Controle epigenético da expressão gênica em plantas
Alteração da expressão gênica sem alterações na sequência de DNA
Caso clássico: Alterações epigenéticas que afetam propriedades de pigmentação
Duas possibilidades: permanecem após a meiose x não permanecem após a meiose
Mudancas epigenenéticas típicas das plantas: normalmente transmitidas na meiose
Mecanismos da variação epigenética: Metilação do DNA
Mudanças no posicionamento do nucleossoma
Mudanças no empacotamento dos nucleossomas
Modificações covalentes do nucleossoma
Metilação: mecanismo mais connhecido
DNA-metil transferase; preferência pelo motivo CpG ou Cp
Metilação: mecanismos para garantir a heranca mitótica ou meiótica de
padrões específicos de metilação.
1) : ATPase tipo SNF2 (Lsh) aflouxa os contatos entre o DNA e as histonas
2) Metiltransf. da histona (Suv39H1) metila Lys hist. (estrela):
Configuração da cromatina permissível à metilação
3) “Targeting factor” reconhece a sequência a ser metilada,
e traz consigo os fatores para a metilação:
DNMT1: citosina-5-metil transferase
HDAC: desacetilase da histona
MeCP2: proteína de ligação ao DNA metilado
4) Sin3a +HDAC: desacetilação das histonas
resultando em sua condensação
Metilação e repressão transcricional
Mecanismo epigenético 1: Imprinting
Imprinting: a expressão de certos alelos difere dependendo da origem do gameta
Exs: mamiferos, fungos e plantas
Ex: pigmentação da semente de milho: alelos r (red):
Bom nível de expressão quando
transmitido pelo óvulo ::cor sólida da
semente
Baixo nível de expressão quando
transmitido pelo pólem ::cor variegada:
Diferenças fenotípicas: não depende da dosagem do gene R
mas sim de mudanças epigenéticas que são macho-específicas
Imprinting: sementes; mudanças epigenéticas relacionadas a dosagem gênica e
ligadas ao sexo
Grande desenvolvimento do endosperma
periférico e chalazal, mas sem celularização
Maternalização = redução da metilação
2x x 2x
Reduzido endosperma
periférico e chalazal
Transgênicos e Mutantes
hipometilados
Fenocópia 4x x 2x
Fenocópia 2x x 4x
Fenocópia 2x x 6x
Fatores epigenéticos controlando o desenvolvimento da semente
paternal
Mecanismo do imprinting (ratos)
Dois genes reciprocamente sofrendo imprinting: 90 kb distância Igf2: fator cresc. fetal H19: RNA sem prot.
DMD: differentially methylated domain -> silenciador: papel no “desliga expressão” H19 e IGF2
Estimuladores
Endoderme
Bloqueia o estimulador de Igf2
Específico para
mesoderme
?
Mesoderma
Mecanismo epigenético 2: Paramutação
Interação alélica: a expressão de um alelo em um heterozigoto é alterada na
presenca de outro; herdável através da meiose
Alelo B(booster): B-I: pigmentacao forte; B’: pigmentacao fraca
B-I: mesmo gene: heterozigoto
transmite somente o alelo B’
B’: transcrição 10-20 vezes
menor
Alelo Pl; forte pigmentação das anteras;
Pl’: cor variegada
PI e P’: mesmo gene: heterozigoto transmite somente o alelo P’
DNA metilado: proteínas ligam-se ao DNA metilado
enzimas modificadoras das histonas
fatores remodeladores da cromatina
formação da heterocromatina
Mecanismo da paramutação;
Mecanismo 2
Mecanismo 1
Promotor 1
Promotor 2
RNA
aberrante
Interação dos cromossomas
Transferência direta de elementos
da cromatina
Sinal difusivel: RNA
Citosinas metiladas podem ser mantidas na replicação
Mutantes com alterações no mecanismo epigenético da regulação gênica
Milho: mop1: mediator of paramutation 1: bloqueia a paramutação do gene B e
de outros pigmentos
Arabidopsis: o caso dos genes PAI:
sintese triptofano:
2 genes, em 2 cromos.
ambos genes PAI tornam-se então metilados
Introdução de novos genes PAI não metilados
tornam-se metilados
PAI: Phosphoribosilanathranilate isomerase
Estratégia de seleção de mutações que afetam as mudancas epigenéticas em PAI
Reação catalizada pela enzima PAI
[intermediário fluorescente]
……….
Planta transgênica
utilizado na
seleção genética
X
10 mutante
isolado
Triptofano
20 mutante
isolado
Única sequência PAI que
pode ser expressa no
cromossoma 1 foi mutada
Met1 e CMT3: codificam para
duas diferentes
metil-transferases deDNA
Nivel de metilação = reostato
controle do nível de
expressão gênica
metilacoes
redução na
fluorescência
metilação
Mecanismo epigenético 3: Silenciamento
Detecção: plantas trangênicas; Arabidopsis, Petunia e tabaco
Repetição da presença de genes :::: silenciamento de outras sequências
Estrutura ou organização do cromossoma como causa do silenciamento
Petunia mutata : sem cor (sem o gene A1):
Introdução gene A1 do milho: cópia simples:
Flor torna-se pigmentada
Adição da segunda cópia de A1: transcrição
silenciada: herdável geneticamente
Variegação:
Silenciamento da segunda cópia
Gene silenciado A1 pode induzir silenciamento epigenético de outro gene A1 novo,
somente quando esse gene A1 expresso é inserido próximo do primeiro.
Mecanismos: TGA (transcriptional gene silencing) pela metilação
ddm1: afeta o reconhecimento da metilação
met1: afeta a metilação
mom1: TGS independente da metilação
PTGA (post-transcriptional gene silencing) pela metilação: não afeta a transcrição
Mecanismo epigenético 3: Silenciamento: Co-supressão
Transgene pode induzir o silenciamento de um gene endógeno e homólogo
Silenciamento não-herdável
Experiência da sobre-expressão da chalcone sintase
Co-supressão não herdável geneticamente: atividade
endógena é restabelecida quando ocorre a segregação do transgene
Silenciamento de viróides: enxerto
de planta contaminada por um vírus
em outra planta contaminada com
outro vírus:.
Silenciamento de outro vírus:
Transmissão do sinal por toda a
planta:
Efeito a nível pós-transcripcional
Eventos epigenéticos na poliploidização
(70% angiosperma; 95% pteridófitas)
Diferencas no número de cormossomas
ou organização
podem romper o pareamento e distribuição
: duplicação dos cromossomas
Inicio da formação de um poliplóide: “choque”:
- silenciamento genes duplicados;
- reduzir “infidelidade” cromossomal
Híbrido
F1
Duplicação
gênica
Duplicação
gênica
Autopoliploide
Alopoliplóide
Autopoliploidia; oportunidade para alterar a expressão gênica (silenciamento), e criar um tampão contra o efeito de mutações deletérias
Vantagens dos alopoliplóides: manter a natureza híbrida indefinidamente
Mudanças durante o estabelecimento da um autopoliplóide: eliminação de sequências de DNA, expansão heterocromatina,
translocacao recíproca de segmentos de cromossomas: ajudam diferenciar os cromossomas homólogos dos homeologos
Silenciamento nos alopoliplóides: metilação: uso do aza-dC
Modelo explicativo do silenciamento em poliplóides
Causas potencias da origem da variabilidade em poliplóides
Seleção de mutações que afetam o controle das alterações epigenéticas
ddm1: mutação no gene (SNW/SNF2) : fator de remodelação da cromatina;
Mamíferos mudanças na estrutura da cromatina devem anteceder a metilação
Sem fenótipo visível; autofecundação:
Paradoxo?
progenia anormal::desestabilização da
programação epigenética
reduzido nível de metilação :: nova metilação e silenciamento de genes que são
normalmente expressos e não metilados (SUPERMAN): flores anormais
Plantas antisenso para MET1;
redução em 30% no nível de metilação
Hipermetilação
do gene SUPERMAN
e do gene AG
Hipermetilação
do gene SUPERMAN
Problema para a obtenção de plantas transgênicas: - súbito silenciamento do transgenes
1a defesa para superar este problema: selecionar planta transgênica com cópia unica
Genes do florescimento precoce: genes silenciadores: mecanismos epigéneticos
no controle do florescimento (repressores epigeneticos)
Genes do florescimento precoce: genes de proteinas associadas a cromatina
Repressores epigenéticos
Mutantes tfl2, emf: 1) florescem precocemente, 2) florescem sob DC, flor terminal,
3) proteínas de reserva da semente são expressas antes
35S:TFL1
4 sépalas
nova influorescência
35S:EMF1 + DL
duas folhas caulinares
flor terminal (2 silíquas)
novo broto terminal
35S:EMF1 + DC
flores e brotos
originados na mesma
regiao
Importância da remodelagem da cromatina no controle da expressão gênica
e dos processos de desenvolvimento
Pouco compeendido como esses fatores de remodelagem da cromatina funcionam em plantas
PGTS (post-transcriptional gene silencing):primeiramente descoberto em
plantas
Primeiro gene regulatório para PGTS foi descoberto em Neurospora
Mediado por moléculas de RNA pequenas (<70 nucleotídeos)
PGTS: um poderoso meio para manipular a expressao em sistemas animais::RNAi
PGTS: mais conhecido em Drosophila e levedura (Saccharomyces)
Plantas usam as mudancas epigenéticas para se adaptar a mudancas genômicas ou
ambientais::flexibilidade
Flexibilidade: reprogramação dos estágios de desenvolvimento
Funções: 1) proteção contra efeitos deletérios da transposição de transposons
2) Resistência contra viroses (Produzem dsRNA)
DICER
Pode ser transmitido entre
células e a longas distâncias
PGTS
(Silenciamento pós-transc.
RNA curto de interferência (siRNA)
Dupla fita
Perfeitamente complementar ao RNA alvo
Direciona a clivagem endonucleolítica
RNA dupla fita perfeitamente ou quase perfeitamente pareado
Não conservado entre as espécies
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Cromossomal ou citoplásmico
Comprimento médio de 25 nucleotídeos
Micro RNA (miRNA)
Fita simples
Parcialmente complementar ao RNA alvo
Mecanismo de ação desconhecido
RNA dupla fita pareado, mas com alças
Frequentemente conservado entre as espécies e filos
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Cromossomal (IGR)
Tamanho médio de 70 nucleotídeos
RNA curto temporal (stRNA)
Fita simples
Parcialmente complementar ao RNA alvo
Inibe a tradução do mRNA
RNA dupla fita pareado, mas com alças
Altamente conservado entre as espécies e filos
Altamente conservado entre as espécies e filos
Originado de um RNA percursor de maior tamanho
Cromossomal (IGR)
Tamanho médio de 70 nucleotídeos
Mecanismos pelos quais
os microRNAs promovem
o silenciamento
RNAse tipo III
Complexo de
endonucleases
Locus de controle do cruzamento sexual em S. pombe (mat2P)
Metilação da histona
Recrutamento: criação de um sítio de
nucleação da heterocromatina
Difusão do processo de diferenciação da heterocromatina:
Silenciamento do locus mat2P
61 alvos potenciais: 41 são fatores transcricionais
Desen. floral
Desen. floral
Dicer
Separação de orgãos
Dif. Merist. Axilar e da folha
Det. Da especificade de RISC: mutantes: arquit. mod
Desen. floral
Desen. floral
Identidade floral
Inoculação com o virus da planta transgênica 35SGFP
TRV-00: vírus sem inserto
TRV-P: contendo 359 nt 3’ da GFP
TRV-35S: 347 nt do promotor da GFP
Luz UV
Nuclear Run of: taxa de transcrição
PGS
PTGS
Luz UV
TRV: tobacco rattle virus
Efeito da proteína HC-Pro no silenciamento sistêmico
HC-Pro: proteína viral que
suprime o silenciamento
SilGUS: locus de silenciamento
de GUS
Silenciamento
sistêmico
Supressão do silenciamento sistêmico
RNAi: poderosa ferramenta
atFAD2: Desaturase de A. thaliana
AttP1/AttP2: clonagem por
Recombinação utilizando o sistema
Gateway
Gene orientação
Senso substitui ccdB
Gene orientação
anti-senso substitui ccdB
Amplifico o gene adicionando o sítios attB1 e attB2
Recombinação in vitro utilizando o sistema Gateway
Sistema ccdB: proteína letal: sistema para a seleção do vetor recombinante
RNAi