Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Efeito do Tratamento com Extratos Hidroalcólico e Cetônico
do Rizoma de Zingiber officinale (gengibre) no Modelo
Experimental de Pleurisia induzida por BCG em
camundongos.
Mário Oliveira Lima
São José dos Campos, SP
2003
Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Efeito do Tratamento com Extratos Hidroalcólico e Cetônico do
Rizoma de Zingiber officinale (gengibre) no Modelo Experimental
de Pleurisia induzida por BCG em camundongos.
Mário Oliveira Lima
Dissertação de mestrado apresentada
Programa
de
Pós-Graduação
em
no
Ciências
Biológicas, como complementação dos créditos
necessários para obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo A. B. Lopes Martins
São José dos Campos, SP
2003
L699
Lima, Mário Oliveira
Efeito do Tratamento com Extratos Hidroalcólico
e Cetônico
do Rizoma de Zingiber officinale (gengibre) no
Modelo
Experimental de Pleurisia induzida por BCG em
camundongos.
Autorizo, exclusivamente
para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total
parcial desta dissertação, por processo fotocopiador ou transmissão eletrônica.
Aluno: Mário Oliveira Lima
Data:27/01/2004
ou
Mário Oliveira Lima
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Rodrigo A. B. Lopes Martins (Orientador)
Prof. Dr. José Carlos Cogo (Presidente)
Prof. Dra. Simone Teixeira (Membro Externo – USP/SP)
Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco
Diretor do IP&D – UNIVAP
São José dos Campos, 20 de novembro de 2003
Dedicatória
Dedico esta dissertação à minha querida Fernanda, por toda a tolerância e esforço na
realização deste trabalho, e a minha linda Isabela, que faz com que a minha vontade de
vencer seja mais intensa a cada dia.
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, que me encaminhou sempre no sentido certo
Aos meus pais e irmãos, abrindo-me as portas da docência, oferecendo-me a
graduação.
Ao meu querido amigo, irmão e orientador Prof. Dr. Rodrigo Martins, por quem tenho
muito respeito e admiração. Agradeço pela paciência e atenção, e por todo o
aprendizado e confiança em mim depositada.
Em especial a minha querida amiga Patrícia Martins pela ajuda e compreensão. Muito
obrigado !!!!
Resumo
Extratos de planta têm sido usados por séculos como uma maneira popular de tratar
várias desordens da saúde. Durante os últimos dez anos o estudo desses extratos
atraiu a atenção dos farmacologistas devido à necessidade da descoberta de novas
drogas para velhas patologias. Gengibre, o rizoma do Zingiber officinale Roscoe
(Zinziberaceae), é um constituinte comum da dieta do mundo e dele foi relatado que
seus extrato apresentam algumas atividades farmacológicas. Aqui nós investigamos os
efeitos de dois extratos brutos diferentes - hidroalcólico e cetônico - de rizomas do
gengibre, no modelo de pleurisia, em camundongos, induzida por BCG. Nossos
resultados demonstraram que ambos extratos de Zingiber officinalle foram capazes de
reduzir significativamente a migração das células inflamatórias à cavidade pleural em
resposta à injeção de BCG. Entretanto, o extrato cetônico demonstrou um efeito mais
pronunciado na redução da migração celular.
Palavras-chaves: BCG; plantas medicinais; cavidade pleural; tuberculose
Abstract
Plant extracts have been used for centuries as a popular manner to treat several
health disorders. During the last ten years the study of those extracts has attracted the
attention of pharmacologists due to the necessity of new drugs discovery to old
pathologies. Ginger, the rhizome of Zingiber officinale Roscoe (Zingiberaceae) is a
commom constituent of diet worldwide and it has been reported that its extracts present
some pharmacological activities. Here we investigate the effects of two different crude
extracts, hydralcoholic and ketonic, of ginger rhizomes on the model of BCG-induced
mice pelurisy . Our results demonstrated that both extracts of Zingiber officinalle were
able to significantly reduce inflammatory cells migration to pleural cavity in response to
BCG injection. However, the ketonic extract demonstrated the most powerful effect in
reducing cell migration.
Keywords: BCG; Ginger; medical plants; pleural cavity; tuberculos
Índice
1- INTRODUÇÃO ...........................................................................................................................1
1.1 - A REAÇÃO INFLAMATÓRIA .................................................................................................1
1.1.1 – Mediadores Químicos do Processo Inflamatório ................................................3
1.4 - VASOS LINFÁTICOS NA INFLAMAÇÃO ..................................................................................9
1.3 –INFLAMAÇÃO E MIGRAÇÃO CELULAR ............................................................................... 10
1.4 – BCG E INFLAMAÇÃO ....................................................................................................... 13
1.5 – HISTÓRICO DO ZINGIBER OFFICINALE ............................................................................. 16
1.5.1 Descrição botânica, farmacológica e propriedades biológicas do gengibre.19
2 - OBJETIVOS .......................................................................................................................... 25
3 – MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 26
3.1 - ANIMAIS ............................................................................................................................ 26
3.2 - PREPARAÇÃO DE EXTRATO HIDROALCÓLICO E CETÔNICODO Z. OFFICINALE – .............. 26
3.3 - A INDUÇÃO DA PLEURISIA EM CAMUNDONGO................................................................... 27
3.4 - CONTAGEM TOTAL DE LEUCÓCITOS................................................................................. 27
3.5 - CONTAGENS DOS LEUCÓCITOS DIFERENCIAIS ................................................................. 28
3.6 - OS PRODUTOS QUÍMICOS E OS REAGENTES ................................................................... 28
3.7 - ANÁLISE ESTATÍSTICA....................................................................................................... 28
4 - RESULTADOS...................................................................................................................... 29
4.1 - O EFEITO DO EXTRATO HIDROALCÓLICO DO ZINGIBER OFFICINALE SOBRE O NÚMERO
TOTAL DE LEUCÓCITOS NA PLEURISIA INDUZIDAS POR
BCG EM CAMUNDONGOS ................... 29
4.2 - O EFEITO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DO ZINGIBER OFFICINALE SOBRE O NÚMERO
TOTAL DE LEUCÓCITOS MONONUCLEARES NA PLEURISIA INDUZIDAS POR
BCG EM
CAMUNDONGOS ......................................................................................................................... 30
4.3- O EFEITO DO EXTRATO HIDROALCÓLICO DO ZINGIBER OFFICINALE SOBRE O NÚMERO
TOTAL DE EOSINÓFILOS NA PLEURISIA INDUZIDAS POR BCG EM CAMUNDONGOS .................. 31
4.4 - EFEITO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DO ZINGIBER OFFICINALE SOBRE O NÚMERO
TOTAL DE NEUTRÓFILOS NA PLEURISIA INDUZIDAS POR
BCG EM CAMUNDONGOS................. 32
4.5 - O EFEITO DO EXTRATO CETÔNICO DO ZINGIBER OFFICINALEDO SOBRE O NÚMERO TOTAL
DE LEUCÓCITOS NA PLEURISIA INDUZIDAS POR BCG EM CAMUNDONGOS.............................. 33
4.6 - O EFEITO DO EXTRATO CETÔNICO DO ZINGIBER OFFICINALE SOBRE O ACÚMULO DE
CÉLULAS MONONUCLEARES NA PLEURISIA INDUZIDAS POR BCG EM CAMUNDONGOS........... 34
4.7 - O EFEITO DO EXTRATO CETÔNICO DO ZINGIBER OFFICINALE SOBRE O ACÚMULO TOTAL
DE
EOSINÓFILOS NA PLEURISIA INDUZIDAS POR BCG EM CAMUNDONGOS............................. 35
4.8 - O EFEITO DO EXTRATO CETÔNICO DO ZINGIBER OFFICINALE SOBRE NÚMERO TOTAL DE
NEUTRÓFILOS NA PLEURISIA INDUZIDAS POR BCG EM CAMUNDONGOS ................................. 36
5 - DISCUSSÃO......................................................................................................................... 37
6 - CONCLUSÕES..................................................................................................................... 41
7 – REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 42
Lista de Gráficos
Gráfico 1A: Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato Hidroalcoólico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número total de leucócitos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
Pg.29
Gráfico 1B: Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato Hidroalcólico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número de células Mononucleares na pleurisia em
camundongos induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em
seis animais. Pg.30
Gráfico 1C: Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato Hidroalcoólico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número de Eosinófilos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
Pg.31
Gráfico 1D: Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato Hidroalcoólico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número de Neutrófilos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
Pg.32
Gráfico 2A:
Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato cetônico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número total de leucócitos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
Pg.33
Gráfico 2B:
Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato cetônico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número de células Mononucleares na pleurisia em
camundongos induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em
seis animais. Pg.34
Gráfico 2C:
Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato cetônico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número total de Eosinófilos
na pleurisia em
camundongos induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em
seis animais. Pg.35
Gráfico 2D:
Efeito da administração intraperitoneal da raiz do Extrato cetônico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número de Neutrófilos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
Pg.36
Lista de Figuras
Figura 01: Processo de vasodilatação e alteração de permeabilidade vascular,
que ocorrem classicamente na fase aguda do processo inflamatório. Pg.5
Figura 02: Fotomicrografia de mastócitos, principal célula armazenadora de
Histamina e Serotonina em Humanos e Roedores, respectivamente. Pg.6
Figura 03: Cascata do Ácido Araquidônico, que leva a produção de mediadores
inflamatórios clássicos, envolvidos no Fenômeno da Inflamação. Pg.8
Figura 04: Mecanismo de “rolling” de leucócitos, até o momento de sua fixação e
preparação para o processo de transmigração. Pg.11
Figura 05: Mecanismo de adesão e transmigração de leucócitos, demonstrando
a expressão de moléculas de adesão até o momento de sua fixação e preparação
para o processo de transmigração. Pg.12
Figura 06: Composição da parede bacteriana das micobactérias do complexo
MTC, que representam o verdadeiro fator de virulência destas bactérias. Pg.15
1
1 - Introdução
1.1 - A Reação Inflamatória
A reação inflamatória representa um conjunto de reações locais e gerais
do organismo contra uma agressão. Ela é composta de uma série de fenômenos
complexos que se associam e se complementam uns aos outros formando uma
reação em cascata. A resposta inflamatória visa, em última instância, combater o
agente
agressor
e
eliminar
produtos
resultantes
da
destruição
celular,
promovendo condições ideais para a reparação do tecido lesado.
Quando um tecido sofre uma injúria ou lesão, ocorre uma reação local
que denominada de inflamação. Primeiramente, duas teorias foram postuladas,
no sentido de caracterizar a reação inflamatória: a) Teoria Humoral – a resposta
inicial partiria do sangue e dos fluidos teciduais, que contém sistemas enzimáticos
complexos, responsáveis por diversos eventos relacionados a reação inflamatória;
b) Teoria Celular – Alternativa a Teoria Humoral - postulada por Metchnikoff,
afirmava que as células brancas que apareciam durante a Reação Inflamatória
eram as responsáveis pela proteção do organismos contra infecções.
O fato da inflamação ser produzida por diferentes irritantes e manter
características uniformes, levou a sugestão de que os sintomas são causados por
mensageiros químicos gerados no local da reação, e que são agora conhecidos
como mediadores químicos da inflamação.
A reação que ocorre durante as primeiras horas após a injúria é
independente da natureza do agente nocivo, sendo a resposta bastante similar,
mesmo após uma grande variedade de estímulos. As principais mudanças
observadas envolvem basicamente 03 processos:
2
1)
Mudança do calibre do vaso, e do fluxo da microcirculação, que leva à
uma vasodilatação arteriolar.
2)
Aumento da permeabilidade vascular que leva a formação de exudato
rico em proteínas e edema local.
3)
Migração de leucócitos do sangue circulante para o local da lesão.
Estes leucócitos têm função decisiva no combate ao estímulo lesivo, não somente
devido a sua função fagocitária, como também pela produção e liberação de
mediadores químicos (DALE, 1984)
Atualmente já se sabe que o sistema nervoso e fatores endócrinos também
interferem
agudamente
na
reação
inflamatória
(GARCIA-LEME,
1985;
FOREMAN, 1987).
A resposta inflamatória parece ser, na verdade, parcialmente mediada por
componentes (sistemas enzimáticos) presentes nos fluidos corporais como:
Sistema de coagulação; Sistema fibrinolítico; Sistema calicreína-cininas; Sistema
complemento (LEWIS, 1986).
A inflamação pode ser aguda, de duração relativamente curta (minutos,
várias horas ou poucos dias), ou crônica (de maior duração).
Os sinais clínicos da inflamação aguda são calor, rubor, tumefação e dor.
Isso ocorre devido ao aumento do fluxo sangüíneo, e ao aumento da
permeabilidade vascular, a infiltração de leucócitos, a liberação de agentes
álgicos e, principalmente, devido aos efeitos induzidos pelos mediadores
inflamatórios.
3
Os
mediadores
podem
originar-se do plasma das células ou
possivelmente do tecido agredido. E podem ser divididos nos seguintes grupos
(COTRAN et al., 1991):
Ø
Aminas vasoativas: histamina e serotonina.
Ø
Proteases plasmáticas:
- O sistema (cinina bradicinina e calicreína);
- O sistema complemento (C3a; C5a; C5b-C9);
-O
sistema
coagulação-fibrinolítico
(fibrinopeptídios,
produtos
de
degradação da fibrina).
Ø
Metabólitos do ácido araquidônico (AA):
- Via ciclooxigenase (endoperóxidos, prostaglandinas, tromboxane);
- via lipoxigenase (leucotrieno; HPETE; HETE).
Ø
Constituintes lisossômicos (proteases).
Ø
Radicais livres derivados do oxigênio.
Ø
Fatores ativadores das plaquetas (PAF).
Ø
Citocinas.
Ø
Fatores de crescimento.
1.1.1 – Mediadores Químicos do Processo Inflamatório
Aminas Vasoativas
As
duas
aminas,
histamina
e
serotonina
(5-hidroxitriptamina), são
especialmente importantes porque estão disponíveis em reservas pré -formadas e
constituem os primeiros mediadores a serem liberados durante a infl amação.
4
A Histamina é amplamente distribuída nos tecidos, sendo armazenada
principalmente nos mastócitos, que estão normalmente presentes no tecido
conjuntivo adjacente aos vasos sangüíneos. Também é encontrada em basófilos
e plaquetas. A histamina pré -formada está presente nos grânulos dos mastócitos
e é liberada por degranulação destas células em resposta a uma variedade de
estímulos, tais como: 1) lesão física como traumatismos, frio ou calor; 2) reações
imunes envolvendo anticorpos; 3) fragmentos do complemento denominados
anafilotoxinas; 4) proteínas de liberação da histamina derivadas de leucócitos; 5)
neuropeptídeos; 6) citocinas (interleucina 1 e 8);
No ser humano, a histamina causa dilatação arteriolar e aumento da
permeabilidade vascular das vênulas. É considerada o principal mediador da fase
imediata de aumento de permeabilidade vascular, produzindo lacunas venulares.
Na verdade, o aumento da permeabilidade dos vasos sangüíneos no sítio
inflamatório é condição primordial para permitir a subseqüente migração de
células de defesa (leucócitos) para o local da inflamação.
No entanto, este
processo permite não somente a transmigração de células inflamatórias de dentro
dos vasos sangüíneos para o tecido, como também o extravazamento de
proteínas plasmáticas, como a albumina. Por sua vez, o extravazamento de
proteínas plasmáticas para o tecido induz um aumento da pressão osmótica em
direção ao tecido, forçando também o extravazamento de líquido, acarretando o
edema inflamatório. (ver esquema a seguir).
5
Figura 01: Processo de vasodilatação e alteração de permeabilidade vascular,
que ocorrem classicamente na fase aguda do processo inflamatório.
6
Após estabelecido o edema inflamatório, o sistema linfático deverá se
encarregar da drenagem do conteúdo extravasado, fazendo com que as
condições normais sejam restabelecidas ao final de todo o processo.
A serotonina é um segundo mediador vasoativo pré-formado com ações
semalhantes
as
da
histamina.
Está
presente
em
plaquetas
e
células
enterocromafins, e nos mastócitos de roedores. A liberação de serotonina de
plaquetas é estimulada quando estas se agregam após contato com colágeno,
trombina, ADP e complexos antígeno-anticorpo. A agregação e liberação
plaquetárias também são estimuladas pelo Fator de Ativação Plaquetária (PAF),
proveniente dos mastócitos durante reações mediadas por imunoglobulinas.
Deste modo, a reação de liberação plaquetária resulta em aumento da
permeabilidade durante reações imunológicas (COTRAN, R.S., KUMAR, V. &
COLLINS, T., 2000).
Figura
02: Fotomicrografia
de
mastócitos,
principal
célula
armazenadora
de
Histamina e Serotonina em Humanos e Roedores, respectivamente.
7
Sistema de Cininas
As cininas, representadas pela bradicinina, Lys-bradicinina e Met-Lysbradicinina, são peptídeos vasoativos potentes liberados a partir de substratos
protéicos, denominados cininogênios, pela ação de certas proteases, conhecidas
genericamente como cininogenases (ANTUNES, 2001,APUD TIBIRIÇÁ, 2001). A
bradicinina é um potente agente que aumenta a permeabilidade vascular. É
também responsável pela contração do músculo liso, dilatação dos vasos
sangüíneos e dor, quando injetada na pele (COTRAN, R.S., KUMAR, V. &
COLLINS, T., 2000).
Metabólitos do Ácido Araquidônico (AA): Prostaglandinas e Leucotrienos
Quando as células são ativadas por diferentes estímulos, os lipídeos da
membrana são rapidamente remodelados para dar origem a mediadores
biologicamente
ativos,
os
quais
servem
como
sinais
intracelulares
ou
extracelulares. Os produtos do AA participam de uma série de processos
biológicos, incluindo inflamação e hemostasia. São mais bem vistos como
autacóides (ou ainda eicosanóides), ou hormônios locais de curto alcance, que
uma vez formados, exercem seus efeitos localmente e, então, decompõem-se
espontaneamente ou são destruídos de maneira enzimática.
Os eicosanóides são sintetizados por duas classes principais de enzimas:
a) ciclooxigenase, originando prostaglandinas e tromboxano; b) lipooxigenase,
originando leucotrienos; (ver esquema a seguir). Os eicosanóides podem mediar
praticamente todas as etapas da inflamação. São encontrados em exsudatos
inflamatórios, e sua síntese é aumentada em locais de inflamação. Agentes
estruturalmente
distintos
que
podem
suprimir
a
atividade
da
enzima
8
ciclooxigenase
(aspirina,
nimesulida,
indometacina,
meloxicam,
piroxicam,
denominados antiinflamatórios não esteroidais) são capazes de inibir o processo
inflamatório in vivo.
A via da enzima ciclooxigenase leva à geração de prostaglandinas (PGD 2,
PGE2, PGF 2 , PGG e PGH etc.). Como as prostaglandinas desempenham um
importante papel no processo inflamatório, uma interferência em sua síntese
determina uma sensível redução nas alterações proporcionadas pela inflamação
(BAKHLE E BOTTING, 1996), visto que a inibição da síntese de prostaglandinas é
o mecanismo de ação de muitos antiinflamatórios não-hormonais. (INSEL, 1996
APUD GOODMAN E GILMAN,1996;)
Figura 03: Cascata do Ácido Araquidônico, que leva a produção de mediadores
inflamatórios clássicos, envolvidos no Fenômeno da Inflamação.
9
Estudos em reação inflamatória e o desenvolvimento de novas drogas ou
terapias sempre dependeram da existência de modelos animais apropriados.
Apesar da maioria das doenças inflamatórias severas apresentar natureza
crônica, os modelos de inflamação aguda são importantes e necessários
(SEDGWICK E LESS, 1986).
1.4 - Vasos Linfáticos na Inflamação
O sistema de vasos linfáticos e linfonodos filtram e policiam os líquidos
extravasculares. Juntamente com o sistema de fagócitos mononucleares,
representam uma segunda linha de defesa que entra em ação sempre que uma
reação inflamatória local não consegue conter e neutralizar o agente causador da
lesão.
Os vasos linfáticos são canais extremamente delicados e difíceis de serem
visualizados em secções teciduais comuns pois se colapsam prontamente. São
revestidos
por endotélio delgado e contínuo com junções celulares frouxas e
superpostas, membrana basal escassa e ausência de sustentação muscular,
exceto nos ductos maiores. O Fluxo linfático na infl amação é aumentado, e
parece ser o grande responsável pela drenagem do líquido do edema do espaço
extravascular. Não apenas líquido, mas também leucócitos e restos celulares
chegam a linfa. Válvulas estão presentes nos vasos linfáticos permitindo que o
conteúdo linfático flua apenas no sentido proximal. (COTRAN, R.S., KUMAR, V. &
COLLINS, T., 2000).
10
1.3 –Inflamação e Migração Celular
Os eventos que ocorrem na fase aguda da inflamação estão intimamente
relacionados, e culminam em seu objetivo primordial que é o transporte de
leucócitos para o local da lesão. Os leucócitos têm importância fundamental na
ingestão e destruição de agentes ofensivos como bactérias, micobactérias e
outros microorganismos, assim como na degradação de tecidos necróticos e
antígenos estranhos ao organismo. Leucócitos circulantes são capazes de migrar
dos vasos sangüíneos para os tecidos, tanto em situações normais como
patológicas. É bem aceito que a migração de leucócitos, a partir do sistema
vascular, ocorre por um processo em várias etapas ditadas pela ativação
seqüencial de proteínas adesivas e seus ligantes em ambas células endoteliais e
leucócitos (para revisão ver WAGNER E ROTH, 2000). Monócitos, linfócitos e
polimorfonucleares, migram através de mecanismos similares, mas diferem
quanto a suas respostas a fatores quimiotáticos e inflamatórios, particularmente
quanto a aspectos qualitativos e quantitativos da expressão de moléculas de
adesão (DRANSFIELD et al., 1992; SPRINGER, 1994; AGER, 1996; LI et al.,
1996). O Início da migração ocorre com a “captura” pela parede vascular, dos
leucócitos polimorfonucleares (PMNs) do sangue circulante, seguido do fenômeno
denominado “rolling” (Figura 04) ao longo da parede vascular. Este processo de
“marginação” é o comportamento normal de PMNs circulantes. Apenas após
estímulos apropriados, é que os leucócitos que estão “rolando”, fixam-se ou
aderem-se firmemente as células endoteliais e estão, pois, posicionados para a
migração para o tecido. A captura e a aderência dos PMNs, ao longo das paredes
dos vasos, é possível devido a ligação reversível destas células a moléculas
11
adesivas glicopotéicas transmembrana, denominadas “selectinas”, encontradas
tanto nas células endoteliais quanto nos próprios leucócitos (BEVILAQUA &
NELSON, 1993; ALBELD A et al., 1994; LUSCINSKAS & LAWER, 1994;
CROCKETT-TORABI & FANTONE, 1995; TEDER et al., 1995; PARA REVISÃO
VER WAGNER E ROTH, 2000).
O sinal que inicia o próximo passo - adesão firme - é postulado ser um
evento mediado por receptor em resposta a citocinas inflamatórias, ou um evento
propagado por sinais de selectinas ativadas (CROCKETT-TORABI & FANTONE,
1995; SIMON et al., 1995; ZIMMERMAN et al., 1996; MCEVER & CUMMINGS,
1997; WILLIAMS & SOLOMKIN, 1999;). Desta forma, as selectinas podem
promover a transição ordenada para o processo de adesão através da indução da
expressão de integrinas, culminando com o sucesso da migração celular (Figura
05).
As Integrinas pertencem a um grupo de glicoproteínas heterodiméricas
encontradas em PMNs e outras células hematopoiéticas que medeiam a interação
célula-célula e célula-matriz extracelular (HYNES, 1992; LUSCINSKAS & LAWER,
1994;).
Figura 04: Mecanismo de “rolling” de leucócitos, até o momento de sua fixação e
preparação para o processo de transmigração (COTRAM et al., 2000).
12
Figura 05: Mecanismo de adesão e transmigração de leucócitos,
demonstrando a
expressão de moléculas de adesão.
13
1.4 – BCG e Inflamação
Em 1882, Robert Koch identificou o bacilo da tuberculose como o agente
etiológico de doenças infecciosas como uma importante causa de mortes da
época na Europa. Mesmo nos dias atuais, mais pessoas morrem pela infecção
por Mycobacterium Tuberculosis, do que quaisquer outros patógenos.
As micobactérias, especialmente Mycobacterium Tuberculosis, estão entre
os
microorganismos
dramaticamente
causadores
de
infecções
que
vem
aumentando
sua ocorrência com morte no mundo (CHRÉTIEN, 1995).
Supõe-se que 60 milhões de pessoas sofram da tuberculose ativa, e
aproximadamente um terço da população total do mundo é infectado por M.
tuberculosis. No Brasil, 100.000 novos casos de tuberculose são relatados
anualmente (INGE ET AL., 1993; ARRUDA ET AL., 1998;). A infecção da
tuberculose é causada por M. tuberculosis , M. bovis
ou pelo M. africanum.
Devido à próxima relação filogenétic a e patogênica, as três espécies foram
agrupadas como o complexo M. tuberculosis (MTC) e são considerados agentes
etiológicos permutáveis da tuberculose em humanos e animais ( MENEZES-DELIMA-JÚNIOR HENRIQUES, 1997;)
A resposta imune humana encontrada na tuberculose é controlada
principalmente pela imunidade celular através de células-T ativadas (KAUFMANN,
1995), conduzindo a uma potencialização do mecanismo micobactericida de
macrófagos
através
da
produção
de
IFN-gama
(FLYNN et
al.,
1993).
Recentemente, MOHAMMED et al., (2003) observou que os pacientes com
tuberculose pulmonar desenvolvem efusão pleural com altos índices de proteína.
As junções mesoteliais aderentes pleurais promovem a adesão mesotelial célula14
célula e contribuem para a integridade pleural. Os autores sugerem que na
pleurisia por
tuberculose, a micobacteria causa a liberação do fator de
crescimento de endotélio vascular a partir de células mesoteliais e conduzem a
exudação de proteína por alteração das proteínas da junção de aderência entre
células mesoteliais.
Em 1997, MENEZES-DE-LIMA-JÚNIOR et.al., caracterizaram a reação de
pleurisia induzida pelo bacilo Mycobacterium bovis Calmette-Guerin (BCG) em
camundongos e investigaram o papel de mediadores químicos e de citocinas no
acúmulo dos granulócitos induzidos por BCG em 24h. A injeção intratorácica de
BCG em camundongos, é capaz de induzir uma reação inflamação bifásica com
acúmulo intenso de leucócitos em 24h e após 15 dias. Os neutrófilos foram
observados em maior número na cavidade pleur al em 4 e em 24h, enquanto que
células mononucleares e eosinófilos foram observados após 24h. Uma nova onda
de migração de células (neutrófilos e mononucleares) foi observada após 15 dias.
Em outro grupo de experimentos, MENEZES-DE-LIMA-JÚNIOR et al. (1997b)
observaram que a chegada dos neutrófilos começou após 2h da infecção, e o pico
de migração ocorreu em 4h. Neste tempo os neutrófilos foram encontrados
ingerindo micobactérias, exclusivamente em altas doses infectantes.
15
Figura
06: A
figura
06
ilustra a
composição
da
parede
bacteriana
das
micobactérias do complexo MTC, que representam o verdadeiro fator de virulência destas
bactérias.
A ocorrência de cepas resistentes a terapias multidrogas, e a ameaça da
expansão da AIDS fazem com que o problema da tuberculose seja altamente
preocupante no mundo, e a procura por novas drogas contra essa patologia é de
interesse crescente. O ressurgimento da tuberculose no mundo desenvolvido,
combinado com a magnitude da epidemia em todo o mundo, torna imperativo
proje tar uma estratégia coesiva para a prevenção, para os tratamentos e à
pesquisa de novas drogas (MENEZES-DE-LIMA-JÚNIOR, 1997). Neste contexto,
as substâncias obtidas de plantas podem constituir novas fontes de drogas para a
16
ameaça da tuberculose. Nos últimos dez anos, o estudo de extratos de plantas
tem aumentado, atraindo a atenção dos farmacologistas devido à necessidade da
descoberta de novas drogas para as velhas patologias, incluindo as doenças
infecciosas.
1.5 – Histórico do Zingiber officinale
Os extratos de planta têm sido utilizados por muitos séculos, de maneira
popular para curar diversas patologias. Durante as últimas décadas, o estudo dos
considerados “produtos naturais” vem ganhando impulso no Brasil, principalmente
com o objetivo de explorar melhor a riqueza de nossa biodiversidade, e oferecer
alternativas mais baratas de medicamentos, para as populações mais carentes.
Deve-se ressaltar que somente aproximadamente 30% da população brasileira
tem acesso a medicamentos industrializados, em função dos altos preços
praticados no Brasil.
Desta maneira, seguindo indicações seculares, assim como resultados
prévios obtidos em nosso laboratório, vimos estudando uma planta de alto
potencial terapêutico em diversas patologias.
Ginger, o rizoma do Zingiber
officinale Roscoe (Zinngiberaceae), originário do sudeste asiático e artificialmente
introduzido no Brasil, por volta de 1500, é um componente comum da alimentação
em diversos países do mundo, e há muito é conhecido por suas propriedades
medicinais.
São os rizomas desta espécie que constituem o verdadeiro gengibre doce
do comércio ("rizoma gingiberis", dos farmacêuticos), especiaria muito apreciada
e já conhecida na Europa no tempo de Dioscórides, isto é, há cerca de 2.000
17
anos. O seu encontro, no estado silvestre, no sudeste da Ásia e no arquipélago
Malaio, confirma ser originária da Ásia tropical, onde a sua cultura tem grande
importância, não somente para o consumo local da densíssima população
indígena de tão vasta parte do globo, como também para a exportação destinada
a países ocidentais que absorvem grandes quantidades. Embora desde época
muito remota a Europa recebesse sempre o GENGIBRE mais como droga do
que como condimento, o qual lhe chegava após a longa viagem pelo mar
Vermelho e o golfo Pérsico, foi o descobrimento do caminho marítimo para a
Índia, realizado por Vasco da Gama em 1490, que deu à cultura e ao comércio
deste produto um impulso formidável: os navios portugueses regressavam da
Índia com grandes carregamentos do rizoma de GENGIBRE e a procura deste,
sendo intensa, levou os lavradores das vizinhanças dos vários portos do Malabar
a aumentarem suas plantações. Esse impulso jamais cessou desde então, não
obstante a planta haver sido introduzida em todos os outros países tropicais,
principalmente nas Antilhas e na costa oriental da América Central e da América
do Sul, em todos os quais se achava naturalizada e sub-espontânea, sendo que
em alguns deles tomou notável desenvolvimento (Pio Corrêa, XXXX).
O GENGIBRE contém, entre diversas outras substâncias, o gingerol, resina
mole com a densidade de 1,090, que é o princípio ativo, além de sub -resina,
matéria extrativa, goma, alta porcentagem de amido, matéria azotada, o
sesquiterpeno "zingibereno" e óleo volátil amarelo esverdeado, muito aromático,
este na porcentagem de 1.075 a 3.00 %, e com densidade variável, pelo menos
conforme a procedência (0,830 a 0,878 na Jamaica, 0,885 nas Filipinas, 0, 893 no
Brasil); o croma particular da planta deve -se ao óleo volátil, cujo ponto de ebulição
18
ascende a 246o, tendo o índice de refração N 30° D-1.4830 e o índice de
Saponificação 14. Uma antiga análise que conhecemos (Pio Corrêa, XXXX), que
encontrou nos rizomas procedentes de Calcutá (Índia) a seguinte Composição:
49.34% , de amido, 13.44%, de matéria indeterminada, 9.60 % de água, 7.45 %
de celulose, 7.02 % de cinzas, 6.30 % de albuminóides, 4.58 % de óleo fixo e
resina. 2.27 % de óleo volátil e 1.01% de nitrogênio.
O óleo essencial é complexo (canfreno direito. felandreno e cineol), tendo
emprego na indústria da perfumaria. A maior parte dos rizomas exportados da
China, da Cochinchina, da Índia, do Ceilão, da Jamaica, da Serra Leoa e de
outros países, é consumida pela indústria na Inglaterra, nos Estados Unidos e na
Alemanha,
e em menor escala por outras nações. Nas duas primeiras, o
GENGIBRE entra, em quantidades consideráveis, na fabricação de várias bebidas
refrigerantes, principalmente da "ginger-ale", de reputação mundial, e da 'gingerbeer" ou cerveja de gengibre. Quantidades menores, porém ainda elevadas. são
absorvidas pela "Jamaica ginger", das Antilhas; pelo forte licor "khaung" dos
chineses, pela "ingwerbier' dos alemães e pela gengibirra dos portugueses, esta
também outrora fabricada no Brasil.
O extrato alcoólico do gengibre serve, em gra nde escala, para aromatizar
águas gasosas e outras bebidas e o pó faz parte da composição do famoso "caril"
indiano, agora adaptado à cozinha de todos os povos civilizados. Compota e
vários outros doces de GENGIBRE, de que os ingleses e norte -americanos fa zem
um consumo formidável, são preparados na China, na India, nas Filipinas e um
pouco mais nas Antilhas. No Brasil, este rizoma serve apenas à confecção de
várias gulodices, tais como a cocada de gengibre", a "amoda" (doce feito com
19
farinha e rapadura), o 'pé de moleque" e a "cramônia", uma mistura com melaço e
farinha de mandioca. Os portugueses do século XVI também já faziam doce de
gengibre. Mas parece que preferiam o rizoma preparado em salada. cortado em
pedacinhos e misturado a outras verduras. Os no ssos sertanejos dão o nome de
“Cachaça queimada" à aguardente de cana em que infundem rizomas de
GENGIBRE.
1.5.1 Descrição botânica,
farmacológica e
propriedades biológicas
do gengibre.
Descrição Botânica
Gengibre – Zingiber Karst (Amomum Zingiber L ., Curcuma longifolia Wall,
Z. aromaticum Noronha, Z. majus Rumph., Z. missionis Vall., Z.officinale Roscae),
da família das Zingiberáceas.
Erva de rizoma perene, reptante, articulado,
anguloso e muito ramoso, de 1-2 cm de espessura, ligeiramente achatado,
carnoso, revestido de epiderme rugosa, amarelada ou pardacenta, tendo na parte
superior, pequenos tubérculos anelados e muito aproximados, resultantes da
base dos antigos caules aéreos, e na parte inferior numerosas raízes adventicias,
cilíndricas, brancas e carnosas; caules eretos, de 30 –120 cm de altura,
guarnecidos de bastantes folhas dísticas, sendo as basilares reduzidas a simples
bainhas glabras e estriadas no sentido longitudinal; as bainhas superiores,
amplixiculares na base, terminam com um limbo séssil, linear, lanceolado,
acuminado, até 28 cm de comprimento e 3 cm de largura, com numerosas
punctuações translúcidas e nervuras secundárias finas, aproximadas e paralelas,
partindo da nervura média e dirigindo-se muito obliquamente para ápice do limbo,
20
sendo que no ponto de junção deste com a bainha há uma lígula bífida,
prolongada
lateralmente
em
duas
aurículas;
flores
verde-amareladas,
hermafroditas, zigomorfas, dispostas em espigas ovóides ou elipsóides, de 4-6
cm, no ápice; brácteas florais surbobiculares, às vezes obovadas, até 25 mm,
esverdeadas, frequentemente com as margens amareladas, punctuadas de roxo,
cada uma envolvendo uma só flor curto-pedicelada; cálice de 1 cm, 3 denteado,
corola com tubo de 2 cm e lobos lanceolados, agudos; tabelo ovado- oblongo,
purpúreo e com punctuações amarelas, mais curto que os lobos da corola; fruto
cápsula 3-locular, abrindo-se em três valvas; sementes azuladas e com albúmen
carnoso. (CORREA, 1984)
Atividade Farmacológica Relatada – Etnofarmacologia
Há 2000 anos a Europa já conhecia esta planta, ou pelo menos o seu
rizoma. Desde então, até a Idade média, a “droga” foi se tornando cada vez mais
conhecida e fazia parte das fórmulas terapêuticas mais complicadas, como são os
electuários, “diaphoenix”,
diascordium”
theriaga, além de outros menos
importantes, conhecidos como tônicos diaforéticos.
Dessa última época em
diante, talvez mesmo na primeira década do Século XVI, as virtudes medicinais
do gengibre foram relegadas a segundo plano, passando então a ocupar lugar de
destaque como: condimento, aromático e carminativo. Trata-se mesmo de um
condimento estimulante dos órgãos digestivos, considerado indispensável, para
tal fim, pela população de vários países tropicais.
Na atualidade apenas tem emprego, internamente, como sialagogo, últil
contra
as
dispepsias
atônitas
acompanhadas
de
cólicas
flatulentas
e,
21
externamente, como odontálgico e revulsivo (CORRÊA,1984; KASAHARA et
al.,1983; YAMAHARA et al.,1988; PHILLIPS et al., 1993). Tem grande apreço
para combater as afecções reumáticas, (SRIVASTAVA E MUSTAFA, 1989,1992),
paralisia, beribéri, cólera mobus, e o catarro crônico.
Na África do Norte o gengibre é considerado afrodisíaco. A verdade é que,
a despeito de tantas restrições, os farmacêuticos continua m preparando vários
produtos com o precioso rizoma: eletuários, emplastros, extratos etéreo
(piperoidina de gengibre ou zingiberina), infusão, pastilhas, pílulas, pós, etc. Estes
últimos, em contacto com a membrana pituitária, provocam espirros; colocados
sobre a língua, desenvolvem saliva abundante e ingeridos isoladamente, causam
ardor no estômago. São, entretanto, um bom corretivo da ação dos purgantes
drásticos, por isso mesmo julgados indispensáveis na Inglaterra para associar aos
purgantes destinados as crianças lactentes.
Atividade Farmacológica Comprovada
Estudos mais recentes em laboratório (SERTIÉ et al., 1992), demonstraram
que o rizoma de Zingiber officinale (gengibre) foi capaz de reduzir lesões gástricas
induzidas por HCl / ethanol em ratos, assim como previnir atividade ulcerogênica.
O mecanismo pelo qual os extratos do gengibre são capazes de previnir
lesões
gástricas
induzidas
por
etanol
ainda
permanece
desconhecido,
necessitando de estudos adicionais. Dados não publicados demonstram que o
gengibre não altera o pH do suco gástrico, nem tampouco o volume secretado.
Experimentos iniciais ainda revelaram que os extratos de gengibre também não
alteram a motilidade uterina no modelo de útero isolado de ratas na fase de estro
22
fisiológico.
Estes resultados foram bastante promissores, levando a continuidade
dos trabalhos com o referido extrato. (SERTIÉ et al.,1992).
Após estes
resultados, um composto anti-ulcerogênico muito potente foi recentemente isolado
dos
rizomas
de
Z.officinale ( (+)-angelicoidenol-2-o-b-D-glicopiranoside; (
YOSHIKAWA et al., 1994).
CAO et al. (1993) reportaram uma atividade “scavenger” de ânions
superóxidos do extrato de gengibre. Atividade esta, confirmada em experimentos
realizados em nosso laboratório (dados não publicados). Além disso, SHARMA et
al. (1994) demonstraram que os produtos de gengibre administrados por via oral
por 26 dias foram capazes de suprimir significativamente a artrite induzida por
Mycobacterium tuberculosis. Em 1995, GUH e colaboradores demonstraram que
o gingerol isolado do extrato de Zingiber officinale foi capaz de inibir a agregação
plaquetária
induzida
por
ácido
araquidônico
e
colágeno. BHANDARI e
colaboradores (1998) demonstraram que o extrato de gengibre foi capaz de
reduzir os níveis plasmáticos de colesterol em coelhos alimentados com dieta
enriquecida com colesterol. O tratamento com extrato de gengibre foi capaz de
reduzir
significativamente
a
formação
de
placas
ateromatosas
quando
comparadas ao grupo controle. BORDIA et al., (1997) também demonstraram em
humanos, que a administração de uma dose diária de 10g por indíviduo foi capaz
de reduzir a agregação plaquetária induzida por diferentes agentes, sem alterar o
sistema fibrinolítico e os níveis de colesterol plasmático, e ainda, de reduzir os
níveis de colesterol plamático em pacientes hipercolesterolêmicos.
Recentemente,
trabalhos do nosso laboratório (PENNA et al., 2003)
demonstraram o efeito antiinflamatório do extrato de Zingiber officinale nos
23
modelos clássicos de edema de pata e edema de pele induzidos por diferentes
substâncias. Estes estudos demonstraram que o extrato alcoólico de Z.officinale
foi capaz de reduzir o edema de pata induzido por carragenina composto 48/80 e
serotonina, em ratos, além de se mostrar eficaz em reduzir também
significativamente o edema de pele em ratos, induzido por serotonina, de maneira
dependente da dose.
O estudo sugere que o efeito anti-edematogênico dos
extratos possa ser devido à um efeito de antagonizar os receptores de serotonina.
Propriedades Microbiológicas
Atividades antifúngicas
HABSAH et al., (2000), realizaram estudos para atividade antimicrobiana
de 13 espécies, da família Zingiberaceae, somente a espécie Costus discolor
mostrou forte atividade fungicidade para Aspergillus ochraceous.
YIN E CHENG (1998), demonstraram o efeito inibitório do extrato em
solução aquosa de várias especiarias, inclusive o gengibre, contra dois fungos
Aspergillus niger e Aspergillus flavus . O gengibre, no entanto, não mostrou
atividade.
RAMOS et al. (1996), demonstraram as propriedades mutagênicas de
plantas comumente utilizadas na medicina tradicional. Foi realizado um
“screening” para atividade genotóxica de 13
extratos de plantas medicinais
preparadas em solução alcoólica, usadas na medicina popular de Cuba e, entre
elas, o Zingiber officinale (gengibre). Os testes citogenéticos realizados não foram
significantes para o gengibre.
24
Atividades Antibacterianas
GUGNANI E EZENWANZE (1985) demonstraram que o extrato alcoólico
de gengibre, possui uma significante atividade antibacteriana contra Escherichia
coli, Proteus
Streptococcus
vulgaris, Salmonella typhymurium, Staphylococcus aureus,
viridans,
porém
apresentou
uma
fraca
atividade
para
Streptococcus faecalis e nenhuma atividade para Pseudomonas aeruginosa.
CHEN et al. (1985). demonstraram as propriedades antibacterianas de
algumas especiarias, inclusive do gengibre, onde os extratos passavam por um
tratamento de aquecimento. A raíz de gengibre apresentou atividade inibitória
somente para Micrococcus luteus . Todas as especiarias testadas perderam suas
atividades antibacterianas após aquecimento à 100º durante 20 minutos.
JANES et al. (1999). realizaram estudos com cepas de bactérias
produtoras de bacteriocinas isoladas das especiarias alho e gengibre. Algumas
substâncias foram analisadas, isoladas e identificadas.
No alho isolou-se o
Leuconostoc mesenteroides e na raíz de gengibre isolou o Lactococcus lactis,
ambas bacteriocinas foram inibidas por enzimas proteolíticas. A bacteriocina do
alho chamou-se de leucocin BC2 e a do gengibre de lactocin G13. A leucocin BC2
inibiu um pequeno espectro antimicrobiano, inibindo apenas as espécies Bacillus,
Enterococcus
e
Listeria.
A
lactocin
G13,
apresentou
amplo
espectro
antimicrobiano, inibindo as espécies: Bacillus, Clostridium, Listeria, Enterococcus,
Leuconostoc, Pediococcus e Sthaphylococcus.
Nenhuma das bacteriocinas
inibiu as bactérias Gram negativas testadas (JANE et al., 1995).
25
2 - Objetivos
O objetivo do presente estudo foi investigar a atividade anti -inflamatória de
dois extratos - cetônico e hidroalcoólico - de Zingiber officinale (gengibre) , mais
especificamente sobre a migração de leucócitos, utilizando para isto, o modelo
experimental de pleurisia induzida por BCG em camundongos.
26
3 – Materiais e Métodos
3.1 - Animais
Todos os experimentos foram realizadas de acordo com as normas do
comitê de ética Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ) em relação as exigências e
cuidados com os animais. Os experimentos foram realizados em camundongos
C57Bl/6, macho s, pesando entre 20 e 25 g mantidos em condições padrão de
temperatura (22-25ºC), e umidade relativa (40-60%) com do ciclo claro/escuro, e
livre acesso a comida e água. Os animais foram fornecidos pelo Biotério Central
da Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ). Todos os animais foram colocados em
uma caixa comum e divididos aleatoriamente em grupos de seis animais.
3.2 - Preparação de extrato hidroalcólico e cetônicodo Z. officinale –
O extrato do Z. officinale foi obtido como descrito previamente (SERTIE et
al. 1992). Momentaneamente, os rizomas do Z. officinale foram coletados no mês
de março na cidade de Caraguatatuba, estado de São Paulo e identificados pela
equipe de funcionários do herbarium do Departamento de Botânica, Instituto de
Biociências - Universidade de São Paulo (SP), Brasil. Material fresco (200 g)
foram descascados, cortados finamente e extraídos com 1000 ml do etanol de
70% (extrato de Zo) e 1000 ml de Me 2CO (extrato cetônico ZoK). Após 2 dias de
maceração ambos os extratos foram filtrados e concentrados sob a pressão
reduzida em 50ºC. O extrato de ZoK foi pulverizado (magnésio 1,0 equivalente a
magnésio 50,0 do rizoma fresco). A massa viscosa obtida do extrato de Zo foi
lipolizada (magnésio 1,0 equivalente a magnésio 16,7 do rizoma fresco). As
27
experimentações farmacológicas foram realizadas com o material seco dissolvido
em 0,9% salina.
3.3 - A indução da pleurisia em camundongo
A reação de pleurisia foi induzida por injeção intratorácica (i.t.) de 100
microlitros (8 x 10 6 bacilos) da solução agonista (BCG), pela técnica de
SPECTOR (1956) modificada por HENRIQUES et al., (1990) para camundongos.
Resumidamente, seringas de 1 mL com agulhas 13 x 5 foram utilizadas, sendo
adaptadas através do uso de um cursor, passando a medir aproximadamente 3
mm de comprimento. A agulha é introduzida do lado direito da cavidade torácica
dos camundongos para realização da injeção do estímulo, e um volume igual de
salina estéril (100µl) foi injetado nos animais do grupo controle.
O tratamento dos camundongo com extrato de Z. officinale foram
executados sempre por injeções intraperitoneais em diferentes doses, de ambos
extratos, após 30 minutos do desafio com BCG. Os extrato foram injetados
sempre no mesmo volume de 0,5 ml/cavidade peritoneal.
3.4 - Contagem total de Leucócitos
Após quatro horas do desafio com BCG, os animais foram sacrificados com
inalação do CO2. O tórax foi imediatamente aberto e a cavidade pleural lavada
com 1 ml de PBS heparinizado (20 IU.ml-1) e o volume total foi recuperado. A
contagem total das células da cavidade pleural foi realizada em câmara de
Neubauer, após diluição de 10 µl do líquido pleural em 390 µl da solução do turk
(1:40). O material coletado foi contado sob um microscópio óptico (ampliação de
10 X). Os resultados foram expressos em No total de células/cavidade.
28
3.5 - Contagens dos leucócitos diferenciais
Para a contagem diferencial de leucócitos, alíquotas de 100 µl da
suspensão celular foram utilizados para o preparo de citoesfregaço, com uso de
citocentríguga (Shandon) A coloração foi feita pelo método de Mayi -GrunwaldGiemsa e a contagem diferencial das células foi realizada em microscópio óptico
com objetivo de imersão em óleo, com aumento de 1.000 vezes. As populações
celulares avaliadas foram eosinófilos, neutrófilos e mononucleares.
3.6 - Os produtos químicos e os Reagentes
O BCG, cepa moureau (Fundação Ataulpho de Paiva Rio de Janeiro,
Brasil), foi gentilmente cedido pela Dra. Maria das Graças Henriques, da Unidade
FARMANGUINHOS da Fundação Oswaldo Cruz. O número dos mycobacteria
usados em todos os ensaios foi de 3 x 10 6 bacilos como descrito na literatura
(SILVA et al., 1985; TOMIOKA et al., 1996;).
3.7 - Análise estatística
Os dados foram expressos como a média + erro padrão da média (SEM).
Foi empregada a análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste do NewmanKeuls-Student. No caso de comparação entre dois grupos, a análise foi executada
pelo teste t de Student. Valores de p<0.05 foram considerados significativos.
Cada grupo experimental foi composto de 06 animais. Os gráficos representam a
média dos dados de três experimentos.
29
4 - Resultados
4.1 - O efeito do extrato hidroalcoólico do Zingiber officinale sobre o número total
de Leucócitos na pleurisia induzidas por BCG em camundongos
A injeção intrapleural de BCG em camundongos levou a um acúmulo intenso do
leucócitos dentro de 4 h (Fig. 1A). A administração intraperitoneal do extrato
hidroalcoólico do Zingiber officinale reduziu significativamente o número total dos
leucócitos (86 ± 5%) na dose mais elevada testada (180 mg/kg).
(10 6 células/cavidade)
Leucócitos Totais
7
.
5
Saline
5
.
0
2
.
5
0
.
0
Gráfico 1A:
BCG
BCG + Zo 20 mg/kg
BCG + Zo 60 mg/kg
BCG + Zo 180 mg/kg
*
O Efeito da administração intraperitoneal do Extrato Hidroalcólico do
Zingiber officinale(Zo) sobre o número total de leucócitos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
30
4.2 - O efeito do extrato hidroalcoólico do Zingiber officinale sobre o número total
de Leucócitos Mononucleares na pleurisia induzidas por BCG em camundongos
A injeção intrapleural de BCG em camundongos levou a um intenso acúmulo de
células Mononucleares na cavidade pleural dentro de 4 h (Fig. 1B). A administração
intraperitoneal do extrato hidroalcoólico do Zingiber officinale reduziu significativamente
o número total de células mononucleares (65 ±7 %) na dose mais elevada testada (180
5
(106 células/cavidade)
Células Mononucleares
mg/kg).
4
3
2
*
Sal
BCG
BCG + Zo 20 mg/kg
BCG + Zo 60 mg/kg
BCG + Zo 180 mg/kg
1
0
Gráfico1B: O Efeito da administração intraperitoneal do Extrato Hidroalcoólico do
Zingiber officinale (Zo) sobre o número de células Mononucleares na pleurisia em
camundongos induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em
seis animais.
31
4.3- O efeito do extrato hidroalcoólico do Zingiber officinale sobre o número total
de Eosinófilos na pleurisia induzidas por BCG em camundongos.
A injeção intrapleural de BCG nos camundongos foi capaz de induzir um
aumento discreto do número de eosinófilos que migraram para a
cavidade pleural
dentro de 4 h (Fig.1C). A administração intraperitoneal do extrato hidroalcoólico do
Zingiber officinale reduziu significativamente o número total de eosinófilos (75 ±5 %) na
dose o mais elevada testada (180 mg/kg).
(10 células/cavidade)
6
Eosinófilos
1.00
Saline
BCG
BCG + Zo 20 mg/kg
BCG + Zo 60 mg/kg
BCG + Zo 180 mg/kg
0.75
0.50
0.25
*
0.00
Gráfico 1C: O Efeito da administração intraperitoneal do Extrato Hidroalcoólico de
Zingiber officinale (Zo) sobre o número de eosinófilos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
32
4.4 - Efeito do extrato hidroalcoólico do Zingiber officinale sobre o número total
de Neutrófilos na pleurisia induzidas por BCG em camundongos.
A injeção intrapleural de BCG em camundongos levou a um intenso acúmulo de
neutrófilos na cavidade pleural dentro de 4 h (Fig. 1D). A administração intraperitoneal
do extrato hidroalcoólico de Zingiber officinale reduziu significativamente o número total
de neutrófilos
(51 ± 4, 38 ± 6 e
79 ± 9 %) nas doses de 20, 60 e 180 mg/kg,
respectivamente.
(10 células/cavidade)
6
Neutrófilos
4
Saline
BCG
BCG + Zo 20 mg/kg
BCG + Zo 60 mg/kg
BCG + Zo 180 mg/kg
3
2
1
*
*
*
0
Gráfico 1D: O Efeito da administração intraperitoneal do Extrato Hidroalcoólico do
Zingiber officinale (Zo) sobre o número de Neutrófilos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
33
4.5 - O efeito do extrato cetônico do Zingiber officinaledo sobre o número total de
Leucócitos na pleurisia induzidas por BCG em camundongos.
A injeção intrapleural de BCG em camundongo, foi capaz de induzir uma intensa
migração de leucócitos dentro de 4 h (Fig. 2A). A administração intraperitoneal do
extrato cetônico do Zingiber officinale reduziu significativamente o número total de
leucócitos (56 ± 6, 55 ± 4 e 44 ± 6 %) nas doses de 20, 60 e 180 mg/kg,
respectivamente.
5
.
.
5
0
*
*
2
.
5
0
.
0
*
Sal
BCG
BCG + ZoK 20 mg/kg
BCG + ZoK 60 mg/kg
BCG + ZoK 180 mg/kg
6
(10 células/cavidade)
Leucócitos Totais
7
Gráfico 2A: O Efeito da administração intraperitoneal do Extrato cetônico do Zingiber
officinale (ZoK) sobre o número total de leucócitos
na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. de seis animais.
34
4.6 - O efeito do extrato cetônico do Zingiber officinale sobre o acúmulo de
Células Mononucleares na pleurisia induzidas por BCG em camundongos.
A injeção intrapleural de BCG nos camundongos estimulou um acúmulo intenso
de células Mononucleares na cavidade pleural dentro de 4 h (Fig. 2B). A administração
intraperitoneal do extrato de cetônico do Zingiber officinale não produziu a redução
significativa do número total de células mononucleares nas doses usados neste
Células Mononucleares
6
(10 células/cavidade)
experimento.
4
3
2
Sal
BCG
BCG + ZoK 20 mg/kg
BCG + ZoK 60 mg/kg
BCG + ZoK 180 mg/kg
1
0
Gráfico 2B: O Efeito da administração intraperitoneal do Extrato cetônico do Zingiber
officinale (ZoK) sobre o número de células Mononucleares na pleurisia em
camundongos induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em
seis animais.
35
4.7 - O efeito do extrato cetônico do Zingiber officinale sobre o acúmulo total de
Eosinófilos na pleurisia induzidas por BCG em camundongos.
A injeção intrapleural de BCG nos camundongos estimulou um aumento
significativo no número de eosinófilos que migraram para a cavidade pleural dentro de
4 h (Fig. 2C). A administração intraperitoneal do extrato cetônico do Zingiber officinale
reduziu significativamente o número total do eosinófilos (93 ± 2, 95 ± 3 e 93 ± 3 %) nas
doses de 20, 60 e 180 mg/kg, respectivamente.
(10 células/cavidade)
Saline
BCG
BCG + ZoK 20 mg/kg
BCG + ZoK 60 mg/kg
BCG + ZoK 180 mg/kg
0.1
6
Eosinófilos
0.2
*
*
*
0.0
Gráfico 2C: O Efeito da administração intraperitoneal do Extrato cetônico do Zingiber
officinale (ZoK) sobre o número total de eosinófilos
na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
36
4.8 - O efeito do extrato cetônico do Zingiber officinale sobre número total de
Neutrófilos na pleurisia induzidas por BCG em camundongos.
A injeção intrapleural de BCG nos camundongos levou a um intenso acúmulo de
Neutrófilos dentro de 4 h (Fig. 2D). A administração intraperitoneal do extrato cetônico
do Zingiber officinale reduziu com muita significância o número total dos neutrófilos (98
6
Neutrófilos
(10 células/cavidade)
± 4, 79 ± 11, 77 ± 8 %) nas doses de 20, 60 e 180 mg/kg, respectivamente.
4
Saline
BCG
BCG + ZoK 20 mg/kg
BCG + ZoK 60 mg/kg
BCG + ZoK 180 mg/kg
3
2
*
1
*
*
0
Gráfico 2D: O Efeito da administração intraperitonial da raiz do Extrato cetônico do
Zingiber officinale (ZoK) sobre o número de Neutrófilos na pleurisia em camundongos
induzida por BCG. Os resultados são expressos na média ± S.E.M. em seis animais.
37
5 - DISCUSSÃO
A resposta imune humana contra a tuberculose é principalmente controlada pela
imunidade celular mediada pela ativação das células T (KAUFMANN, 1995),
conduzindo a mecanismos micobactericidas de macrófagos e ainda, a produção de
IFN-c (FLYNN et al., 1993). A pleurisia observada na tuberculose é considerado uma
condição clínica benigna, uma vez que há pacientes com infecção que são capazes
de se recuperar mesmo com ausência de tratamentos (STEAD et al., 1955). Nestas
circunstâncias, o compartimento pleural apresenta um exudato rico em células
inflamatórias, bem como de células imunes (BARNES et al., 1990, 1993) e fatores
solúveis não imunes (OCAÑA et al., 1986; COSTA et al., 1995). Enquanto a
tuberculose representa uma doença perigosa causada por uma bactéria intracelular,
nosso entendimento acerca das interações celulares e moleculares entre a
micobactéria e células hospedeiras está longe de ser completo. Os eventos iniciais
durante uma infecção pulmonar primária com o complexo de M. tuberculosis (MCT) são
pouco compreendidos e existem poucos modelos para se avaliar a seqüência de
eventos que seguem o primeiro contato do hospedeiro com a micobacteria. Neste
trabalho usamos a cavidade pleural do camundongo porque é um modelo direto e bem
estabelecido (HENRIQUES et al., 1990, 1996, BOZZA et al., 1994, MENEZES-DELIMA-JÚNIOR et al., 1997a).
A injeção de M. bovis BCG na cavidade pleural de camundongos induz uma
reação inflamatória bifásica intensa, com picos em 24h e 15 dias após o desafio. Em
4h ocorre um influxo dos neutrófilos, que é máximo em 24h. Neste tempo observa-se
38
também um influxo intenso de eosinófilos e células mononucleares. Um outro influxo de
leucócito é observado em 15 dias, composto por células mononucleares e alguns
neutrófilos (MENEZES-DE-LIMA-JÚNIORS et al., 1997a).
No presente trabalho, nós podemos observar que a injeção intratorácica de BCG
foi capaz de induzir um influxo significativo dos leucócitos para a cavidade pleural dos
camundongos após 4 horas. A administração intraperitoneal dos extratos cetônico e
hidroalcoólico de Z. officinale, 30 minutos após as injeções de BCG, foi capaz de
reduzir significativamente a migração de leucócitos, com ênfase no efeito de redução
observado para o número de neutrófilos. Os neutrófilos são os leucócitos
predominantes que
chegam aos locais de inflamação aguda, e são capazes de
defender o hospedeiro contra infecções bacterianas (MENEZES-DE-LIMA-JÚNIOR et
al., 1997b). O acúmulo de neutrófilos está também intimamente associado com a
formação de edema e com o recrutamento de outros leucócitos fagocíticos, tais como
os monócitos (NOURSHARGH, 1993). O influxo dos neutrófilos induzido por BCG
intratorácico está de acordo com a descrição da migração do neutrófilos na cavidade
peritoneal de coelhos inoculados com o BCG (APPELBERG, 1992) e na cavidade
pleural de coelho após instilação do BCG. Os neutrófilos liberaram os quimiotaxinas
induzidos por BCG recrutando monócitos. Estas respostas contribuem para a
formação do granuloma na pleurisia da tuberculose (ANTONY et al., 1985). Além disso,
os neutrófilos são descritos no exudato pleural de pacientes com tuberculose
(MONTGOMERY & LIMÃO, 1933). SAMPAIO et al., (2000) relataram que a endotelina,
agindo através dos receptores de ETA, exercem um papel no acúmulo tardio de
39
eosinófilos e de neutrófilos (24h), mas não na fase mais aguda (4h) da resposta dos
neutrófilos. O acúmulo de eosinófilos induzido por micobactéria é pouco descrito.
Embora a eosinofilia sejam observada em alguns trabalhos, no lavado bronco-alveolar
de pacientes com tuberculose (VIJAYAN et al., 1992, NAKAMURA et al., 1993), o
acúmulo de eosinófilos induzido por M. tuberculosis ou M. bovis BCG nos modelos
experimentais animais não foi, ainda,
bem caracterizado. As diferenças que
acontecem nas propriedades farmacológicas dos extratos hidroalcoólico e cetônico do
Z. officinale têm sido relatadas. SHARMA et al., (1997) observou que a atividade
antiemética de Z. officinale difere significativamente dos extratos aquosos, etanólico ou
cetônico. Os autores relataram que o extrato aquoso foi ineficaz para proteger contra
emese induzida por cisplatina, enquanto os extratos etanólico e cetônico foram
capazes de previnir a emese. Entretanto, o extrato cetônico foi claramente mais efetivo
na prevenção da emese induzida por cisplatina.
Estudos precedentes de nosso grupo demonstram o efeito antiinflamatório do
extrato hidroalcoólico dos rizomas do Zingiber officinale no edema do pata e de pele
em ratos (PENNA et al., 2003). Neste prévio trabalho nós sugerimos que a atividade
antiedematogênica do extrato pode estar relacionada, ao menos em parte, a um
antagonismo do receptor da serotonina, embora a via da ciclooxigenase possa também
estar envolvida no efeito antiedematogênico e edema de pata de ratos induzido por
carragenina. Isto porque o efeito inibitório é
observado desde a primeira hora da
reação, quando os produtos da ciclooxigenase são mediadores clássicos do fenômeno.
Como mencionado na introdução, outros autores relataram o importante efeito anti40
inflamatório do extrato Z. officinale e seus produtos. SHARMA et al., (1994) relatou que
o eugenol e o óleo do gengibre possuem potentes propriedades anti-inflamatórias e/ou
antireumáticas, usando um modelo de artrite crônica severa, em ratos, induzida pelos
bacilos de M. tuberculosis em parafina líquida. KIUCHI et al., (1992) relataram que os
rizomas de Z. officinale contêm potentes inibidores da biossíntese de prostaglandinas.
MONTREEWASUWAT et al., (1987) relataram anteriormente que as células do
granuloma de BCG secretam a prostaglandina F2 alfa (PGF2-alfa) espontaneamente,
ou produzem comparáveis níveis de PGF 2-alfa, após estimulação dos macrófagos no
exudato peritoneal. SHELLITO E SNIEZEK (1990) relataram também que a liberação
estimulada de prostaglandina E2 em ratos injetados com BCG- está aumentada durante
a lesão aguda de pulmão, mas a liberação estimulada do leucotrieno B4 foi diminuída
significativamente em todos os estágios do inflamação.
Os pacientes com tuberculose pulmonar desenvolvem efusões pleurais com um
índice elevado de proteínas. O BCG aumenta a liberação do fator de crescimento do
endotelial vascular (FCEV) a partir de células mesoteliais pleurais (CMP) e inibe a
produção
de
beta-catenina
(proteína
da
junção
aderente)
levando
a
uma
permeabilidade aumentada através da monocamada mesotelial (MOHAMMED et al.,
2003). Está bem estabelecido que a expressão de beta-catenina, é intimamente
relacionada aos prostanóides, mas a relação entre a infecção por BCG e os
prostanóides e a beta-catenina ainda é obscura.
41
6 - Conclusões
Nossos resultados demonstram claramente que os extratos cetônico e
hidroalcoólico de Z. officinale foram capazes de inibir significativamente a migração de
leucócitos para a cavidade pleural dos camundongos após a indução da pleurisia pela
injeção intratorácica de BCG, com ênfase no efeito do extrato cetônico sobre migração
de neutrófilos. Considerando esta importante atividade observada do Zingiber officinale,
esta espécie pode representar uma importante fonte de novos compostos e, no futuro,
auxiliar no tratamento da tuberculose.
42
7 – REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Ager A (1996). Regulation of lymphocyte migration into lymph nodes by high endothelial
venules. Biochem Soc Trans 25:421-428.
Albertda SM, Smith CW and Ward PA (1994).Adhesion molecules and inflammmatory
injury. Faseb J 8:504-512.
Antony V.B., Sahn SA, Antony AC, Repine JE 1985. Bacillus Calmette-Guerinstimulated neutrophils release chemotaxins for monocytes in rabbit pleural
spaces and in vitro. J. Clin. Invest. 76(4): 1514-21.
Appelberg R. 1992. Macrophage inflammatory proteins MIP-1 and MIP-2 are involved in
T-Cell mediated neutrophill recruitment. J. Leukoc. Biol. 52: 303-306.
Arruda S, Chalhoub M, Cardoso S, Barral-Netto M. 1998. Cell-mediated immune
responses and cytotoxicity to mycobacterial antigens in patients with tuberculous
pleurisy in Brazil. Acta Tropica 71: 1-15.
Bakhle, Y. S.; Botting, R. M. Cyclooxygenase-2 and its regulation in inflammation
mediators of inflammation,5 p. 305-323, 1996.
Barnes PF, Fong SJ., Brennan PJ, Twomey PE, Mazunder A, Modlin RL 1990. Local
production of tumor necrosis factor and IFN-gamma in tuberculous pleuritis. J.
Immunol. 145: 149-54.
Barnes PF, Lu S, Abrams JS, Yamamura M, Modlin RL 1993. Cytokine production at
the site of disease in human tuberculosis. Infect. Immun. 61: 3482-89.
Bevilacqua MP and Nelson RM (1993). Selectins. J Clin Invest 91:379-387.
43
Bhandari U, Sharma JN, Zafar R (1998). The protective action of ethanolic ginger
(Zingiber officinale) extract in cholesterol fed rabbits. J. Ethnopharmacol. 61(2):
167-171.
Bordia A., Verma S.K., Srivastava, K.C.: Effect of ginger (Zingiber officinale Rosc.) and
fenugreek (Trigonella foenumgraecum L.) on blood lipids, blood sugar and
platelet aggregation in patients with coronary artery disease. Prostaglandins
Leukot Essent Fatty Acids;56(5):379-84, 1997.
Bozza PT, Castro-Faria-Neto HC, Penido C, Laranjeira AP, Henriques, MGMO, Silva
PMR, Martins MA., Ribeiro-dos-Santos R, Cordeiro RSB. 1994. Requirement for
lymphocytes and resident macrophages in LPS-induced pleural eosinophil
accumulation. J. Leukoc. Biol. 56: 151-60.
Cao ZF, Chen ZG, Guo, P; Zhang SN, Lian LX, Tuo L, Huo WM. 1993. Scavenging
effects of ginger on superoxide anion and hydroxyl radical. Chung-Kuo-ChungYao-Tsa-Chih. 18(12): 750-764.
Chrétien J. 1995. Tuberculosis today. Eur. Resp. J. 8: 617s-619s.
Contran, R. S., Kumar, V., Collins, T. Robbins patologia estrutural e funcional ed.
Guanabara, Koogan p.1051, 2000.
Costa M, Quiroga, T, Cruz E. 1995. Measurement of pleural fluid cholesterol and lactate
dehydrogenase. Chest 108: 1260-63.
Crockett-Torabi A and Fantone JC (1995). The selections: Insights into selectin-induced
intracellular signaling in leukocytes. Immunol Res 14:237-251.
44
Dransfield I, Cabanas C, Barret J and Hogg N (1992). Interaction of leukocyte integrins
with ligand is necessary but not sufficient for function. J Cell Biol 116:1527-1535.
Fedder TF, Steeber DA , Chen A and Engel P (1995 a). The selectins: Vascular
adhesion molelules. Faseb J 9:866-873.
Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA, Bloom BR. 1993. An essential
role for interferon-gamma resistance to Mycobacterium tuberculosis. J. Exp. Med.
178: 2249-52.
Foreman D, ZUK L, Miller DB, Salomon RG.. Effects of E2 levuglandins on the
contractile activity of the rat uterus. Prostaglandins Jul;34(1):91-8, 1987.
Garcia Leme. J.; Hamamura, L.; Leite, M. P.; Rocha E Silva, M. Pharmacological
analysis of the acute inflammatory process induced in the rat´s paw by local
injection of carragenin and heating Br. J. Pharmac. 48, p.88-96, 1973.
Guh, J.H., Ko, F.N., Jong, T.T., Teng, C.M. 1995. Antiplatelet effect of gengibreol
isolated from Gengibre officinale. J. Pharm. Pharmacol. 47(4): 329-32.
Henriques MG, Weg VB, Martins MA, Silva PM, Fernandes PD, Cordeiro RS, Vargaftig
BB. 1990. Differential inhibition by two hetrazepine PAF antagonists of acute
inflammation in the mouse. Br J Pharmacol 99(1):164-8.
Inge E, Flesch A, Kaufmann HE. 1993. Role of Cytokines in Tuberculosis. Immunobiol.
189: 316-39.
Jigo Y, Suematsu M, Higashida T, Oheda JL, Matsumoto K, Wakabayashi Y, Ishimura
Y, Miyasaka M and Takashi T (1997). Constitutive expression of ICAM-1 in rat
45
microvascular systems analyzed by laser confocal microscopy. Am J Physiol
273:H138-H147.
Kaplan G, Freedman VH. The role of cytokines in the immune response to
tuberculosis.1996. Res Immunol. 147(8-9):565-72
Kasahara, Y., Saito, E., Hikino, H.: Shoyakugaku Zasshi. 37: 73, 1983.
Kaufmann SHE 1995. Immunity to intracellular microbial pathogens. Immunol. Today
16:338-42.
Kiuchi F, Iwakami S, Shibuya M, Hanaoka F, Sankawa U. 1992. Inhibition of
prostaglandin and leukotriene biosynthesis by gingerols and diarylheptanoids.
Chem. Pharm. Bull. 40(2): 387-91.
Li X, Abdi K, Rawn J, Mackay CR and Mentzer SJ (1996). LFA-1 and L-selectin
regulation
of
recirculating
lymphocyte
tethering
and
rolling
on
lung
endothelium.Am J Respir Cell Mol Biol 14:398-406.
Lusscinskas FW and Lawler J (1994). Integrins as dynamic regulators of vascular
function. Faseb J 8;929-938.
McEver RP and Cummings RD (1997). Role of PSGL-1 binding to selectins in leukocyte
recruitment. J Clin Invest 100:485-492.
Menezes-de-Lima-Júnior O,
Werneck-Barroso E, Cordeiro RS, Henriques, MGMO.
1997b. Effects of inhibitors of inflammatory mediators and cytokines on
eosinophil and neutrophil accumulation induced by Mycobacterium bovis bacillus
Calmette-Guerin in mouse pleurisy. J. Leukoc. Biol. 62(6): 778-85.
46
Menezes-de-Lima-Júnior
O,
Henriques
MGMO.
1997.
Mechanisms
of
Cell
Accumulation Induced by Mycobacterium bovis BCG. Mem. Inst. Oswaldo Cruz
2(2): 227-32.
Mohammed, K.A., Nasreen, N., Hardwick, J., Van Horn, R.D., Sanders, K.L., Antony,
V.B. 2003. Mycobacteria induces pleural mesothelial permeability by downregulation beta-catenin expression. Lung, 181(2): 57-66.
Montgomery, L.G., Lemon, W. 1933. The cellular reaction of the pleura to infection
withMycobacterium tuberculosis. J Thorac. Cardiovasc. Surg. 2: 429-438.
Montreewasuwat, N., Curtis, J., Turk, J.L. 1987. Interleukin 1 and prostaglandin
production by cells of the mononuclear phagocyte system isolated from
mycobacterial granulomas. Cell Immunol. 104(1): 12-23.
Murakami, N. 1994. Stomachic principles in gengibre. An anti-ulcer principle, 6gingesulfonic acid, and threemonoacyldigalactosyglycerols gengibreglycolipids
A,B and C, from Gengibreis rizoma originating in Taiwan. Chem. Pharm. Bull.
Tokyo. 42(6): 226-30.
Nakamura, Y., Ozaki, T., Kamei, T., Kawaji, K., Banno, K., Miki, S., Fujisawa, K.,
Yasuoka, S., Ogura, T. 1993. Factors that stimulate the proliferation and survival
of eosinophils in eosinophilic pleural effusion: Relationship to granulocytemacrophage colony-stimulating factor, interleukin-5, and interleukin-3. Am. J.
Respir. Cell Mol. Biol. 8: 605-11.
Nourshargh, S. 1993. Mechanisms of neutrophil and eosinophil accumulation in vivo.
Am. Ver. Resp. Dis. 148: S60-S64.
47
Ocaña, I., Martinez-Vasquez, J.M., Ribera, E., Segura, R.M., Pacual, C. 1986.
Adenosine deaminase activity in the diagnosis of lymphocytic pleural effusions of
tuberculous, neoplastic and lymphomatous origins. Tubercle 67: 141-45.
Penna, S.C., Medeiros, M.V., Aimbire, F.S.C., Faria-Neto, H.C.C., Sertié, J.A.A., LopesMartins, R.A.B. 2003. Anti-inflamação effect of the hidroalcólicoextract of Zingiber
officinale rizomas on rat paw and skin edema. Phytomedicine 10: 381-385.
Phillips, S., Ruggier, R., Hutchinson, S.E. 1993. Zingiber officinale(gengibre) –
an
antiemetic for day case surgery. Anaesthesia. 48: 715 - 717.
Sampaio, A.L., Era, G.A., Henriques, M.G. 2000. Participation of endogenous
endothelin in delayed eosinophil and neutrophil recruitment in mouse pleurisy.
Inflamm. Res. 49(4): 170-76.
Sertié, J.A.A., Basile, A.C., Oshiro, T.T., Silva, F.D., Mazella, A.A.G. 1992. Preventive
anti-ulcer activity of the rizoma extract of Gengibre officinale. Fitoterapia. LXIII,
(1): 55 - 59.
Sharma, J.N., Srivastava, K.C., Gan, E.K. 1994. Supressive effects of eugenol and
gengibre oil on arthritic rats. Pharmacology 49(5): 314 -18.
Sharma, S.S., Kochupillai, V., Gupta, S.K., Seth, S.D., Gupta, Y.K. 1997. Antiemetic
efficacy of gengibre (Gengibre officinale) against cisplatin-induced emesis in
dogs. J. Ethnopharmacology 57(2): 93-96.
Shellito, J., Sniezek, M. 1990. Altered release of eicosanoids by rat alveolar
macrophages during granulomatous pulmonary inflammation. Am. J. Respir. Cell
Mol. Biol. 2(3): 289-96.
48
Silva, C.L., Ekizlerian, S.M., Fazioli, R.A. 1985. Role of cord factor in the modulation of
infection caused by Mycobacteria. Am. J. Pathol. 118: 238-47.
Simon SI, Burns AR, Taylor AD, Gopalan PK, Lynam EB, Sklar LA and Smith CW
(1995). L-selectin (CD62L) cross-linking signals neutrophil adhesive functions via
the Mac-1 (CD11b/CD18) β2-integrin. J Immunol 155:1502-1514.
Springer TA (1994). Traffic signals for lymphocyte recirculation and luekocyte
emigration: The multistep paradigm. Cell 76:301-314.
Stead, W. Eichenholz, W., Stauss, H.K. 1955. Operative and pathological findings in
twenty-four patients with syndrome of idiopathic pleurisy with effusion, pesumably
tuberculous. Am. Ver. Tuberc. 71: 473-502.
Tomioka, H., Kishimoto, T., Maw, W.W. 1996. Phospholipids and reactive nitrogen
intermediates collaborate in expression of T cell mitogenesis-inhibitory activity of
immunosupressive macrophages induced by mycobacterial infection. Clin Exp.
Immunol. 103: 219-25.
Vijayan, V.K., Rectha, A.M., Jawahar, M.S., Sankaran, K., Prabhakar, R. 1992.
Pulmonary eosinophilia in Pulmonary tuberculosis. Chest 101: 1708 – 1709.
Williams MA and Solomkin JS (1999). Integrin-mediated signaling in human neutrophil
functioning. J Leukoc Biol 65:725-736.
Yamahara, J., Mochizuki, M., Rong, H.Q., Matsuda, H., Fujimura, H.: The Anti-Ulcer
effect in rats of ginger constituents. J. Ethnopharmacology. 23:299 - 304. 1988.
Yoshikawa M; Yamagashi S, Kumini K; Matsuda H, Okuno Y, Yamashara J, Murakami
N. 1994. Stomachic principles in ginger. An anti-ulcer principle, 6-gingesulfonic
49
acid, and threemonoacyldigalactosyglycerols gingerglycolipids A,B and C, from
Zingiberis rhizome originating in Taiwan. Chem. Pharm. Bull. Tokyo. 42(6): 22630.
Zimmerman GA, Elstad MR, Lorant DE, McIntyre TM, Prescott SM, Topham MK,
Weyrich AS and Whatley RE (1996 b). Platelet-activating factor (PAF) signaling
and adhesion in cell-cell interactions. Adv Exp Med Biol 416:269-304.
50