Deconstrução por Enzimas 2:
Celulase
PROPRIEDADES DAS ENZIMAS CELULOLÍTICAS
MECANISMO GERAL :
Hidrólise do laço b-1,4glicosídico por um
mecanismo de catálise
ácido-base, com
retenção ou inversão da
configuração do C
anomérico
Mecanismo de reação
Reaçao de hidrólise via mecanismo ácido-base envolvendo dois
resíduos, um catalisador ácido e um nucleófilo
.
Glu-555
Glu-555
Asp-201
Asp-201
Catalytic mechanism of C. thermocellum endoglucanase CelD as a paradigm of b-glucanase acting
(Beguin and Aubert, 1992))
Resíduos de aminoácidos envolvidos na
catálise de celulases e xilanases de T.
reesei
O que governa a hidrólise enzimática da celulose?
• Cristalinidade da celulose
• Área superficial
•Tamanho das partículas
•Presença de outros componentes (xilana/lignina)
• Grau de polimerização
• Porosidade do material
• Tamanho da partícula
• Adsorção de enzimas
• Inibição pelo produto
• Sinergismo
Indice de Cristalinidade
Ajuda na diferenciação e classificação dos polímeros celulósicos
Como medir?
Ic = 1 – Iam
I002
1) Celulose amorfa é hidrolisada preferencialmente?
Cristalinidade aumenta com a hidrolise enzimática
2) A hidrólise de celulose amorfa produz mais
açúcares solúveis?
Fica dificil separar os efeitos (cristalinidade, DP, área
superficial, tamanho de partícula)
Area superficial e cristalinidade
Medida da área superficial da celulose
Simons (1950) - TAPPI
• Coloração diferencial com dois corantes (azul e
laranja) para investigar a fibrilação e danos
mecânicos de fibras refinadas
Direct Blue 1 (992.82 Da)
Direct Orange 15 (corante polimérico)
Yu et al. (1995) - TAPPI
• O corante laranja (HMW) possui maior afinidade pela celulose que
o corante azul
• 455 nm é o máximo de absorção do corante laranja, e 624 nm,
máximo de absorção do corante azul
• No entanto, o corante laranja só se ligará à celulose se os poros
do material forem maiores ou iguais a 5 nm
• A quantidade do corante laranja adsorvido dá informações sobre a
celulose acessível
• A combinação da adsorção dos dois corantes dá informações
sobre a porosidade do material
Retenção de água e técnica de exclusão de soluto
Ponto de Saturação de Fibra e Valor de Retenção de Água como
Parâmetros Indicativos da Reatividade da Celulose
•Em 1944, G. Jayme introduziu a medida do valor de retenção de água
(WRV) para mensurar a hornificação de polpas celulósicas
•O cálculo do WRV utiliza os valores em massa da quantidade de água que
a fibra consegue reter, sendo que a perda da capacidade de retenção de
água é atribuída à ocorrência de hornificação no material.
•Em 1996, Bendzalova e colaboradores observaram que o WRV também é
uma boa estimativa do ponto de saturação da fibra, ou seja, permite
determinar se um determinado material apresenta ou não maior volume de
poros em relação a outro.
1. A técnica de exclusão de solutos
Stone and Scallan
(1968)

Sonda 4 = 5000 Da

Sonda 5 = 10000 Da
Sonda 6 = 20000 Da

Cf(1) < Cf(2) < Cf(3) < Cf(4)

Cf(4) ≈ Cf(5) ≈ Cf(6)

Inacessible water (mL/g)

Baseada na acessibilidade de diferentes
materiais a moleculas de soluto com diferentes
massas molares...
Probe size (Å)
agua
Lignina + Hemicelulose
Celulose
2. Determinação do valor de retenção de água (WRV)
•
As amostras imersas em água destilada por 24 h com cerca de 1% (m/m) de
teor de sólidos, e então centrifugadas a 4500 rpm por 15 min à 25 ºC.
•
secas até peso constante em estufa à 105ºC. Utilizando o valor das massas
da amostra úmida e seca em estufa, o WRV foi calculado pela equação 2:
Onde, m0 é a massa de bagaço úmido, e m1 a massa de bagaço seco em estufa
Determinação do ponto de saturação da fibra (FSP)
• um corpo poroso úmido apresenta seus poros completamente cheios
de água.
•quando adicionado a ele uma solução de solutos pequenos, o
esperado é que boa parte destes solutos se difunda para dentro dos
poros de tamanho maior ou igual ao seu, equilibrando a concentração
dentro e fora dos poros e consequentemente acarretando numa
redução no valor
O FSP foi determinado utilizando a equação (Ishizawa et al.,
2007):
W é a massa da solução,
q é a massa de água na amostra,
p é massa seca da amostra,
Ci e Cf são as concentrações inicial e final da solução de dextrana,
respectivamente.
Pontos de saturação da fibra (FSP), valores de retenção
de água (WRV) e conversões de celulose (CC) de
amostras de bagaço in natura e deslignificadas por 1 e 4
horas.
CC (%)
FSP (mL/g)
WRV (%)
In natura
0,91
99,10
12,5
Deslignificado 1h
1,21
140,91
52,6
Deslignificado 4h
2,09
188,84
81,7
Amostra
Sinergismo
1. Endo-exo
2. Exo-exo
3. Intramolecular
Artigos:
1) Effect of Cellulase Mole Fraction and Cellulose Recalcitrance on
Synergism in Cellulose Hydrolysis and Binding
Tina Jeoh, David B. Wilson,and Larry P. Walker
Biotechnol. Prog. 2006, 22, 270-277
2) Synergism between corn stover protein and cellulase
YeJun Han, HongZhang Chen
Enzyme and Microbial Technology 41 (2007) 638–645
Enzimas de Trichoderma reesei
Inibição de B-glucosidase
Adsorção de celulase em EPMS
(Biotechnol. Prog. 2007, 23, 398-406)
Modelo de Langmuir
C- concentração de celulase livre (mg/ml)
T - celulase adsorvida (mg/g substrato)
Tmax - max celulase adsorvida (mg/g substrato)
K - cte Langmuir (ml/mg enzima)
T max - 54,77 mg/g substrato, K - 4,53 ml/g
Kr (coef. Distribuição) = Tmax x K
Efeito da lignina na dessorção de celulases
20 FPU de cellucast e 2% Avicel