS (dodecil-sulfato de sódio);
- TEMED (N,N,N´,N´-tetrametiletilenodiamina);
- Tris base (hidroximetil) aminometano.
3.2 Materiais
- Becker com capacidade de 100 mL;
- Funil;
- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 5 a 50 µL;
- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 20 a 200 µL;
- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 100 a 1000 µL;
- Micropipeta e ponteiras para faixa de volume de 100 a 5000 µL;
- Microtubos com capacidade de 1,5 mL;
- Papel de filtração qualitativa;
- Proveta com capacidade de 100 mL;
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- Proveta com capacidade de 1 L;
- Tubo tipo falcon com capacidade de 15 e 50 mL;
- Vasilha plástica para a coloração dos géis.
4 Equipamentos
- Agitador orbital;
- Balança analítica;
- Balança semi-analítica;
- Banho-maria;
- Conjunto para corrida eletroforética (composto de: placas de vidro internas e externas;
borrachas de vedação; pentes espaçadores; cuba de eletroforese com tampa; módulo de
preparo dos géis; separador para aplicação das amostras);
- Fonte de energia para eletroforese;
- Liofilizador;
- Potenciômetro.
5 Precauções analíticas
Este método emprega substâncias químicas nocivas e procedimentos que podem
representar risco ao operador. Equipamentos de proteção individual apropriados à condução
da análise devem ser utilizados durante todo o processo.
Solventes orgânicos devem ser manipulados em ambientes com exaustão adequada.
Inalação ou ingestão de acrilamida pode causar danos ao sistema nervoso central e
periférico.
Amostras de alimentos em geral devem ser consideradas como de risco biológico,
evitando-se o contato direto com pele e mucosas.
6 Procedimentos
Todos os procedimentos analíticos devem ser registrados no formulário “Dados brutos
– Detecção de β-LG em queijos por eletroforese em gel de poliacrilamida” (Anexo A).
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6.1 Preparo de soluções estoque e tampões
6.1.1 Ácido clorídrico 6 M
Transferir para um balão volumétrico de 100 mL aproximadamente 40 mL de água. Transferir
cuidadosamente 50 mL de ácido clorídrico, sob exaustão e com o auxílio de uma pipeta
volumétrica, para o balão e completar o volume com água. Homogeneizar.
6.1.2 Acrilamida/Bis-acrilamida (30% T, 2,67% C)
Dissolver 29,2 g de acrilamida e 0,8 g de bis-acrilamida em 100 mL de água. Filtrar e
armazenar sob refrigeração e ao abrigo da luz (validade: 30 dias).
Alternativamente, utilizar solução de acrilamida/bis-acrilamida, mistura de 37,5:1 (30% T,
2,67% C) (Bio-Rad, catálogo: 161-0158, 500 mL).
6.1.3 Dodecil-sulfato de sódio (SDS) 10% (m/v)
Dissolver 10 g de SDS para balão volumétrico de 100 mL em água. Completar o volume e
armazenar em temperatura ambiente.
6.1.4 Tampão Tris-HCl 1,5M, pH 8,8
Pesar 27,23 g de Tris base (18,15 g/100 mL) e dissolver em 80 mL de água. Ajustar o pH para
8,8 com HCl 6 M. Completar o volume para 150 mL e armazenar sob refrigeração.
6.1.5 Tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8
Pesar 6 g de Tris base e dissolver em 60 mL de água. Ajustar o pH para 6,8 com HCl 6 M.
Completar o volume para 100 mL e armazenar sob refrigeração.
6.1.6 Tampão de amostra (tampão redutor SDS)
Preparar o tampão de amostra com a mistura dos seguintes reagentes:
•
Água deionizada: 3,8 mL;
•
Tampão Tris HCl 0,5 M, pH 6,8: 1,0 mL;
•
Glicerol: 0,8 mL;
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•
SDS 10% (m/v): 1,6 mL;
•
Azul de bromofenol 0,5% (m/v): 0,4 mL.
Homogeneizar e armazenar em temperatura ambiente.
Adicionar 50 µL de 2-mercaptoetanol para 950 µL de tampão de amostra para cada amostra.
A adição de 2-mercaptoetanol deve ser feita somente antes do uso.
6.1.7 Tampão para corrida (10x), pH 8,3
Preparar o tampão para corrida com a mistura dos seguintes reagentes:
•
Tris base: 30,3 g;
•
Glicina: 144 g;
•
SDS: 10 g.
Dissolver e avolumar para 1000 mL com água. Não ajustar o pH com ácido ou base.
Armazenar sob refrigeração. Em caso de precipitação, deixar à temperatura ambiente antes
do uso.
Diluir 50 mL do tampão com 450 mL de água para cada corrida com dois géis e 100 mL de
solução estoque para 900 mL de água para corrida com quatro géis.
6.1.8 Persulfato de amônio (APS) 10% (m/v)
Pesar 100 mg de APS e dissolver em 1 mL de água. Preparar somente antes do uso.
Alternativamente, alíquotas da solução de APS 10% podem ser armazenadas sob
congelamento.
6.1.9 Solução corante de Azul de Coomassie R-250 0,3% (m/v) em 40% de metanol e
10% de ácido acético
Pesar 0,3 g de corante Azul de Coomassie R-250 e dissolver em 40 mL de metanol. Após
completar dissolução, filtrar em papel de filtro e misturar com 10 mL de ácido acético e água
q.s.p. para 100 mL. Armazenar em frasco âmbar à temperatura ambiente.
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6.1.10 Solução fixadora (descorante) 40% de metanol e 10% de ácido acético
Misturar 40 mL de metanol com 10 mL de ácido acético e água q.s.p. para 100 mL.
Armazenar em frasco âmbar à temperatura ambiente.
6.1.11 Solução padrão de β-LG 0,5 mg/mL
Pesar 10 mg do padrão de β-LG e dissolver em 20 mL de solução tampão de amostra
adicionada de 2-mercaptoetanol.
6.2 Formulações dos géis
6.2.1 Preparo do gel de separação com 15% de poliacrilamida (10 mL = 2 géis):
•
2,4 mL de água deionizada;
•
5,0 mL de acrilamida/bisacrilamida 30%;
•
2,5 mL de tampão Tris-HCl 1,5 M, pH 8,8;
•
0,1 mL SDS 10% (m/v).
Homogeneizar e adicionar, para cada 10 mL de solução e imediatamente antes de colocar o
gel entre as placas:
•
50 µL de APS 10% + 5 µL de TEMED
6.2.2 Preparo do gel de empilhamento com 4% de poliacrilamida (10 mL = 2 géis):
• 6,1 mL de água deionizada;
• 1,3 mL de acrilamida/bisacrilamida 30%;
• 2,5 mL de tampão Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8;
• 0,1 mL SDS 10% (m/v).
Homogeneizar e adicionar, para cada 10 mL de solução e imediatamente antes de colocar o
gel entre as placas:
•
50 µL de APS 10% + 10 µL de TEMED
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6.3 Preparo das amostras
As amostras de queijo devem ser trituradas manualmente, congeladas e liofilizadas antes da
análise.
O preparo das amostras para serem aplicadas nos géis inclui as seguintes etapas:
- Pesar 10 mg da amostra liofilizada;
- Adicionar 2,5 mL de tampão de amostra (2,375 mL de tampão de amostra e 125 µL de 2ME. Essa mistura deve ser feita imediatamente antes do uso);
- Agitar em agitador orbital por aproximadamente uma hora até completa solubilização da
amostra;
- Aquecer a 95°C por 5 minutos em banho-maria.
6.3.1 Fortificação da amostra branca com β-LG na concentração correspondente ao
nível de ação (0,1 mg/mL)
- Pesagem de 10 mg de uma amostra branca liofilizada;
- Adição de 2,0 mL de tampão de amostra (1,9 mL de tampão e 100 µL de 2-ME. Essa
mistura deve ser feita imediatamente antes do uso);
- Adição de 500 µL de solução de β-LG padrão (0,5 mg/mL);
- Agitação em agitador orbital por aproximadamente uma hora até completa solubilização da
amostra;
- Aquecimento a 95°C por 5 minutos em banho-maria;
- Adição de uma alíquota de 5 µL no gel.
6.4 Aplicação das amostras no gel
Em cada gel deve ser aplicado:
- Amostra branca de queijo (5 µL);
- Amostra branca de queijo fortificada com β-LG na concentração correspondente ao nível de
ação (0,1 mg/mL) (5 µL);
- Amostras de análise de rotina (máximo de seis por gel) (5 µL).
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6.5 Corrida eletroforética
•
Após a montagem do sistema de eletroforese (conforme IU POA/SLAV/40/01), introduzir
o módulo com as placas na cuba e preenchê-lo com o tampão de amostra.
•
Verificar se não há vazamento do tampão do módulo.
•
Proceder à injeção das amostras nos poços.
•
Preencher a cuba com o restante do tampão de amostra até o volume indicado (para dois
ou quatro géis).
•
Acoplar a tampa da cuba e conectar à fonte de energia.
•
Programar a fonte para 200 V (conforme IU POA/SLAV/43/01).
•
Encerrar a corrida antes que a linha de migração do corante azul de bromofenol
ultrapasse 1 cm do limite inferior do gel (entre 30 a 45 minutos).
6.6 Coloração dos géis
•
Retirar cuidadosamente os géis das placas e colocá-los em contato com a solução
corante.
•
Manter os géis no corante sob agitação lenta durante a noite.
6.7 Descoloração dos géis
•
Remover a solução corante.
•
Lavar os géis com água para a retirada do excesso de corante.
•
Mergulhar os géis na solução fixadora (descorante) e submetê-los à agitação lenta.
•
Efetuar a troca da solução de descorante até remoção do corante e aparecimento das
bandas.
6.8 Recuperação da solução descorante
A solução descorante usada pode ser recuperada pela filtração da mesma com carvão
ativado até total limpidez.
6.9 Armazenamento dos géis
O armazenamento dos géis pode ser feito em solução de ácido acético 7%.
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6.10 Digitalização e densitometria dos géis
Digitalizar os géis no Densitômetro de imagem (Bio Rad – GS 800) e através do software
Quantity-one® (conforme IU POA/SLAV/41/01) obter a densidade das bandas de β-LG das
amostras analisadas, da amostra branca de queijo e da amostra branca de queijo adicionada
de padrão de β-LG na concentração correspondente ao nível de ação.
7 Resultados
Os valores da densidade das bandas de β-LG obtidos na densitometria dos géis das amostras
analisadas devem ser comparados com o valor da densidade obtido da amostra branca
adicionada de padrão de β-LG na concentração correspondente ao nível de ação (0,1
mg/mL).
Os resultados serão reportados quanto à presença ou ausência da proteína β-LG, sendo
emitido resultado positivo ou negativo, respectivamente.
Para o resultado ser considerado negativo (ausência da proteína β-LG na amostra), o valor
da densidade da banda de β-LG da amostra analisada deve ser menor ao apresentado pela
amostra branca adicionada de padrão na concentração correspondente a 0,1 mg/mL,
conforme exemplo apresentado na Figura 1a para queijo Minas Frescal, 2 para queijo
Mussarela e para queijo Prato 3.
Para o resultado ser considerado positivo, o valor da densidade da banda de β-LG da
amostra analisada deve ser maior ao apresentado pela amostra branca adicionada de padrão
na concentração correspondente a 0,1 mg/mL, conforme exemplo apresentado na Figura 1b
para queijo Minas Frescal.
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Figura 1. Avaliação qualitativa de amostras comerciais de queijo Minas Frescal quanto à
presença de β-LG. (a) Exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado negativo.
(b) Exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado positivo.
Amostra branca
(a)
(b) Amostra branca
adicionada de
β-LG no nível Amostra
de ação
branca
Amostras
negativas
adicionada de βLG no nível de Amostra
branca
ação
Amostras
positivas
Figura 2. Avaliação qualitativa de amostras comerciais de queijo Mussarela quanto à
presença de β-LG e exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado negativo.
Amostra branca
adicionada de
β-LG no nível Amostra
de ação
branca
Amostras
negativas
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Figura 3. Avaliação qualitativa de amostras comerciais de queijo Prato quanto à presença de
β-LG. Exemplo de amostras comerciais que apresentaram resultado negativo.
Amostra branca
adicionada de βLG no nível de
Amostra
ação
branca
Amostras
negativas
8 Arquivamento dos registros
Os formulários de dados brutos são arquivados na pasta “Dados brutos” do POA/SLAV e as
imagens digitalizadas dos géis deverão ser impressas no formulário correspondente (Anexo
A) .
9 Referências
FARRELL, JR., H.M., JIMENEZ-FLORES, R., BLECK, G.T., BROWN, E.M., BUTLER, J.E. et
al. Nomenclature of the proteins of the cows’ milk – sixth revision. Journal of Dairy Science,
v.87, p.1641-1674, 2004.
LAEMMLI, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680–685.
10 Anexos
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Anexo A MET POA/SLAV/30/01 Formulário “Dados brutos – Detecção de β-lactoglobulina em
queijos por eletroforese em gel de poliacrilamida”.
11 Alterações
Mudança no título: Detecção de β-lactoglobulina em queijo Minas Frescal por eletroforese em
gel de poliacrilamida por Detecção de β-lactoglobulina em queijos por eletroforese em gel de
poliacrilamida.
Inclusão dos queijos Mussarela e Prato no escopo do método.
Inclusão das Figuras 2 e 3 referentes à avaliação qualitativa de amostras comerciais de
queijo. Mussarela e Prato quanto à presença de β-LG, respectivamente.
Anexo A: acrescentados campos para as amostras 9 e 10.
12 Responsabilidades
O Responsável pelo POA/SLAV deve garantir a elaboração, aprovação, emissão, distribuição
de cópias, implementação, capacitação do pessoal para utilização, gerenciamento de não
conformidades, análise crítica e revisão deste MET.
O Responsável pelo POA/SLAV é responsável pela aprovação técnica deste MET.
A UGQ é responsável pela verificação deste MET.
Elaboração/Revisão:
Aprovação:
Verificação:
Renata B. Magenis – POA/SLAV
Heitor Daguer – POA/SLAV
Angélica P. Wielewicki – UGQ
Data: 25/02/2014
Data: 25/02/2014
Data: 27/02/2014