Uma abordagem para trimagem,
verificação de contaminação e
clusterização de seqüências EST
Candidato: Christian Baudet
Orientador: Zanoni Dias
Tópicos da Apresentação






Motivação
Trimagem
Verificação de contaminação
Clusterização
Proposta
Cronograma
Motivação




Importância dos projetos de
seqüenciamento
Projetos EST no Brasil
Ausência de metodologia padrão
utilizada pelos diferentes projetos
Possibilidade de identificação de
melhorias a serem feitas nos processos
existentes
Trimagem


Seqüências EST possuem altas taxas de
erros
Remoção de regiões de:




baixa qualidade
vetores
adaptadores
trechos de baixa complexidade
Seqüência de bases
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
NCTGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCTGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAAAATGGGTGAAGGAACCTTCGGGCAGGT
TTTGGAATGCTGGGATCGTGAGAGGAGAGAAATGGGACGCNTTAGAGTTGGGCGGGGGAT
CCACAAATGTCGGGCCGCTGCTGGGGTGGACAGTGGGGCGCGTGGCGAAGGGGGAGGGGG
GGGGGAGGGGGGGGGGGCCGCGCCGCGGCGGGGCGCGGGCCGCATACGCGGGGAGGGGGG
GGGGAGGCGGGGGGCGGGGGGGCGGGCGGGGCCGGAGAGGGAGCGGACGGGGGGGGGGCG
CGGGGCGGCGGGGGGCGGGGCGGTAGCGGGGGGGGGGAGGGGGGCCGCGCGGGGGGGGGA
GAGAGGATGCCGGGCACCCGGGGGGAGGGGGGNCGGGGGGCCGGGGGGCGGGGGCGCGCC
GCGGTGGCCGGCGCGAGGCGCCGCCCGGACCGCCGAGAGCGGAGGAGGGCG
Qualidades das bases
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
NCTGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCTGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAAAATGGGTGAAGGAACCTTCGGGCAGGT
TTTGGAATGCTGGGATCGTGAGAGGAGAGAAATGGGACGCNTTAGAGTTGGGCGGGGGAT
CCACAAATGTCGGGCCGCTGCTGGGGTGGACAGTGGGGCGCGTGGCGAAGGGGGAGGGGG
GGGGGAGGGGGGGGGGGCCGCGCCGCGGCGGGGCGCGGGCCGCATACGCGGGGAGGGGGG
GGGGAGGCGGGGGGCGGGGGGGCGGGCGGGGCCGGAGAGGGAGCGGACGGGGGGGGGGCG
CGGGGCGGCGGGGGGCGGGGCGGTAGCGGGGGGGGGGAGGGGGGCCGCGCGGGGGGGGGA
GAGAGGATGCCGGGCACCCGGGGGGAGGGGGGNCGGGGGGCCGGGGGGCGGGGGCGCGCC
GCGGTGGCCGGCGCGAGGCGCCGCCCGGACCGCCGAGAGCGGAGGAGGGCG
Baixa Qualidade
Alta Qualidade
Baixa qualidade
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
XXXGGTACGCCTGCAGGTACCGGTCCGGAATTCCCTGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Baixa Qualidade
Alta Qualidade
Vetor
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXCCACGCGTCCGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Baixa Qualidade
Alta Qualidade
Adaptador
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Baixa Qualidade
Alta Qualidade
Seqüência trimada
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Baixa Qualidade
Alta Qualidade
Problemas – Trimagem
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGCTCGACCCACGCGTCCGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTGTGGACAAGAGGTTGGGAATGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Baixa Qualidade
Alta Qualidade
Problemas – Trimagem
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGAAATTC
TTATCCCCGTTATTTTATTCGTTCGTTTCAATCGCATCAAGATCTCGATCTCTCTCTTAT
TTCCTCGCCGTGAGCTGCGATCATGGAGATGGAGCGCGTGACGGAGTTTCCTTTTTCGAG
ATCTGGATCGGCGTCCTCGTAAGCGAGCGCGTTTGGGCTGGGACGTGCCTCAGGTACCGA
AGGCTCAGGTAGGATTATTTTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXTGTAACAAGCTTTGCACCTC
CAAGAGCTCCCTCAGACCATGTCACTAGTTCTTCTCTATTTGTAAAGGGAGTGGCTCGAA
ATGGTTCTCCCCCATGGCGTGAGGATGGGGGGATGGCCATTATATGTTTGCGCTTGGAGA
AAATTTAACTTCTCGCTATAAGATTCACAGCAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Baixa Qualidade
Alta Qualidade
Verificação de contaminação



Seqüências EST comumente sofrem
contaminação de diferentes tipos
Identificação e remoção de seqüências
contaminadas são necessárias para que não
sejam geradas informações inválidas sobre o
organismo em estudo
Métodos de detecção de contaminação:


Similaridade
Conjunto de características
Similaridade
Seqüências de
organismos
Contaminantes
Seqüências
a serem
verificadas
Seqüências
contaminadas
BLAST
Seqüências não
contaminadas
Contaminação Determinada por critério pré-definido
Exemplo: similaridade de 98% e cobertura mínima de 75 bases
Conjunto de características
Seqüências de
organismos
contaminantes
Extratores de
características
Assinatura
Seqüências
contaminadas
Comparação
Seqüências a
serem
analisadas
Extratores de
características
Assinatura
Outras
seqüências
Comparação
Seqüências
conhecidas do
organismo alvo
Extratores de
características
Assinatura
Seqüências
pertencentes ao
organismo
Clusterização


Necessária para eliminação de redundância e
identificação de genes
Exemplo:








1
2
3
4
5
6
7
8
CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTTAGTTTGAGTT
GAGCACTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTT
GAAAAGGATCTTTCTGATTCTCGAAGAATGAGGGGCAAGGGGATTGATCGA
TTGTGCAAGTAGCTTTGGTAATTCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAAATC
CGTTAATTGACGACTCTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGACGA
CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATG
CAAGTAGCTTTGGTAATCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAATCTTTGTA
TTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGA
Clusterização
Cluster 1 – Tamanho 5
C GAGCACTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGACGA
2 GAGCACTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTT
6
CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATG
1
CTGCTTTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTTAGTTTGAGTT
8
TTAAGGGTCGTTAATTGACGACTCTTGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGA
5
CGTTAATTGACGACTC*TGATATTTACTAAGTTTGAGTTATGGACGA
Cluster 2 – Tamanho 2
C TTGTGCAAGTAGCTTTGGTAATTCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAAATCTTTGTA
4 TTGTGCAAGTAGCTTTGGTAATTCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAAATC
7
CAAGTAGCTTTGGTAA*TCTTCTCAGTACAACCGACCCACCGTTTCAA*TCTTTGTA
Singleton
3 GAAAAGGATCTTTCTGATTCTCGAAGAATGAGGGGCAAGGGGATTGATCGA
Clusterização

Existência de diversos programas de
clusterização:





TGICL
Phrap
TIGR Assembler
CAP3
Validação dos resultados obtidos nos
processos de trimagem e verificação de
contaminação
Proposta – Trimagem



Estudos de possíveis melhorias nos
processos de trimagem existentes
Criação de um conjunto de
procedimentos padrões
Realização de testes para validação do
conjunto de procedimentos
Proposta – Contaminação




Estudo de possíveis melhorias nos critérios de
verificação de contaminação existentes
Integração entre os métodos de detecção por
similaridade e por conjunto de características
Definição de um critério que melhor se
aplique ao contexto de projetos EST
Realização de testes para validação da
metodologia
Proposta – Clusterização



Análise de programas de clusterização e
de seus parâmetros
Testes para identificação do melhor
programa
Utilização da clusterização para
validação dos métodos desenvolvidos
para trimagem e verificação de
contaminação
Cronograma
1 – Trimagem:



I – Estudo e identificação de melhorias
II – Testes
III – Escrita dos resultados obtidos no testes
Cronograma
2 – Verificação de contaminação:



IV – Estudo e identificação de melhorias
V – Testes
VI – Escrita dos resultados obtidos nos testes
Cronograma
3 – Clusterização:




VII – Escolha dos programas
VIII – Avaliação dos valores de parâmetros
IX – Testes
X – Escrita dos resultados obtidos nos testes
Cronograma
4 – Dissertação:


XI – Revisão final do texto
XII – Defesa