METODOLOGIA DE DETECÇÃO DE GLÚTEN
Instituto Adolfo Lutz
Divisão de Bromatologia e Química
Serviço de Alimentos
Seção de Doces e Amiláceos
Rejane Weissheimer de Abreu
[email protected]
Por que da ADVERTÊNCIA nos rótulos dos alimentos, em
relação à presença ou ausência de glúten
RWA
DOENÇA CELÍACA
Intolerância às proteínas provenientes do trigo, centeio, aveia e cevada
proteína do trigo = Glúten = glutenina + gliadina
Pro-Ser-Gln-Gln-Pro
Frações proteícas solúveis em álcool
PROLAMINAS
TRATAMENTO
Alimentação totalmente isenta de glúten
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LEGISLAÇÃO
Lei Federal nº 8543/1992
Determinou a impressão de advertência em rótulos e embalagens de
alimentos industrializados que contenham glúten ou apresentem em
sua composição trigo, centeio, malte, cevada, aveia e/ou seus
derivados.
Resolução RDC nº 40/2002
Estendeu a obrigatoriedade da advertência “CONTÉM GLÚTEN” em
caracteres com destaque, nítidos e de fácil leitura também as
bebidas embaladas.
Lei nº 10.674/2003
Obriga as inscrições “CONTÉM GLÚTEN” ou “NÃO CONTÉM GLÚTEN”
para os produtos alimentícios comercializados, como medida
preventiva e de controle da doença celíaca.
RWA
IMPLANTAÇÃO
Implantação de métodos analíticos sensíveis e específicos para
detecção de glúten em alimentos.
Testes Imunológicos
Parceria BQ e BM
Projeto FAPESP
Objetivo: desenvolver metodologia
Comparação ELISA in house x kit comercial ω gliadina
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ELISA
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EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos: balança, pHmetro, agitador de tubos (PHOENIS), agitador
orbital (FANEM), misturador digestor de líquidos (HEIDOLPH) e centrífuga (CELM)
RWA
Lavadora de placas
Wellwash 4 – Labsystems
Leitora de placas
Multiskan Ascent - Labsystems
RWA
RWA
PADRÕES DE CONTROLE
Glúten de trigo (gluten from wheat)
SIGMA –– G5004
Gliadina (Gliadin): SIGMA – G-3375,
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KITS
TRANSIA PLATE PROLAMINS
DIFFCHAMB – Art. N◦ PR0320
RIDASCREEN® GLIADIN
R BIOPHARM - Art. N◦ R7001
RWA
Amostras do teste de gliadina:
controle negativo, controle A e controle B (positivas)
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KIT PARA ELISA
COMPOSIÇÃO: ω GLIADINA e R5
 Placa de microtitulação com 12 tiras (96 alvéolos) sensibilizada com:

* anticorpo anti-ω gliadina (ω gliadina)

* pentapeptideo (R5)
 Padrão de gliadina liofilizada e padrões prontos
 Controles alto, médio e baixo
 Conjugado peroxidase anti-gliadina (peroxidase ligada a anticorpo
monoclonal de rato Anti-ω gliadina) diluído em PBS
 Substrato TMB concentrado (tetrametilbenzidina)
 Solução de lavagem concentrada (tampão Tris-salino)
 Solução diluente concentrada (PBS com gelatina e timerosal)
 Solução finalizadora (ácido fosfórico 25%).
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DOT
A
DOT ELISA NA DETECÇÃO DE GLIADINA
B
C
D
E
F
G
H
Linhas A – H: Diluição seriada ½ .
Colunas: 1) Curva-padrão gliadina; 2, 3 e 4) Padrões glúten 3000, 400 e 160ppm;
5) Amostra FAPAS; 6) Sopa de feijão com macarrão; 7) Grão de cevada; 8, 9 e 10)
Amido de milho, sopa de vegetais e Arroz - controle negativo
RWA
CODEX ALIMENTARIUS
Alimento naturalmente sem glúten até 20ppm
Mistura de alimentos naturalmente sem glúten até 100ppm
RWA
Dot ELISA
DETECÇÃO DE GLIADINA EM ALIMENTOS INDUSTRIALIZADOS
N.º
ALIMENTO
ELISA (ppm)
Dot ELISA
ROTULAGEM
1
Sopa de abobrinha
34
-
2
Sopa de carne
44
-
3
Sopa de mandioquinha
ND
-
4
Sopa de três queijos
ND
-
5
Sopa de galinha
ND
-
6
Caldo de carne
ND
-
7
Pipoca
ND
-
8
Macarrão
ND
-
9
Leite
ND
-
Não
10 Creme de arroz
ND
-
Contém
11
Amido de milho
ND
-
Glúten
12 Creme de milho
ND
-
13 Biscoito sequilho
ND
-
14 Soja
ND
-
15 Lasagne
ND
-
16 Farinha de mandioca
ND
-
17 Sêmola de milho
ND
-
18 Farinha de arroz
ND
19 Caldo de carne
54
-
2393
+++
745
+++
22 Sopa de cebola
2996
+++
Contém
23 Centeio
1704
+++
Glúten
24 Cevada
ND
-
2679
+++
247
-
20 Sopa de feijão e macarrão
21 Biscoito maisena
25 Biscoito integral aveia e mel
26 Farinha de aveia
ND = Não detectável – Abaixo dos limites de quantificação (10ppm)
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DESAFIOS
1. Composição do alimento – diferença entre as matrizes
quantidade e ingredientes do alimento interferem diretamente na
quantificação do analito
VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA CADA ALIMENTO
2. Procedência dos ingredientes
3. Diferentes respostas ente os kits
Extração
Padrão
Referência
RWA
Resultados de controle interlaboratorial FAPAS para Mistura de pão seco (2712B)
e Misturas para bolo de chocolate (2733 A e B)
Material teste /kit
Valor de
consenso de
glúten
(mg/Kg)
Nº escores
dentro [z]≤2
Nº total de
escores
%
Intervalo
satisfatório
2712-B
R-Biopharm
35,4
21
23
91
22,7-48,2
2712-B
Tepnel & Transia
131,9
15
19
79
84,4-179,4
2733-A
R-Biopharm
7,12
21
23
91
-
2733-B
R-Biopharm
173
26
29
90
-
2733-B
Tepnel
61,1
5
5
83
-
2733-B
Neogen
177
11
11
100
-
PRIORIDADES





Profissionais capacitados
Padrões
Controles internos
Validação do método para os laboratórios
Comprovação do resultado com outro método
RWA
CONCLUSÃO
FONTE DE GLIADINA DOS INGREDIENTES
ELISA
PCR
SEQUENCIAMENTO
TRABALHO INTEGRADO
RWA
ALIMENTO
CVE
IAL
ANVISA
CVS
CELÍACO
EQUIPE
MULTIDISCIPLINAR
RWA
[email protected]
RWA