RNA interference in biology
and disease
Carol A. Sledz and Bryan R. G. Williams
Blood, 1º de Agosto de 2005/ volume 106, nº3
Apresentação: Francisco André Marques de Oliveira Cariri
Mariana Marques de Sá Coutelo Chagas
Introdução
 RNA interference (RNAi): Processo pós-transcricional
RNA fita-dupla (dsRNAs)
Silenciamento do gene específico
(Degradação do mRNA)
 Processo que ocorre naturalmente em diversos organismos
 Funções:
1. Proteger os organismos contra vírus
2. Eliminar produtos de degradação anômalos
Introdução
 1928 - Descrito primeiramente em plantas.
Planta Tabaco infectada com vírus – Níveis altos de resistência.
(Wingard SA, 1928)
 1998 - Primeiro trabalho utilizando a técnica de RNAi:
Potent and specific genetic interference by
double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.
(Fire A. and Cols., 1998)
Hibridização do RNA marcado com o mRNA
dsRNA
Antisense
Micrografia de contraste
Introdução
 2001 – Análises em Drosophilas (RNAi em 2 etapas)
 Descoberta da clivagem do dsRNA em Drosophila.
Fragmentos de 21 a 23 nt (siRNAs)
 Descoberta da clivagem do mRNA em Drosophila.
(Zamore and cols., 2001)
 Processo de RNAi provocado experimentalmente – (siRNAs sintéticos)
Síntese química e transcrição in vitro
Kits produzidos por empresas
Introdução
 RNAi realizado com plasmídeos – expressão de siRNAs
Grampos de siRNAs (shRNAs) sob o controle de uma RNA pol III
Inicia a síntese a uma distância conhecida dos promotores
Termina quando encontra cadeia de 4 a 5 uridinas.
Introdução
 Outros dois tipos de silenciamento de genes:
1. Silenciamento do mRNA por micro RNAs endógenos (miRNAs)
Formação de uma grampo de RNA fita dupla
Degradação de mRNAs anômalos ou produzidos indevidamente
2. Silenciamento por modificação do empacotamento do DNA celular
e Histonas que levando ao silenciamento transcricional da
heterocromatina.
Mecanismo de Ação
 Passo inicial: adição de dsRNA que é reduzido
a partes menores conhecidas como siRNA.
Estes por sua vez se ligam a complexos
enzimáticos endoribonucleases RISC.
 Passo efetor: siRNA se conjugam ao RISC e
são guiados ao mRNA, onde ocorrem as clivagens
Mecanismo de Ação
Enzimas:
– DICER
– RISC
Características da técnica
 Eficiente
em baixo número de cópias e
altamente específico
 Manutenção e persistência
 Efeito rápido e eficaz
Experimentos genômicos
 Cientistas
estão
utilizando
esta
tecnologia para desativar genes humanos ou
de agentes transmissores de doenças.
 Já foram desenvolvidos instruções para
silenciar, de maneira rápida e eficiente,
15.000 genes humanos.
HIV
 Silenciamento de
células com HIV
está sendo feito “in
vitro”
 Bloqueio da invasão
e replicação do
vírus
Câncer
 Pesquisadores têm
silenciado mais de
uma dúzia de genes
 Pesquisadores estão
trabalhando para
decifrar 15.000
genes em uma
variedade de Câncer
Hepatite C
 Experimentos em ratos
obteve sucesso
 Produção de vetores
virais para tratamento
de células humanas
Doença de Huntington
 RNAi
pode silenciar genes
problemáticos
 O tratamento
também têm
silenciado genes
saudáveis
Infecções respiratórias
 Criação de drogas
inalatórias que poderão
servir para o
tratamento de SARS e
influenza.
 RNA são inalados e
atingem seus alvos
intactos e controlam
vírus.
Aplicações do RNAi
Aplicações do RNAi
Limitações da RNAi
 Contruir uma seqüência efetiva de siRNAs que possa ser reconhecida e
amplificada pelas polimerases.
(Limitação vem sendo diminuída)
 Eficácia do RNAi depende:
Estrutura do siRNA
Receptividade do tipo celular
Meia vida do mRNA e/ou proteína
 Aumento cada vez maior da estabilidade (“in vivo”)
 Avanços estão sendo realizados para fazer os siRNAs adequados
para propostas terapêuticas.
Efeitos não específicos e fora
do alvo da RNAi
 2 considerações importantes:
1. Mecanismo eficiente do siRNA “ in vivo ”.
2. Evitar efeitos não específicos ou fora do alvo do siRNAs.
siRNAs ativando uma resposta
celular alternativa, regulando
genes associados com a
resposta imune.
Alteração da expressão de
outros genes em resposta a
presença do siRNA.
Interferon – citocinas da primeira linha de defesa contra infecções
virais em mamíferos, que induz a ativação transcricional de genes.
Produto dos genes ativados – atividade antiviral e antiproliferativa.
Ativação da resposta imune inata é ativada pelos dsRNAs
Conclusões
 Cada vez mais o RNAi vem sendo utilizado em aplicações médicas e
científicas, consolidando-se como uma poderosa ferramenta de
silenciamento gênico.
 Estratégias para aumentar o nível de eficiência da RNAi e minimizar
os efeitos não específicos ou fora do alvo:
1. Utilizar informações disponíveis para sintetizar
siRNAs mais específicos e que possam ser usados
numa concentração cada vez menor, mas mantendo a
sua eficácia.
2. Utilizar os siRNAs contra as sequências alvo sem que
eles causem efeitos não específicos;
3. Resgatar fenótipos causados pela expressão de um
siRNA ectópico de um gene que não poderia ser
silenciado pelo siRNA.
OBRIGADO!!!!!