Construção de Bibliotecas
de cDNA
Claudia Teixeira Guimarães
Antônio A.C. Purcino
Eliane A. Gomes
Jurandir V. Magalhães
Newton P. Carneiro
Elto E.G. Gama
Robert E. Schaffert
Sidney N. Parentoni
Vera M.C. Alves
Biblioteca de cDNA
É um arranjo de cópias de DNA que representa uma população de
mRNAs. Objetivo é gerar ESTs (Expressed Sequence Tags) que
amostrem os genes expressos (induzidos ou reprimidos) sob uma
determinada condição (tecido, célula ou estresse).
Pré-requisitos:
• a condição, tecido e genótipo permitam que os genes de
interesse sejam expressos;
• a biblioteca possua qualidade e quantidade de clones suficiente
para amostrar os mRNAs, incluindo aqueles com reduzido número
de cópias, que são normalmente aqueles de maior interesse.
Definição do Material Genético e
das Condições
É de fundamental importância garantir que os genes de interesse
sejam expressos sob uma determinada condição.
Para isso, é necessário:
• Genótipos caracterizados;
• Fenótipo confiável indicador da característica em estudo;
• Estudos fisiológicos para de determinar quando e em qual tecido
os genes de interesse são expressos;
• Condições de estresse para o aparecimento do fenótipo e para a
expressão dos genes;
• Coleta e armazenamento adequados do material vegetal.
Material Genético
• Linhagens contrastantes
F2
×
×
F1
F1
×
⊗
RC1
...
• Linhagens isogênicas
F2:3 … F7
⊗
RC4
...
96,875%
Genótipos Caracterizados
Colonização micorrízica
P-efficient
P-efficient
Al tolerant
P-inefficient
c/ colonização
P-inefficient
Al sensitive
Al sensitive
Al tolerant
s/ colonização
Caracterização Fisiológica
Caracterização em Campo
Melhoramento
Genético
Genética Molecular
Eficiência na utilização de N
Clonagem de
Genes
Tolerância ao Al tóxico
Tolerância a Seca
Biblioteca de cDNA
A representatividade da biblioteca de cDNA está em função da
sua qualidade, que por sua vez depende da integridade do RNA
original e dos cuidados na construção da biblioteca. A qualidade
da biblioteca pode ser avaliada pela:
• quantidade de clones: número suficiente para amostrar o
máximo de mRNAs possível, incluindo os de baixo número de
cópias;
• tamanho dos insertos: favoreça a clonagem de cDNAs
completos, evitando fragmentos espúrios
Tipos de Biblioteca de cDNA
Típica: obter o perfil dos genes de um organismos, transcriptoma
direcional: orientação da polaridade transcricional do mRNA
original
ao acaso: insertos clonados em qualquer orientação
Subtrativa seguida por PCR: identificar genes diferencialmente
expressos
biblioteca enriquecida com fragmentos de mRNA raros e
diferencialmente expressos
Etapas para a Construção da
Biblioteca de cDNA
• Isolamento do RNA mensageiro
• Síntese do cDNA
• Clonagem dos fragmentos
• Estocagem dos clones
• Sequenciamento
• Análise: Bioinformática
Isolamento do RNA mensageiro
• Qualidade do mRNA é primordial para se
garantir a qualidade da biblioteca, obtendo o
máximo de informações que serão convertidas
em cDNA
• Extração pode ser do RNA total ou do mRNA
• RNA total = rRNA, tRNA e mRNA (0,5 a 2%)
• A maioria do mRNA é poli-adenilado (poli-A) e
sua purificação pode ser realizada em coluna de
afinidade com oligo dT
• Cuidado para evitar contaminação com RNase
• De 1 a 5 ug de mRNA são suficientes para
construção de biblioteca com 105 a 106 clones
Síntese do cDNA
Primeira fita
• Depende da hibridização do primer (poliT) com o mRNA
• Para clonagem direcional o primer deve ter um adaptador com
um ou mais sítios de restrição
• Transcriptase reversa (RT) deve ser eficiente para favorecer a
síntese de cDNAs completos e sem atividade RNase H
Segunda fita
• Substituição da fita do mRNA por DNA usando nick translation
• Combinação da DNA polimerase I, RNase H e DNA ligase
• Para clonagem direcional um segundo adaptador com sítios de
restrição deve ser adicionado
Síntese de cDNA via SuperScript (Invitrogen)
• Primer poliT contendo sítio
de restrição
• Síntese da primeira e
segunda fita em um único
tubo
• Ligação de um adaptador
com sítio para Sal I
• Digestão com Not I
• Fragmentos prontos para a
clonagem direcional
Clonagem dos Fragmentos
• No caso da clonagem direcional, os cDNAs devem ser
digeridos como mostrado anterior, e fracionados
• O fracionamento dos clones é importante para eliminar o
excesso de adaptadores que são adicionados em excesso e
para reduzir a clonagem de fragmentos de cDNAs pequenos e
degradados
• Ligação dos fragmentos de cDNA e transformação usando
vetores e células competentes de qualidade
10 a 20 ng de cDNA x 50 ng de vetor
5 x 105 clones (protocolo do fabricante)
• Tecnologia Gateway, usa a recombinação sítio específica
flanqueando os sítios de clonagem
Genoma Funcional
RNA mensageiro = genes expressos
Bibliotecas de
cDNAs
5’
AAAAA 3’
5’
5’
AAAAA 3’
TTTTT 5’
TTTTT 5’
TTTTT 5’
TTTTT 5’
3’
5’
1a fita de
cDNA
3’
CONTIG ~ GENE
GENES EXPRESSOS: bibliotecas de cDNAs
Diferentes tecidos
Diferentes genótipos
Diferentes condições
Diferentes estágios
de desenvolvimento
ESTs: Alinhamento, Clusterização, Anotação
Northern Eletrônico, Display Differencial Digital,
SNPs, UniGenes
Banco de ESTs: dbEST
Total
humanos
camundongo
bovino
milho
trigo
Arabidopsis
arroz
soja
cana
31.307.034
7.057.754
4.688.047
702.645
656.945
600.039
420.789
406.651
355.978
246.301
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/ 11 nov, 2005
UniGenes: conjunto de clusters orientados e não
redundantes que representam um gene único
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene
Biblioteca Subtrativa seguida por PCR
• Objetivo é enriquecer a biblioteca de transcrito raros e
diferencialmente expressos entre duas situações
• Síntese de cDNAs a partir de duas populações de mRNA
diferentes (genótipos ou condições contrastantes), que são
extraídos separadamente, e denominados tester e driver
• Tester é o tratamento: genótipo tolerante ou condição de estresse
• Driver é o controle: genótipo sensível ou sem estresse
• Quantidade inicial de mRNA pode ser de 500 ng
• cDNAs são digeridos, separadamente com a enzima Rsa I, de
corte abrupto, e ligado dois adaptadores diferentes
cDNA Tester: dividido em porções iquais
com adaptador 1R
com adaptador 2R
cDNA Driver, sem adaptador e
em excesso
Biblioteca Subtrativa seguida por PCR
Hibridização Subtrativa
cDNA Driver
(em excesso)
cDNA Tester com
adaptador 1R
a: transcritos raros
b: transcritos abundantes
c: transcritos comuns nas
duas condições
d: transcritos do controle
em excesso
cDNA Tester com
adaptador 2R
1a hibridização
a
b
c
d
2a hibridização
a, b, c, d
+
e
Com adição de Driver
desnaturado e end filling
Biblioteca Subtrativa seguida por PCR
Ciclos de PCR
a e d: sem amplificação
por não ter sítio de
anelamento do primer
a
c: amplificação linear
c
b: formação de alça
estável
d
e: amplificação
exponencial
e
b
1a PCR: adição do primer externo
5’
3’
3’
5’
2a PCR: adição dos primers internos
5’
3’
3’
5’
Clonagem dos Fragmentos
2 a PCR
Controle
1kB
• Clonagem utilizando os kits disponíveis para fragmentos de
PCR blunt-end, como TA Topo (Invitrogen), pGEM-T (Promega)
• Não é clonagem direcional
• Normalmente são fragmentos pequenos, na faixa de 500 pares
de base
Fragmentos blunt-end com A
nas extremidades deixados
pela Taq-polimerase após a
reação de PCR
A
1018
506
200
A
+
Purificação
poly-A
mRNA
Síntese do
cDNA
Digestão
com Rsa I
cDNA Tester digerido
cDNA Tester
cDNA Driver digerido
cDNA Driver
Tratamento:Tester
RNA Total
Controle: Driver
Peso Molecular
Tratamento:Tester
Controle: Driver
Peso Molecular
Obtenção dos cDNAs Tester e Driver
2 a PCR
Control
1 a PCR
Controle
1kB ladder
Fragmentos de cDNA após as
Hibridizações Subtrativas e as
Reações de PCR
Clonagem dos
fragmentos em
1018
506
200
Vetores
específicos
Clonagem dos Fragmentos de cDNA
Transformação em E. coli e
seleção com X-gal/IPTG
Eletroporação: estratégia que
usa pulsos elétricos para alterar
a estabilidade da membrana
Mini-preps e digestão
com EcoR I para
identificação dos clones
com insertos
Armazenamento dos Clones
• Organização para garantir a conservação e o uso posterior dos
clones
Sequenciamento e Análise
• Detalhamento na palestra do Felipe Rodrigues da Silva