Introdução
Este trabalho laboratorial foi realizado com o
intuito de produzir, na bactéria E. Coli, a proteína
Drg11 associada a dois “tags” diferentes:

6 Histidinas

GST (Glutationa S-Transferase)
Drg11
É
uma proteína de regulação de 30KDa que
funciona como factor de transcrição.

É importante no estabelecimento do circuito
nociceptivo
durante
o
desenvolvimento
embrionário.
 Pode
estar
neurónios.
envolvido
na
organização
dos
Importância deste trabalho

A expressão heteróloga de proteínas é muito
importante quando se pretende proceder ao estudo
funcional das mesmas.

Em primeiro lugar, torna-se necessária a produção
e purificação da proteína e, finalmente, a obtenção
do anticorpo que lhe corresponde.

As proteínas de fusão consistem na associação de
duas proteínas (a Drg11 com um tag).

A utilização de tags possibilita a purificação da
proteína de interesse, através da cromatografia de
afinidade, por intermédio do uso de resinas com
determinados constituintes que apresentam
afinidade para esses tags.
 His-Drg11:
resina com Níquel
 GST-Drg11: resina com glutationa

Os vectores de expressão utilizados são os
plasmídeos:
 PGEX – contém o cDNA da proteína de
fusão GST-Drg11.
 PRSETA – contém o cDNA da proteína
de fusão His-Drg11.

Utilizam-se dois vectores diferentes porque as
proteínas de fusão podem ter comportamentos
diferentes nas culturas de bactérias seleccionadas.
E.Coli

A estirpe de E.Coli utilizada foi a BL21.

A BL21 é uma estirpe geneticamente
modificada, caracterizada pela inactivação de
muitos dos genes que codificam as suas
proteases. Assim, a probabilidade de ocorrer a
proteólise das proteínas de interesse é menor.
Procedimentos
Foram-nos fornecidos dois stocks de
bactérias desta estirpe previamente submetidas a
um processo de transformação com os dois
plasmídeos recombinantes:
PRSETA
PGEX
( His-Drg11)
(GST-Drg11)
PRSETA
cDNA da
Drg11
His
1KDa
Drg11
+
30KDa
= 31KDa
PGEX
GST
26KDa
Drg11
+
30KDa
= 56KDa
cDNA da
Drg11
Protocolo experimental
2 stocks de bactérias submetidas a
um processo de transformação
Repicou-se e colocou-se em
LB/Ampicilina
Overnight a 30ºC
Rejuvenesceu-se (1/10 em LB/Ampicilina)
2h30
Adicionou-se IPTG
Aguardou-se 4h para expressão das
proteínas

O IPTG é um indutor da transcrição genética que
aumenta a quantidade da enzima T7 RNA
polimerase, a qual se liga ao promotor T7,
iniciando a transcrição do cDNA de interesse.

Para cada conjunto de bactérias transformadas
realizou-se um controlo e variou-se a
concentração deste indutor, a fim de conhecer a
concentração ideal a adicionar.
Sedimentou-se por centrifugação
Aspirou-se o sobrenadante
Colocou-se o pellet em gelo
Nonidet P40
Adicionou-se uma mistura de lise
Mg2+
PBS
DNAse
Obteve-se um extracto de proteínas
SDS-PAGE
Corou-se com Azul de Coomassie
SDS-PAGE com amostras do extracto
proteico da E. Coli transformada com o
plasmídeo PRSETA (cDNA de His-Drg11)
Clone 3
IPTG(mM) 2 1 0,5
0
2
Clone 2
1 0,5
0
KDa
200
116
97
66

Uma banda de peso
molecular de cerca de
100 KDa foi induzida.
Pode representar a T7
RNA Polimerase.

Na zona de peso
molecular esperado (31
KDa) encontrou-se uma
banda de 26 KDa .
45
31
21
SDS-PAGE com amostras do extracto
proteico da E. Coli transformada com o
plasmídeo PGEX (cDNA de GST-Drg11)
Clone 2
IPTG(mM) 2 1 0,5
0
Clone 1
2 1 0,5
0
KDa
200
116
97
66

Não se observou nenhuma
banda de 56 KDa.

Provavelmente não ocorreu
indução.
45
31
21

Aparentemente não houve indução da transcrição
do cDNA responsável pela produção da GSTDrg11, no entanto parece ter havido expressão da
His-Drg11. Para confirmar estas possibilidades:
Aplicou-se a técnica imunoblotting:

Repetiu-se o SDS-PAGE;

Fez-se um Western blotting;

Incubou-se com o anticorpo antiDrg11 disponível.
Membrana de nitrocelulose do plasmídeo
PRSETA (cDNA de His-Drg11)
KDa
200 –
116 –
97 –
66 –
45 –
31 –
21 –
0
Clone 2
0,5
1
2
0
Clone 3
0,5
1
2 IPTG(mM)
Membrana de nitrocelulose do plasmídeo
PGEX (cDNA de GST-Drg11)
KDa
200 –
116 –
97 –
66 –
45 –
31 –
21 –
0
Clone 1
0,5
1
2
0
Clone 2
0,5
1
2 IPTG(mM)

Com bases nos resultados obtidos, conclui-se
que não ocorreu a expressão das proteínas
His-Drg11 e GST-Drg11.
Razões para a falta de expressão da Drg11



Condições de indução:
 Concentrações de IPTG insuficientes;
 Temperatura e tempo de indução inadequados.
As proteínas a obter podem ter tido um efeito
tóxico nas bactérias utilizadas.
Reconhecimento destas proteínas como sendo
estranhas pelas bactérias e, consequente, proteólise
das mesmas.
Sugestões para trabalhos futuros





Selecção de outra estirpe de E. Coli;
Utilização de um meio de cultura diferente;
Variação das condições de indução;
Fazer nova transformação bacteriana;
Tentativa de expressão destas proteínas por formas
truncadas.
Bibliografia
Alberts B, Jonhson A; Lewis J; Raff M; Roberts K;
Walter P. Molecular Biology of the Cell. 4ª edição,
Garland Science, 2000.
Cooper, GM. The cell, a molecular approach. 2ª
edição, Sinauer Associates, Inc., 2000.
www.invitrogen.com
www.amershambiosciences.com
Agradecimentos
Serviço de Histologia e Embriologia Abel Salazar
pelo espaço e material disponibilizado;
 Professor
Doutor Carlos Reguenga pela
orientação facultada ao longo do trabalho;
 Professora
Doutora Deolinda Lima pela
oportunidade de realizar um trabalho laboratorial.
