Antes da descoberta dos siRNAs oligonucleotídeos
antisenso (ASO) eram usados para silenciar genes
Zamecnik PC and Stephenson ML, 1978: oligonucleotídeos
como agentes antisenso para inibir replicação viral.
1 – Oligonucleotídeo antisenso (tipicamente 20 nts)
(não há um mecanismo biológico de reconhecimento da fita antisenso)
Mecanismo de silenciamento:
Clivagem
RNase H
CAP
AAAA
mRNA
DNA
ou
Ribossomo
Bloqueio da
tradução
CAP
AAAA
DNA
mRNA
O que precisamos para usar RNAi?
•A seqüência de uma porção do gene alvo
•Sintetizar a molécula de dsRNA correspondente
•Introduzir o RNA na célula ou organismo
Atualmente, siRNA é o instrumento mais poderoso para estudos de genética
reversa.
Como pode ser produzido o siRNA?
- Síntese química:
. dsRNA com 21 nt, sendo 2 nt 3’ overhang
- Transcrição in vitro a partir de DNA seguida de digestão
enzimática e purificação.
- Em vetor de expressão (plasmídeo ou vírus):
Transcrição e processamento são feitos dentro das
células
Regras empíricas para desenho de siRNAs (Tuschl)
• siRNs devem ter 21-nt senso e 21-nt anti-senso, pareados de tal modo
que resulte em 2-nt 3’ dTdT overhang
• A região alvo é selecionada no cDNA a partir de 50 a 100 nt à frente do
sítio de início de transcrição; 3’UTR também pode ser um bom alvo.
• Os nucleotídeos 1-19 do siRNA senso correspondem à posição 3-21
dos 23 nt do alvo.
• O alvo selecionado não deve ter mais que 50% de GC
• siRNA não deve ser complementar a outros mRNAS.
• Propriedades termodinâmicas do siRNA:
A estabilidade relativa das extremidades do siRNA é um parâmetro
essencial na escolha da fita que será incorporada no complexo
RISC
5’
3’
5’
3’
Kurreck J (2.006)
A variabilidade na eficácia do siRNA pode ser devida à variabilidade na
escolha da fita guia e à inacessibilidade do alvo:
A estrutura da fita guia do
siRNA também é importante
Kurreck J (2.006)
Estruturas secundárias no mRNA ou interação com outras proteínas
também podem impedir a interação do complexo RISC com o mRNA
alvo.
Previsão de estruturas secundárias no mRNA:
http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold
http://sfold.wardsworth.org/index.pl
Experiência acumulada com oligos antisense (ASO)
foi muito útil para siRNAs
Modificações para aumentar a estabilidade:
Meia-vida em humanos: ~ 9 – 10 h
(não modificado: 1 h)
Forma pareamento usual Watson-Crick
Menos tóxicos e com afinidade levemente maior que PS-ASO
Ativa
RNase H
Terceira Geração
de ASO
A maioria não
ativa RNase H
siRNA sintéticos
Transcrição in vitro do dsRNA
Transcrição in vitro do dsRNA
Transcrição in vitro do shRNA
Uso de vetores para expressão do shRNA
Yang Shi (PNAS 99:5515-5520,2002),
Construiu um vetor para expressão de shRNA:
plasmídeo Blue Script modificado pela inserção do promotor U6, que
controla a transcrição do siRNA
Término de transcrição
U6
TTTTT
A seqüência codificante para
sintetizar o siRNA é escolhida
dentro da seqüência codificante
do gene que se quer silenciar.
pBS/U6
Kim DH e Rossi JJ, 2007
Promotores para RNA polimerase II: expressão condicional em tempo e
local específicos
Eletroporação
Lipofecção
Retrovirus
Transfecção em células que fazem o empacotamento
Vetores Virais
Kim DH e Rossi JJ, 2007
Quando usar siRNA sintético?
Duração necessária do silenciamento não passa de 5 a 7 dias.
Efeito adequado em 2 a 3 dias.
Silenciamento mais longo: expressar shRNA
Silenciamento de 1 semana ou menos:
Células imortalizadas aderentes à placa de cultura:
- siRNA sintetizado quimicamente
- Transfecção
Cultura primária e células em suspensão:
- siRNA sintético
- Eletroporação
Células muito diferenciadas:
- Vetor viral expressando shRNA
- Infecção
Silenciamento de 1 semana ou mais:
Células imortalizadas aderentes:
- Vetor (plasmídeo) expressando shRNA com
gene de resistência a antibiótico para deleção de
expressão estável
- Transfecção
Cultura primária, células em suspensão ou muito diferenciadas:
- Vetor Viral
- Infecção
Direcionamento do siRNA para a célula alvo
Métodos não seletivos:
- siRNA modificados
conjugados a colesterol
- partículas lipossomais
(Stable Nucleic Acids
Lipid Particles – SNALPs)
Kim DH e Rossi JJ, 2007
Métodos seletivos
- siRNAs ligados a haptâmeros reconhecidos receptores em
células específicas
Kim DH e Rossi JJ, 2007
Métodos seletivos
- siRNAs ligados a fragmento
da cadeia pesada de
anticorpos (Fab)
- Nanopartículas
Kim DH e Rossi JJ, 2007
Detecção do silenciamento:
- Análise da quantidade de mRNA específico
(24 a 48 horas)
RT-PCR em tempo real
- Análise da presença da proteína
(48 a 72 h, dependendo da meia vida da proteína)
Western blot, imunohistoquímica, imunocitoquímica, imunoensaio …
Alguns problemas identificados:
– O siRNA pode não ser seletivo e pode ligar-se a outros mRNA na célula
(off-target effects).
- Resposta imune (ativação de Toll like receptors – TRLs)
- O alto nível de expressão de shRNA pode competir pela interação com
os complexos que processam miRNA endógenos.
- shRNA transcritos pela RNA polimerase III tem trifosfato na
extremidade 5’ e esse pode ativar RIG (retinoic acid-inducible protein).
Isso pode ser evitado se é usada RNA polimerase II.
Controles experimentais ao usar siRNA:
- Células não transfectadas
- Células transfectadas com siRNA sem alvo
- Controles positivos:
siRNAs para genes constitutivamente expressos
siRNA já testado para gene que participa da via metabólica analisada
Testar mais de um siRNA para o gene alvo (em geral 3)
Não é conveniente usar pool de siRNAs
Outros controle:
Eficiência de incorporação do siRNA pela célula
siRNA marcado - Cy3, FAM
Ao quantificar o mRNA e a proteína na célula tratada com siRNA,
avaliar também um gene de expressão constitutiva (GAPDH, b-actina ...)
Normalizar a quantidade de proteína pelo número de células viáveis.
O processo não deve reduzir a viabilidade celular em mais que 30%.
siRNA é considerado eficiente se reduz o mRNA em no mínimo 70%
e a proteína em no mínimo 50%
Kim DH e Rossi JJ, 2007
miRNAs
Pelo menos 1/3 dos genes humanos parecem ser alvos de
regulação por miRNAs.
A combinação única de miRNAs em cada tipo de célula
determina o uso dos milhares de mRNAs.
Identificação de alvos:
Alvos de miRNA tendem a ser preservados entre as espécies
Friedman RC et al, 2009
Xiao F at al, 2009
Método mais usado para identificar alvos de
miRNAs:
. Vetores contendo gene repórter (Ex.
Luciferase)
. O 3´UTR do suposto mRNA alvo é clonado
na frente do gene repórter
. Vetor recombinante é transfectado na
célula de interesse com ou sem o miRNA
. Localização da sequência alvo no 3´UTR
(MRE - miR responsive element)
através de mutação sítio-dirigida.
. Quantificação da Luciferase
. Quantificação do mRNA alvo por RT-PCR
Karginov FV et al, 2007
. Expressão do miRNA (pre ou pri-miRNA em vetores) e análise dos mRNAs
. Imunoprecipitação da Ago2 carregada com miRNAs
Purificação do miRNA
Amplificação com oligo- específico (PCR)
Marcação fluorescente
Hibridização de micro-array
Para identificação de alvos, o miRNA pode ser também
"down regulated" utilizando oligonucleotídeos
complementares quimicamente modificados (antagomir)
ou siRNA dirigido ao miRNA.
Extração de pequenos RNAs - (Ambion)
RNAs pequenos
PCR com primer com
estrutura hairpin para
detectar e quantificar
miRNAs