56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Localização sub-celular de duas proteínas
metiltransferase reguladas ao longo do desenvolvimento
e específicas do pistilo de Nicotiana tabacum
Toledo-Filho, LAA1,2; Avanci, NC1; Angelo, PCS1; Quiapim, AC1; De-Paoli, HC1,2, Pranchevicius, MC1;
Dornelas, MC3; Goldman, GH4; Goldman, MHS1,2
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – FFCLRP
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – FMRP-USP
3
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
4
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo – FCFRP-USP
[email protected]
1
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Palavras-chave: Pistilo, Localização sub-celular, Metiltransferase, GFP, Confocal
Diferentes órgãos possuem padrões distintos de expressão gênica, incluindo o órgão reprodutor feminino das
angiospermas (pistilo), formado de estigma/estilete e ovário. Através do “screening” diferencial de uma biblioteca
de cDNAs de estigma e estilete de Nicotiana tabacum isolou-se o cDNA PA3. O alinhamento (Blast) demonstrou
alta similaridade da proteína codificada pelo cDNA PA3 com metiltransferases da família SABATH. Essas enzimas
podem estar envolvidas com a metilação dos ácidos benzóico, salicílico e jasmônico. Os ésteres metilados destes
ácidos estão envolvidos com processos importantes em plantas, como defesa contra patógenos, atração de
polinizadores, desenvolvimento e sinalização. Experimentos de northern blot com RNA total de diferentes órgãos
(raiz, caule, folha, sépala, pétala, estame, estigma/estilete e ovário), utilizando o cDNA PA3 como sonda, revelou 4
bandas específicas do pistilo. Outro northern blot, com RNA total de estigmas/estiletes e ovários dos 12 estádios
desenvolvimentais da flor de N. tabacum, demonstrou um nível menor de expressão nos estádios iniciais, com
o aumento nos estádios próximos à antese, revelando uma regulação desenvolvimental da expressão gênica.
Hibridização in situ, usando o cDNA PA3 como sonda em cortes longitudinais de estigma/estilete, mostrou a
presença destes transcritos na zona secretória do estigma e no tecido transmissor, tecidos atravessados pelo tubo
polínico durante a polinização. Em cortes transversais do ovário houve hibridização no tecido vascular e nos óvulos.
A análise das 3 bibliotecas de cDNA de estigmas/estiletes de N. tabacum do nosso laboratório (TOBEST, TOBSH1
e TOBSH2) resultou na identificação de 28 cDNAs desta metiltransferase, porém com diferentes combinações
de éxons, sugerindo a ocorrência de processamento alternativo de éxons. Para examinar a possibilidade
das proteínas codificadas por diferentes cDNAs serem destinadas para diferentes localizações subcelulares,
2 cDNAs (PA3 e 46B11) foram fusionados com a sequência da GFP, nas extremidades N- em C-terminal. As 4
construções obtidas foram introduzidas em folhas de N. tabacum por infiltração com Agrobacterium tumefasciens.
A microscopia confocal revelou localização citossólica para ambas as proteínas, quando a GFP encontra-se na
extremidade N-terminal da proteína de fusão (GFP-cDNA). Porém, surpreendentemente, ambas as proteínas,
quando fusionadas na extremidade C-terminal com a GFP (cDNA-GFP), apresentaram acumulação em estruturas
vesiculares e/ou agregadas. Uma possibilidade é que a existência de um sinal de direcionamento na porção
N-terminal das duas metiltransferases tenha sido encoberto pela GFP na fusão N-terminal. Inacessíveis para
interações na porção N-terminal, necessárias para a correta compartimentalização, as proteínas permaneceriam
no citossol. Outra possibilidade é que a localização correta destas proteínas seja o citossol e suas fusões C-terminal
resultem em proteínas mal dobradas, que são aprisionadas em vesículas para degradação. Experimentos de
imunolocalização estão em andamento para esclarecer a correta localização subcelular destas proteínas.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.