Prevenção do Parto Prematuro Espontâneo
Associado à Infecção Intra-Uterina:
marcadores biológicos e ensaio clínico de probióticos
Letícia Krauss (NATS/FIOCRUZ)
outubro 2009
Equipe da pesquisa
•Letícia Krauss Silva – ENSP;NATS/FIOCRUZ (coord.)
•Maria Elisabeth Lopes Moreira – IFF; NATS/FIOCRUZ
•Mariane Branco Alves- UERJ
•Alda Maria Cruz - IOC
•Antônio Luiz Almada Horta
•Alcione Moraes Braga (Pró-Cardíaco)
•Maria Rosa Rodrigues Batista – IFF
•Karla Gonçalves Camacho- NATS/ENSP
•Maria Rebelo Rezende
•Alcione Moraes de Souza Braga (Pró-Cardíaco)
•Fernando Antonio Ramos Guerra- IFF
Centros Colaboradores
Instituto Fernandes Figueira (FIOCRUZ/MS)
Maternidade Carmela Dutra (SMS/RJ)
Hospital Maternidade Alexander Fleming (SMS/RJ)
Unidade Integrada de Saúde Herculano Pinheiro (SMS/RJ)
Objetivos Gerais
do Estudo
• Avaliar a ocorrência de marcadores biológicos
selecionados e sua acurácia para predizer parto
prematuro associado à infecção intra-útero em
gestantes brasileiras;
• Avaliar a variação dos níveis dos marcadores
selecionados após o uso precoce de probióticos;
• Avaliar a eficácia e segurança do uso precoce de
probióticos
especialmente
elaborados,
em
grávidas portadoras de vaginose bacteriana ou
grau intermediário, no sentido de diminuir a
ocorrência de parto prematuro espontâneo e a
morbi-mortalidade
neonatal
decorrente
do
nascimento prematuro associado à infecção intrauterina.
Objetivos Específicos
do Estudo
• Determinar o pH vaginal e avaliar a presença de vaginose
bacteriana (score de Nugent), em mulheres grávidas,
assintomáticas e sem risco/indicação de parto prematuro
eletivo, durante o 2º trimestre da gestação;
• Avaliar a ocorrência do polimorfismo do TNF e do IL6 (174)
e os níveis de citocinas inflamatórias, inclusive de
fibronectina fetal, IL1 e IL6, na vagina e colo uterino no
grupo de mulheres referido em a ;
• Analisar a associação entre os marcadores avaliados nos
ítens a e b, e a associação desses marcadores com parto
prematuro e com
complicações da prematuridade e
infecção intra-uterina.
Probióticos
• Bactérias probióticas, por definição, são ingredientes alimentares
de micróbios vivos que têm um efeito benéfico à saúde humana
(Isolauri et al, 2003, FAO/ WHO, 2002).
• A correção das propriedades de uma microbiota endógena não
balanceada _ no caso, a manipulação da microbiota vaginal no
sentido de interromper o processo infeccioso/ inflamatório
(“alérgico”) que leva ao parto prematuro _ forma a racional da
terapia probiótica.
• Estudos indicam que a colonização transitória pode ser
importante e suficiente já que a microbiota não balanceada pode
ser corrigida por uma curta intervenção probiótica (Isolauri et al,
2003) o que pode ser relevante para o caso da VB na gestação.
• Por causa da natureza polimicrobiana da VB, a cura, o tratamento e
o manejo das recorrências são mais complexos que para muitas
outras doenças causadas por um único agente infeccioso (Famularo
et al, 2000).
• Os resultados insatisfatórios dos trabalhos de investigação sobre o
papel dos antibióticos no tratamento da vaginose bacteriana e na
prevenção do parto prematuro e danos neonatais e o conhecido
papel que tem a flora microbiana normal, estável, produtora de ácido
láctico, na prevenção de infecções vaginais reforçaram o interesse
no potencial da bacterioterapia com bactérias lácticas probióticas no
quadro da vaginose bacteriana e suas conseqüências.
• São antigas as evidências de que os lactobacilos protegem contra
infecções vaginais por produzir ácido láctico, mantendo assim um pH
de 4.0-4.5. Além disso, os lactobacilos inibem o crescimento de um
grande número de microorganismos oportunistas vaginais, incluindo
E.coli, Candida albicans, G.vaginalis, e Mobiluncus sp, por diminuir o
pH vaginal produzindo, além do ácido lático, peróxido de hidrogênio
(H2O2) e outros metabólitos inibitórios (Cauci et al, 2005, Famularo
et al, 2000).
• Muitos efeitos probióticos não são, todavia, relacionados
somente às mudanças da microbiota, como indicado por
culturas. Realmente, uma parte importante dos efeitos
benéficos dos probióticos está relacionada aos seus efeitos
imunomoduladores: aumento da atividade imunológica assim
como da atividade anti-inflamatória (Isolauri et al, 2003).
• Todavia, as incertezas sobre os mecanismos envolvidos na
imunidade vaginal e sobre o conjunto de características
metabólicas, além de outras, das bactérias a serem usadas
como probióticos, adicionam dificuldades ao desenho de
intervenções eficazes e seguras relacionadas não só à VB mas
também aos desfechos parto prematuro e morbidade neonatal
(Famularo et al,2001).
• O tratamento ecológico da VB através da colonização da
vagina com lactobacilos exógenos é atraente e apresenta
plausibilidade biológica tanto para a VB quanto para o parto
prematuro, e os resultados até agora dos ensaios sobre a sua
eficácia para resolver o problema VB, embora relativamente
pequenos, são consistentes e bastante favoráveis. Todavia, a
eficácia dos probióticos para as conseqüências da VB, parto
prematuro e morbidade neonatal, embora plausível, não foi
estudada.
O probiótico utilizado no projeto foi o desenvolvido
e testado por Reid e colaboradores
• Lactobacillus rhamnosus GR-1
• Lactobacillus reuteri RC-14
Segurança dos probióticos
• Além dos atributos desejáveis do ponto de vista da eficácia dos
probióticos anti VB, já referidos aderência às células epiteliais da
vagina, apoptose de micróbios patogênicos, produção de H2O2 e de
bacteriocinas antagônicas ao crescimento de microorganismos
atípicos, e atividade anti-TH2 _ um probiótico para a VB precisa ser
seguro.
• Os lactobacilos e bifidobactérias são considerados geralmente, em
princípio, seguros porque são componentes da flora comensal
humana e porque vem sendo há muito tempo utilizados na indústria
de alimentos e em duchas, inclusive por gestantes, sem efeitos
deletérios (de Vrese e Schrezenmeir, 2002, Reid, 1999, WHO, 2002).
• Embora os lactobacilos tenham sido identificados em culturas do
sangue e de outros órgãos, infecções por lactobacilos são raras
(Isolauri et al,2003).
Hemoculturas positivas para lactobacilos
ocorreram em 0.24% dos pacientes em um estudo finlandês e em
0,1% dos pacientes em um estudo francês, sendo que tais infecções
ocorreram em pacientes com imunodeficiência (de Vrese e
Schrezenmeir, 2002, Reid & Devillard,2004).
Os resultados do screening de marcadores
biológicos
e
de
probióticos
na
VB/Intermediária permitirão:
• avaliar seu uso como uma nova proposta
tecnologica de tratamento precoce da
vaginose bacteriana em nosso meio e
• subsidiar o desenho de estratégias eficientes
de screening para diminuir a ocorrência de
partos prematuros e conseqüências neonatais
associadas à infecção intra-uterina.
Triagem clínica no Pré-natal
• Avaliar se a gestante apresenta critérios de
exclusão que impossibilitem sua participação
no projeto.
• Identificação dos fatores de risco.
Critérios de Exclusão Absolutos
• Gestação múltipla;
• Incompetência ístmo-cervical (circlagem em gestação
atual);
• Feto com malformações congênitas maiores em
gestação atual;
• Diabetes Melitus insulino-dependente;
• Hipertensão Arterial sistêmica em uso de medicação.
• Sem história de HÁ mas com PA com sistólica >=150 e
diastólica >=110, repetindo-se os índices em decúbito
lateral
Critérios de Exclusão Absolutos
• Antibioticoterapia após a 8ª semana da gestação atual,
inclusive por suspeita clínica de infecção urinária baixa;
• Diagnóstico de sífilis ou gonorréia na gestação atual;
• Asma requerendo terapia intermitente ou crônica;
• Corticoterapia recente (até um mês antes)/contínua;
• Doença hemolítica perinatal;
• Lupus Eritematoso Sistêmico.
Critérios de Exclusão Relativos
• Sangramento vaginal
sangramento prévio.
ativo,
não
considerar
• Suspeita clínica de vaginose bacteriana ou
tricomoníase (queixa de secreção aumentada e
coceira, ardência ou odor): deve ser realizado
exame especular para a confirmação diagnostica.
Caso positivo a gestante deve ser tratada
conforme a rotina do serviço e excluída do estudo.
Caso negativo, deverá ser admitida no estudo;
Exame clínico
• Exame clínico ginecológico para avaliação:
 pH vaginal.
 Colheita de material vaginal para análise do
Nugent e citocinas inflamatórias .
 Colheita de material de mucosa oral para
genótipo.
Avaliação do pH vaginal
• É a determinação da “acidez” do ambiente vaginal que
está relacionada com a composição da flora vaginal
• Colocação da paciente em posição ginecológica para
realização de exame clínico especular.
• Medição do pH vaginal aplicando fita medidora de pH
no terço médio da parede lateral da vagina utilizando
pinça de Cherron para direcionar a aplicação da fita.
Avaliação do pH vaginal
• Verificação do pH vaginal através da
comparação da cor obtida com o padrão do
pH.
• Anotação do mesmo em cartão anexo ao kit
de coleta imediatamente após sua verificação.
Avaliação do pH vaginal
• Em caso de pH vaginal > 4,5 a paciente será
submetida a coleta de material vaginal para
bacterioscopia (Nugent) e análise de citocinas
inflamatórias além de material de mucosa oral para
genótipo.
• Em caso de pH vaginal < 4,5 na primeira consulta, na
consulta subsequente, caso a paciente ainda apresente
IG < 19semanas e 06dias deve ter o pH novamente
avaliado de forma semelhante. (repescagem)
Colheita de secreção vaginal para o Nugent
• Com a paciente em posição ginecológica e com
espéculo estéril alocado no canal vaginal, introduzir
swab seco em parede lateral da vagina (terço médio
com o superior), mantendo-o por 10 segundos.
• Aplicar conteúdo obtido em lâmina de vidro com área
fosca previamente identificada.
• Acondicionar lâmina em recipiente plástico igualmente
identificado.
Coleta de secreção vaginal para citocinas
inflamatórias
• 1. Identificar o tubo (eppendorf) com nome completo
da gestante, data e hora da colheita de material e
data de nascimento.
• 2.Iniciar procedimento com gestante em posição
ginecológica e com espéculo descartável não
lubrificado devidamente introduzido e posicionado
no canal vaginal.
• 3.Posicionar swab de poliéster (Dacron) estéril,
haste de plástico no ostio do cervix da gestante.
Manter swab alocado no óstio por 10(dez) segundos
para obter saturação.
• 4. Retirar o swab e cortar sua haste (com tesoura)
num comprimento que permita sua colocação dentro
do eppendorf
• 5. Acondicionar o swab depois de cortado no
eppendorf com solução tamponada de fosfato
(400microL, diluição final 1:5).
• 6. Imediatamente após a colheita do material
biológico e vedação do eppendorf, este deverá ser
transportado para o freezer do projeto, na unidade
( -20°C).
• 7. Esta operação deve ser realizada para um 2º
swab.
Coleta de mucosa oral para avaliação
de genótipo
•
•
•
Esfregar a ponta do cotonete na mucosa oral
por cerca de 15 segundos.
Introduzir a ponta contendo o material
biológico dentro do tubo eppendorf
Cortar a haste do cotonete (com tesoura)
para possibilitar o fechamento do tubo de
acondicionamento.
Coleta de mucosa oral para
avaliação de genótipo
• Identificar o tubo com nome completo da gestante,
data e hora da colheita de material e data de
nascimento.
• Posicionar o eppendorf em caixa para estocagem de
tubos de criopreservação.
• Guardar a -20° C.
A repescagem
• Resgate de mulheres que na 1ª consulta foram
excluídas devido a pH < 4,5 ou Nugent (-).
• A idade gestacional no momento da nova análise do
pH e coleta de material para Nugent e marcadores
biológicos deve ser inferior a 19 semanas e 6 dias.
Consulta Pós-randomização
Consulta Pós-tratamento
Banco de Dados
Prevenção do Parto Prematuro Espontâneo
Associado à Infecção Intra-Uterina: Ensaio
Clínico de Probióticos
TELA DE IDENTIFICAÇÃO
1º ATENDIMENTO
Aderência ao estudo
Aderência ao estudo em novembro
Devolução de frascos
90%
80%
70%
60%
50%
80%
(83)
40%
20%
(21)
30%
20%
10%
0%
Sim
Não
Aderência ao estudo em novembro
Devolução de frascos por maternidade
100%
90%
CD
80%
83%
(15)
70%
60%
50%
69%
(20)
83%
(35)
MAF
87%
(13)
HP
IFF
31%
(9)
40%
30%
17%
(3)
20%
17%
(7)
10%
0%
Sim
Não
13%
(2)
Aderência ao estudo novembro
Aderência autodeclarada ao final do tratamento
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
85%
(88 )
autodeclarada
Não
7
7%
Parcial
9
9%
Sim
88
85%
total
104
1
7%
(7)
9%
(9)
Não
Parcial
Sim
Aderência ao estudo
Aderência contabilizada ao final do tratamento
com base na devolução de frascos
70%
60%
50%
58%
(47)
40%
30%
20%
10%
9%
(7)
5%
(4)
15%
(12)
14%
(11)
Regular
Boa
0%
Duvidosa
Ruim
Ótima
Classificação de aderência:
Ótima=>85%
Boa=70-85%
Média=50-70%
Ruim=<50%
Aderência ao estudo
novembro
Contabilizada
Declarada
Duvidosa
Ruim
N
P
S
Total
Regular
Boa
Ótima
Total
2
3
5
40,00%
60,00%
100%
16,67%
27,27%
6,17%
1
2
1
1
2
7
14,29%
28,57%
14,29%
14,29%
28,57%
100%
14,29%
50,00%
8,33%
9,09%
4,26%
8,64%
6
2
9
7
45
69
8,70%
2,90%
13,04%
10,14%
65,22%
100%
85,71%
50,00%
75,00%
63,64%
95,74%
85,19%
7
4
12
11
47
81
8,64%
4,94%
14,81%
13,58%
58,02%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Distribuicao de NUGENT no Primeiro atendimento
(randomizadas ou não) n= 1302
25,0%
Percent
20,0%
15,0%
10,0%
5,0%
0,0%
0
1
2
3
4
5
Nugent_at1
6
7
8
9
10
Resultados
Validação citocinas
1. Os testes funcionaram;
2. As curvas padrão ficaram dentro do limite recomendável pelo
teste e as citocinas foram detectadas nas amostras.
3. Tanto as citocinas IL1b quanto IL-ra foram quantificadas no
material biológico examinado. Tendo em vista os limites mínimo
e máximo de detecção dos testes, bem como associados com
dados existentes na literatura quanto a quantificação de IL1B, optou-se por utilizar a diluição 1:2.
4. Quanto a IL-1ra, não houve material suficiente para realizar a
quantificação de todas as pacientes e assim optamos por utilizar
apenas a metade do kit, com apenas um pouco por ponto e não
em duplicata.
5. As amostras analisadas excederam o limite de detecção do
teste, mesmo na diluição 1:2. Ainda temos uma quantidade de
testes para analise, o que nos permitira repetir o experimento
agora utilizando diluções maiores.
Curva de análise IL-1B
10
9
8
Score de Nugent
7
R2 = 0,1439
6
Série1
5
Linear (Série1)
4
3
2
1
0
0
200
400
600
IL-1B pg/ml
800
1000
análise IL-1B
Em 40 casos analisados foi encontrada
correlação entre o score de Nugent (0-10) com
a concentração de IL-1B, com R2= 0.27.
Resultados Neonatais
Desfecho
Placebo
Intenção de Tratar
PP [28S, 30S)
1
PP [30S, 32S)*
Total
Total (%)
0
1
0,2%
0
1
1
0,2%
PP [32S_ 34S)**
5
2
7
1,1%
PP <34S
6
3
200%
9
1,4%
PP [34S, 37S)
9
7
129%
16
2,5%
RN A TERMO
302
301
603
96,0%
TOTAL
317
311
628
100,0%
* ADERÊNCIA DUVIDOSA
** UMA GESTANTE NÃO ADERENTE
RR